胰腺导管腺癌(PDA)是西方国家第四大癌症死亡原因( 杰马尔 等 , 2007 ). 它是一种预后不良的疾病,生存率与肿瘤进一步相关,肿瘤局部延伸至胰腺以外,并在区域淋巴结转移( 布图里尼 等 , 2008 ). 这种特殊的转移倾向背后的原因目前尚不清楚。 看来,为了改善临床结果,需要对胰腺癌进展的可能机制有一些了解。
转移过程是一个复杂的机制,其中许多因素可能会影响肿瘤的传播( 墨菲,2001 ). 近年来,趋化因子在肿瘤转移过程中的作用越来越受到人们的关注。 趋化因子及其受体是常规免疫监测、炎症和发育过程中细胞迁移的关键介质( 辛格 等 , 2007 ; 奥海尔 等 , 2008 ). CXCR4是研究得最好的趋化因子受体之一,主要是因为它是HIV进入的共受体,并且能够介导多种癌症的转移( 巴尔克维尔,2004年a ). CXCR4选择性结合CXC趋化因子基质细胞衍生因子1(SDF-1或CXCL12),已发现其在肿瘤发生、增殖、转移和肿瘤血管生成中发挥重要作用( 汉堡和Kipps,2006年 ). CXCR4在23多种实体癌中的表达在上皮性肿瘤细胞表面上调( 巴尔克维尔,2004年b ). 此外,CXCR4阳性肿瘤细胞可以在SDF-1梯度的作用下向远处器官迁移。 随着CXCR4的抑制,某些类型的癌细胞的生长和侵袭可能受到损害( 穆勒 等 , 2001 ; 奥塔亚诺 等 , 2005 ). 据报道,SDF-1/CXCR4在前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肝细胞癌和胰腺癌中的作用( 哈特 等 , 2005 ; 江 等 , 2006 ; 席曼斯基 等 , 2006 ; 吉田县 等 , 2008 ). 据报道,CXCR4在胰腺癌细胞中表达水平较高,可能影响PDA患者的临床结局( 韦勒 等 , 2006 ; 比拉多 等 , 2006 ). 微阵列结果显示,胰腺癌患者的胰液中CXCR4基因的RNA水平增加( 罗杰斯 等 , 2006 ). 最近的证据表明,多种因素可以增强CXCR4的表达,如低氧诱导因子1、血管内皮生长因子、核因子κB活化和肝细胞生长因子( 单身汉 等 , 2002 ; 施塔勒 等 , 2003 ; 赫尔比希 等 , 2003 ; 马特细 等 , 2005 ). 然而,SDF-1/CXCR4对胰腺癌进展的下游调节作用的相关机制尚不清楚。
Wnt公司/ β -catenin典型Wnt-signaling通路与结肠、直肠、乳腺和肝脏等多个部位的肿瘤发生有关( Peifer和Polakis,2000年 ). 其核心部分,即, β -catenin在这个过程中起着关键作用( Nelson和Nusse,2004年 ). 首先, β -当Wnt缺乏或Wnt抑制剂存在时,连环蛋白在Wnt途径的失活阶段被磷酸化。 Wnt因子异常分泌或APC突变可能导致异常 β -连环蛋白激活进而导致Wnt信号的激活和上皮-间充质转化(EMT)过程( 布拉伯茨 等 , 2001 ; Reya和Clevers,2005年 ). Wnt的一些下游靶基因/ β -已经报道了连环蛋白信号,它通过影响细胞生长、细胞周期、细胞存活和侵袭在致癌过程中发挥关键作用( www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html ). APC突变或 β -其他胃肠道肿瘤中常见的连环蛋白在PDA中并不总是能检测到( 亚伯拉罕 等 , 2002 ). Wnt信号的异常激活是人类胰腺癌的一个重要特征,这一点可以通过异常的 β -catenin在相当一部分肿瘤中的表达(30–65%)( 洛伊 等 , 2003 ; Al-Aynati公司 等 , 2004 ; 曾 等 , 2006 ).
基于先前对CXCR4的中心作用和经典Wnt通路的研究,我们假设CXCR4通过Wnt在胰腺癌转移中发挥作用/ β -连环蛋白途径( 王和马,2007 ). 本研究的目的是确定CXCR4在胰腺癌中的作用并阐明其潜在机制。
材料和方法
细胞系和培养条件
人胰腺癌细胞系(PC-2、PC-3、Miapaca-2、Bxpc-3和Panc-1)保存在西安交通大学第一附属医院肝胆外科。 细胞在DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中培养,DMEM补充10%FBS(Invit罗gen,Callsbad −1 )和链霉素(0.1毫克毫升 −1 ).
免疫组织化学
标本来源于西安交通大学第一附属医院肝胆外科48例胰腺癌和8例正常胰腺标本。 根据制造商的说明,使用SABC试剂盒(Maxim,中国福州)对CXCR4进行免疫组织化学染色。 CXCR4(1:50)的一级抗体从eBioscience(美国加利福尼亚州圣地亚哥)获得,并在4°C下培养过夜。 为了评估蛋白质表达,染色强度分为0(阴性)、1(弱)、2(中等)或3(强)。 根据阳性染色面积占肿瘤总面积的百分比,将染色范围分为0(0%)、1(1-10%)、2(11-50%)、3(51-80%)和4(>81%)。 通过乘以染色强度和染色程度获得最终的免疫组织化学染色评分( 狮子座 等 , 2006 ).
CXCR4 shRNA表达载体构建
人类CXCR4基因序列(Genbank登录号。 NM_003467 )根据制造商的协议,使用Genscript(美国新泽西州皮斯卡塔韦)和Ambion(美国德克萨斯州奥斯汀应用生物系统公司)提供的基于网络的siRNA目标查找器和设计工具分析潜在的siRNA靶点。 合成了以下shRNA插入序列:5′-gatccTGAGAAGACGGACAAttcaagagaTTGTCCGTCAT GCTTCTCAttttttggaaa-3′(目标位置:301)和5′-gatccAGCGAGAGACATTCTCtcaagaGAGATGCCACC TCGCTttttggaaa-3′(目标位置:1093)。 作为阴性对照,还设计了一个插入序列为5′-gatccTTCCGAACGTCACGTTcaagagaACGTGACA的载体 CGTTCGGAGAAttttggaaa-3′,不针对人类基因组中的任何区域。 退火正反义寡核苷酸。 消化后 巴姆 HI和 Hin公司 dIII,将片段插入shRNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo(GenScript Corp.,Piscataway,NJ,USA),并通过质粒测序确认。
CXCR4 shRNA表达载体的稳定转染
在24孔板中,5×10 4 转染前1天,细胞每孔电镀一次。 根据制造商的建议,使用脂质体胺2000(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)进行转染。 转染后24小时,细胞溶液以1:10稀释并再生。 在10%DMEM培养基中,400 μ 克毫升 −1 在细胞粘附到平板上后,添加G418(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)进行选择。 在96 well平板中使用有限稀释液进行重复菌落选择。 14天后,G418(200 μ 克毫升 −1 )添加用于未来稳定转染细胞培养。
定量实时聚合酶链反应(QT–PCR)检测mRNA表达
提取总RNA,2×10 5 用Trizol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)采集细胞。 按照制造商的说明,使用SYBR®ExScript™RT–PCR试剂盒(中国大连塔卡拉生物科技有限公司)进行cDNA合成:将500 ng总RNA与2 μ l of 5×ExScript™RTase缓冲区,0.5 μ l dNTP混合物,0.5 μ l随机六聚体,0.25 μ ExScript™Rtase的l和0.25 μ 总体积为10升的核糖核酸酶抑制剂 μ l.反应在42°C下进行12分钟,然后在95°C下使逆转录酶失活2分钟。cDNA存储在−20°C下。 使用SYBR Green Master Mix在ABI PRISM®7300序列检测系统(美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司)上进行QT–PCR。 最终反应体积为25 μ l,含有12.5 μ l 2×SYBR®Premix Ex Taq™,1.0 μ 每层底漆(10 μ M(M) ), 0.5 μ l 50×ROX参考染料,1.0 μ l cDNA。 循环条件如下:在95℃下初始变性10 min,然后在95℃条件下40个循环变性15 s,在60℃条件下60 s。每次测量均进行三次,每次分析均不包括模板对照。 在每个QT–PCR中,进行解离曲线分析。 GAPDH作为内控基因控制。 使用 2 −ΔΔ C类 t吨 方法( Livak和Schmittgen,2001年 ).
细胞增殖试验
细胞以5×10的浓度接种在96个平板中 三 实验前一天。 3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化铵(MTT,0.5 mg ml −1 (美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich)在播种后1、2、3、4、5天添加到每口井中。 通常,细胞在37°C下培养4小时,然后在150 μ 添加了1 DMSO。 在490 nm波长下测量吸收值。
流式细胞术分析
流式细胞仪分析前,1×10 6 收集细胞,用PBS洗涤两次,并用冰镇70%乙醇在4°C下固定24小时。 固定细胞用碘化丙啶染色(贝克曼·库尔特,美国佛罗里达州迈阿密)。 在37°C下培养30 m后,通过流式细胞仪对样品进行分析。 使用MultiCycle软件对DNA直方图进行细胞周期分析。
软琼脂集落形成试验
在六孔板中,每个孔的底层含有1%琼脂糖,中间层含有0.5%琼脂糖(包括7.5×10) 三 细胞和上层培养基。 每六天更换一次顶层培养基。 14天后,用Giemsa溶液(Gibco-BRL,Gaithersburg,MD,USA)对细胞进行染色,并用Quantityone分析软件(BioRad Inc.,Hercules,CA,USA。
蛋白质提取和蛋白质印迹
从1×10中分离出总蛋白 7 200个单元格 μ l含1%Nonide P-40(NP-40)的冰镇裂解缓冲液,50 mmol l −1 Tris(pH 7.4),150毫摩尔升 −1 氯化钠、0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5%脱氧胆酸盐、200 μ 克毫升 −1 苯甲烷磺酰氟(PMSF),和50 μ 克毫升 −1 抑肽酶。 通过在15000下离心除去不溶性材料 克 在4°C下保持15分钟。 用考马斯G-250分光光度法测定提取蛋白的浓度。 澄清蛋白裂解物(30–80 μ g) 在变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶(8-12%)上电泳拆分,并电转移到硝化纤维素膜上。 首先用5%脱脂干乳在Tris缓冲盐水(TBS)中封闭膜2小时,然后用针对特定蛋白质和GAPDH的一级抗体进行检测(作为负荷控制)。 在4°C下与一级抗体共培养过夜后,将膜与次级碱性磷酸酶结合的山羊抗兔抗体(1:2000)、山羊抗鼠抗体(1:3000)(中国上海康城)在室温下杂交2小时。 通过增强化学发光(ECL)检测系统(Amersham Bioscience,Piscataway,NJ,USA)检测免疫阳性带,并将图像转移到X射线胶片上。 如果感兴趣的条带出现在每个标记蛋白对应的预期分子量,则western blot分级为阳性。 所有分析均一式两份。 本研究中使用的抗体:CXCR4(1:200)和MMP-9(1:250)(NeoMarkers,Fremont,CA,USA)、Vimentin(1:200)和GAPDH(1:400)(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cru,CA,US)、P339-CXCR4抗体(1:200。
β -连环蛋白/Tcf转录报告分析
简言之,1×10 5 在用构建的TOPflash或FOPflash报告质粒(Millipore,Billerica,MA,USA)瞬时转染之前,将细胞每孔接种在24孔板中。 TOPflash由胸腺嘧啶激酶(TK)启动子上游的Tcf/Lef位点和萤火虫荧光素酶基因的三个拷贝组成。 FOPflash由三个Tcf/Lef位点的突变拷贝组成,并用作检测报告者非特异性激活的对照。 所有转染均使用0.8 μ g TOPflash或FOPflash质粒和2 μ l脂质体2000。 为了使报告分析中的转染效率正常化,将细胞与0.02进行共转染 μ g内部对照报告质粒,包含由TK启动子驱动的肾形Renilla reniformis荧光素酶。 在TOPflash或FOPflash转染后24小时,使用双荧光素酶检测系统试剂盒(美国威斯康星州麦迪逊市Promega公司)进行荧光素酶检测。 相对荧光素酶活性报告为转染效率归一化后的折叠诱导。
Matrigel侵犯分析
利用Millicell入侵室(Millipore,Billerica,MA,USA)进行入侵检测。 第8个 μ m孔嵌件涂有15层 μ g Matrigel(美国马萨诸塞州贝德福德市Bedton Dickinson实验室)。 含或不含100 ng ml的正常培养基 −1 SDF-1型 α (R&D systems Inc.,Minneapolis,MN,USA)被添加到底室以诱导癌细胞系。 电池(5×10 4 )在顶室播种。 将基质胶侵入室在湿润的组织培养箱中培养20小时。 用棉签从Matrigel顶部去除非侵入细胞。 滤池底面侵入细胞用甲醇固定,Giemsa染色。 通过对染色细胞的计数来确定侵袭能力。
统计分析
所有统计分析均使用SPSS13.0软件进行。 结果显示为三次重复试验的平均值±标准差。 通过学生的 t吨 -方差检验或分析(ANOVA)。 P(P) <0.05被认为具有统计学意义。
结果
CXCR4表达水平与胰腺癌的关系
免疫组织化学染色结果显示,CXCR4在大多数胰腺癌细胞的细胞质中表达,而在正常胰腺细胞中没有表达。 代表性染色结果如所示 图1A 在非转移细胞和转移细胞之间观察到CXCR4的不同表达,在肿瘤淋巴结转移(TNM)分期之间观察到不同的CXCR4表达( P(P) 分别为0.012和0.005)( 表1 ). CXCR4阳性组和CXCR4阴性组的中位生存时间分别为5.5和13.5个月( P(P) <0.05) ( 图1B ). 此外,CXCR4在胰腺癌细胞系中高表达,尤其是Miapaca-2( 图1C ).
图1。
CXCR4在胰腺癌中的表达。 ( A类 )正常胰腺组织CXCR4的免疫组织化学染色( 一 )和胰腺癌组织( b条 —— d日 )×200:阴性表达( 一 ),弱表达式( b条 ),适度表达( c(c) ),强表达( d日 ); ( B类 )Kaplan-Meier曲线显示,CXCR4阳性和CXCR4阴性组的中位生存时间分别为5.5和13.5个月; ( C类 ). Western blot分析显示CXCR4在5种胰腺癌细胞(PC-2、PC-3、Miapaca-2、Bxpc-3、Panc-1)中表达。 GAPDH被用作负荷控制。
表1。 PDA患者CXCR4表达与临床特征的关系。
临床病理变量
CXCR4中位数得分
P(P) -价值
年龄
> 65
5.6
0.542
< 65
4.4
组织学
嗯
3.1
中等
4.9
0.062
可怜的
5.5
淋巴结转移
积极的
6.1
0.012
否定
3
TNM阶段
我
1.7
二
3.8
0.005
三
5.4
四、
7.9
建立稳定的CXCR4击倒
使用shRNA敲除转录物是研究基因功能的有力工具。 研究肿瘤细胞的长期生长模式 在体外 ,我们开发了pRNAT-U6.1/Neo载体,该载体包含能够产生19个核苷酸的双链RNAi寡核苷酸的小发夹构建体。 我们成功获得稳定的shRNA载体转染细胞,称为pRNAT-M1(靶位:301)、pRNAT-M2(靶位;1093)和pRNAT_MN(阴性对照载体)。 QT-PCR分析表明,与pRNAT-MN细胞相比,CXCR4 shRNA-转染细胞系中CXCR4 mRNA的表达被抑制了70%,尤其是在pRNAT-M1细胞中( P(P) <0.05). 与Miapaca-2细胞相比,pRNAT-MN细胞中CXCR4 mRNA表达减少约20%( 图2A ). 此外,与pRNAT-MN细胞相比,pRNAT-M1细胞中CXCR4蛋白水平也显著下调( 图2B ). 值得注意的是,在pRNAT-M1细胞中观察到丝氨酸339处CXCR4磷酸化的降低。 通过带分析,pRNAT-M1细胞中磷酸化CXCR4的比例也降低( 图2C ).
图2。
建立稳定的CXCR4击倒。 ( A类 )不同CXCR4 shRNA表达载体转染后CXCR4表达的QT-PCR分析:pRNAT-M1(靶位301)、pRNAT_M2(靶位1093)、pRNA T-MN(阴性对照)和Miapaca-2, * P(P) 与pRNAT-MN细胞相比<0.05; ( B类 )不同转染胰腺癌细胞的CXCR4抗体免疫印迹。 GAPDH被检测为负荷控制; ( C类 )Western印迹显示CXCR4、丝氨酸339上磷酸化的CXCR4(P339-CXCR4)在转染细胞上的不同表达。 GAPDH被检测为负载控制。
CXCR4的去除抑制细胞增殖,延迟细胞周期并降低克隆形成能力
为了证实CXCR4抑制对细胞生长的影响,培养了稳定的CXCR4 shRNA转染体。 MTT分析显示,pRNAT-M1细胞的生长速度慢于pRNAT-MN细胞。 在接种后的第50天,pRNAT-M1和pRNAT-MN细胞之间出现了不同的生长( P(P) <0.05). 然而,Miapaca-2细胞和pRNAT-MN细胞之间没有差异( P(P) >0.05) ( 图3A ). 根据流式细胞术对细胞周期分布的分析,我们发现从G0期到G1期的进展存在明显的延迟(51.23 与 76.51%),S期下降(41.16 与 23.0%)和G2-M相(1.61 与 0.39%). 此外,在pRNAT-M1细胞中也观察到G1亚凋亡间隔( 图3B ). 探讨CXCR4基因敲除对肿瘤发生的影响 在体外 进行软琼脂集落形成试验。 结果表明,与pRNAT-MN细胞相比,pRNAT-M1细胞的集落形成减少( P(P) <0.05) ( 图3C ).
图3。
CXCR4敲除对细胞表型的影响。 ( A类 )在第1、2、3、4和5天对pRNAT-M1、pRNAT-MN和Miapaca-2进行MTT分析; ( B类 )通过流式细胞术分析pRNAT-M1和pRNAT-MN来证明细胞周期相的分布; ( C类 )采用软琼脂试验评价细胞集落形成能力。 菌落计数如图所示; * P(P) 与pRNAT-MN细胞相比<0.05。
CXCR4敲低抑制Wnt活性、Wnt靶基因和侵袭相关基因
Wnt是胃肠道肿瘤发生的重要途径/ β -catenin通路和与细胞侵袭性相关的基因备受关注。 这个 β -catenin/Tcf转录报告试验被认为是评估Wnt通路活性的重要评估方法。 由于TOPflash有三个TCF结合位点,因此可以应用于表示Wnt途径的激活。 我们的数据表明,与pRNAT-MN细胞相比,CXCR4敲除细胞的TOPflash活性降低( P(P) <0.05)和FOPflash活性不变( 图4A ). 此外,QT-PCR分析表明,pRNAT-M1细胞中的Wnt靶基因如CTNNB1、UPA和CD44受到抑制,但MYC和CCND1的表达没有改变( 图4B ). 同时,抑制CXCR4导致Slug、Vimentin和MMP-9表达降低( P(P) <0.05) ( 图4C ).
图4。
CXCR4基因敲除对Wnt靶基因和侵袭相关基因的影响。 ( A类 ) β -连环蛋白/Tcf转录报告分析。 用对照报告质粒进行标准化,显示出相对荧光素酶活性。 * P(P) 与pRNAT MN细胞相比<0.05; ( B类 )QT–PCR分析以检测CTNNB1( β -catenin)、UPA、SLUG、CD44、MYC(c-MYC)、Vim(Vimentin)、CCND1(cyclin D1)基因表达 −ΔΔ C类 t吨 方法。 * P(P) 与pRNAT-MN细胞相比<0.05; ( C类 )western blot分析检测MMP-9和波形蛋白的表达。 GAPDH被用作负荷控制。
CXCR4基因敲除减少胰腺癌细胞的侵袭
采用Matrigel侵袭试验评估癌细胞的侵袭性。 代表性染色结果显示于 图5A 结果表明,pRNAT-MN细胞比pRNAT-M1细胞更具侵袭性( P(P) <0.05). SDF-1刺激后,pRNAT-MN细胞的侵袭力明显增加( P(P) <0.05),但pRNAT-M1细胞显示出轻微增加( 图5B ).
图5。
CXCR4的废除抑制胰腺癌细胞的侵袭潜能。 × 200; ( A类 )代表性染色图:无SDF-1刺激的pRNAT-MN侵入细胞( 一 ),pRNAT-MN侵入细胞100 ng ml −1 SDF-1刺激( b条 ),pRNAT-M1在无SDF-1刺激的情况下侵入细胞( c(c) ),100 ng ml的pRNAT-M1侵入细胞 −1 SDF-1刺激( d日 ); ( B类 )计数分析图, * P(P) 与pRNAT-MN细胞相比<0.05。
讨论
大多数PDA患者有局部晚期或转移性疾病,因此不适合手术干预( 冬季 等 , 2006 ). 主要原因是胰腺外侵犯和转移到肝、肺或其他组织。 粘附分子、蛋白酶、细胞因子和趋化因子等许多因素都参与了这一过程。 肿瘤微环境中存在一个复杂的趋化因子和趋化因子受体网络。 趋化因子受体CXCR4是典型的靶基因之一( 施拉德尔 等 , 2002 ; 品牌 等 , 2005 ; 索尔 等 , 2005 ; 比拉多 等 , 2006 ). 在本研究中,我们证明CXCR4表达阳性患者的总生存率显著低于CXCR4阴性患者。 CXCR4表达升高与晚期癌症分期和转移相关。 这与以前的报告类似,也表明CXCR4可能是癌症进展的有用标志物( 韦勒 等 , 2006 ; 卡吉亚马 等 , 2008 ).
先前的研究表明,针对CXCR4的siRNA可以抑制乳腺癌的转移 在体外 ( 梁 等 , 2005 ),但CXCR4敲低对胰腺癌的影响尚不清楚。 考虑到CXCR4在癌症进展中的重要作用,我们设计了CXCR4 shRNA载体作为阻断受体/配体相互作用的替代品。 为了避免空载体主干的影响,我们使用pRNAT-MN作为对照细胞,而不是Miapaca-2细胞。 我们的数据表明,质粒能有效抑制CXCR4的表达。 同时,丝氨酸339处CXCR4的磷酸化明显降低,磷酸化CXCR4比例降低。 最近,研究表明,丝氨酸339处CXCR4的磷酸化可能是在细胞上表达CXCR4功能的一种方式( 沃纳 等 , 2005 )因此,我们的数据进一步证实了CXCR4 shRNA转染细胞能够有效抑制胰腺癌中CXCR4的功能。
肿瘤发生是细胞周期紊乱的结果,导致细胞不受控制的增殖和癌症进展。 在本研究中,我们证明,阻断CXCR4不仅可以降低胰腺癌细胞的生长,还可以增加G1以下的凋亡间隔,延长G0-G1周期,减少G2和S期。 同时,它可能会降低锚定植物的独立生长能力。 随着CXCR4基因的敲除,细胞生长、细胞周期和细胞集落形成能力受到抑制,从而有效地阻止了胰腺癌细胞的肿瘤发生。
Wnt信号的解除是某些人类癌症的一个公认特征,例如结直肠癌和黑色素瘤( 伊利亚斯,2005 ). Wnt靶基因的激活将在增殖、侵袭和转移以及血管生成方面促进癌症的发展( 武藤,2006 ; Neth公司 等 , 2007 ). 此外,抑制Wnt信号可以减少胰腺癌细胞的细胞增殖和增加凋亡( 苗族 等 , 2003 ; 帕斯卡·迪马格里亚诺 等 , 2007 ; 纳鲁特 等 , 2007 ). 这里 β -catenin/Tcf实验表明,TOPflash荧光素酶活性明显降低,而FOPflash荧光素酶活性无变化。 此外,Wnt靶基因包括CTNNB1、CD44、UPA和MMP-9的表达显著降低。 因此,我们假设CXCR4敲除细胞中的TCF结合活性可以被有效抑制,这可能会影响Wnt/ β -catenin信号和Wnt靶基因不能被激活。 然而,作为典型的Wnt途径和 β -连环蛋白受多种因素共同调节,仅阻断CXCR4的表达并不能完全抑制Wnt通路。
接下来,我们评估了侵袭相关基因的表达——波形蛋白和Slug的表达。 这两个基因是与EMT过程相关的典型间充质标志物,影响癌转移( 蒂里,2002 ; 盐入 等 , 2006 ). 我们的数据表明,在CXCR4敲除细胞中,波形蛋白和Slug可以下调。 这与对口腔癌的研究一致,该研究表明CXCR4可以影响EMT的形成和癌症的侵袭( 尾上 等 , 2006 ).
在趋化因子和趋化因子受体的相互作用中,SDF-1被证明是CXCR4阳性癌细胞侵袭的刺激因子( 科尔马尔 等 , 2007 ). 确定CXCR4 shRNA对转移的影响是否与胰腺癌有关 在体外 ,我们进行了Matrigel室侵袭试验。 我们的数据显示,在正常条件下,与对照细胞相比,CXCR4转染的癌细胞的侵袭能力受到抑制。 此外,在SDF-1刺激后,在对照细胞和CXCR4敲低细胞之间观察到更多的差异。 然而,我们还发现,由于shRNA对CXCR4有70%的抑制作用,因此不能完全阻断其侵袭能力。
CXCR4是胰腺癌进展的一个有希望的标志物。 CXCR4阳性表达被认为与不良临床结局相关。 此外,CXCR4的废除可通过抑制典型Wnt通路影响胰腺癌细胞表型,包括细胞增殖、集落形成和细胞侵袭。 鉴于CXCR4在胰腺癌进展过程中的重要作用,CXCR4是一个非常有趣的治疗靶点。 了解CXCR4功能的确切机制将有助于了解吸引人的胰腺癌治疗方法。
致谢
我们感谢圣路易斯华盛顿大学医学院的Joshua B Rubin教授慷慨提供磷酸化CXCR4特异性抗体。 我们还感谢王信阳博士、尤元毅博士的技术支持,并感谢徐丽教授、陈伟教授的有益讨论和论文修订。 本研究得到了国家自然科学基金(30700817号)、陕西省科学技术局自然科学基金项目(2006K09-G7号)和西安市科学局自然科学项目(GG06178号)的资助。
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