摘要
脑源性神经营养因子(BDNF)的活性依赖性分泌被认为可以增强突触可塑性,但控制分泌的BDNF的细胞外可用性和清除的机制尚不清楚。 我们发现BDNF以其前体形式(pro-BDNF)分泌,然后在皮层切片的第II/III层θ-突发刺激后,通过附近的星形胶质细胞的快速摄取从细胞外空间清除,这种范式导致突触传递的长期增强。 前BDNF内化通过与泛神经营养素受体p75形成复合物和随后的氯氰菊酯依赖性内吞发生。 在培养的星形胶质细胞中使用荧光标记的前BDNF和实时全内反射荧光显微镜来监测单个内吞小泡对神经递质谷氨酸的反应。 我们发现,内吞的前BDNF被导入一个快速循环途径,用于随后可溶性NSF附着蛋白受体依赖性分泌。 因此,星形胶质细胞包含一个内吞室,能够进行前BDNF循环,这表明神经元和胶质细胞之间存在一种特殊的双向通讯形式。
介绍
脑源性神经营养因子(BDNF)在细胞外间隙的活性依赖性分泌是诱导长期突触修饰的关键步骤( Poo,2001年 ). 已有研究表明,BDNF的作用关键取决于它是否以其前体形式(pro-BDNF)分泌,而前体形式优先与泛神经营养素受体p75(p75)结合 NTR公司 )或以成熟形式激活原肌球蛋白相关激酶B受体(TrkB),因为这些不同受体的激活对突触强度有相反的影响( 卢,2005 ). 此外,组织纤溶酶原激活剂/纤溶酶可以在细胞外空间处理前BDNF( Pang等人,2004年 ),进一步调节神经营养素对突触的修饰。 然而,最近有报道称,前BDNF的处理发生在培养的海马神经元的细胞内,并且神经营养因子仅以成熟形式分泌( 松本等人,2008年 ).
为了提高我们对内源性BDNF细胞外可利用性及其作用终止的机制的理解,我们检测了θ-突发刺激(TBS)后皮质脑片中前BDNF和成熟BDNF的命运, 诱导突触传递和BDNF分泌长期增强的成熟范式( Aicardi等人,2004年 ). 我们提供了令人信服的证据,证明脑源性神经营养因子(BDNF)是TBS后在神经元中新合成的,以其原形式分泌,然后迅速内化于神经元周围的星形胶质细胞,从而限制了神经营养素在神经元-星形胶质细胞接触处的可用性。 内化后,神经营养素可以进行再循环过程,使星形胶质细胞在受到刺激时能够重新凝固神经营养素。
结果和讨论
在大鼠嗅周皮层切片的第II/III层进行现场记录( 图1 A )受到基础(0.033 Hz)或TBS(100 Hz)刺激。 通过ELISA测定收集的灌注培养液中BDNF的分泌( 图1C ). 虽然BDNF水平在基础刺激期间保持不变,但TBS诱导灌流液中BDNF的快速、短暂增加,这与前文所述的场电位突触增强的诱导有关( Aicardi等人,2004年 ). 图1C 显示了在基底部和TBS刺激下,使用特异性抗体在鼻腔周围皮质中出现前BDNF免疫反应的典型例子( 图1 B )对抗神经营养素前区。 在接近( 图1 A ,A1)和远端( 图1 A ,A2)控制中的刺激电极。 TBS后观察到前BDNF免疫反应性显著增加,从刺激电极远端逐渐下降。 这种作用被之前用蛋白质合成抑制剂茴香霉素治疗所阻断(未发表的数据),这与依赖于活性的局部蛋白质合成的前BDNF增加相一致( 坎德尔,2001年 ). 使用针对神经营养素成熟部分的抗体获得了类似的结果,该成熟部分可识别成熟和前BDNF( 图1D ).
图1。
将前BDNF从神经元转移到神经元周围星形胶质细胞。 (A) 切片制备的示意图。 (B) BDNF(混合物)或抗劈裂原-BDNF的Western blot分析( Mowla等人,2001年 )使用α-BDNF或α-pro-BDNF特异性抗体。 (C) 基础(对照)或TBS刺激时的场电位振幅(黑圈)和BDNF水平(灰圈)。 记录后,使用α-pro-BDNF对切片进行免疫染色。 免疫反应性显示在与A的A1和A2区相对应的两个相邻区域。(D)使用α-BDNF进行免疫组织化学。 棒材,100μm。 (E) TBS后20分钟切片中A1的高分辨率共聚焦图像。Pro-BDNF免疫反应显示在星形细胞与神经元接触的部位(方框和插图1)、星形细胞胞体(方框和附图2)和突起(方框和附表3)。 显示具有GFAP免疫反应性的前BDNF染色,并叠加到GFAP信号的3D重建上。 箭头表示前BDNF免疫反应阳性点状物沿星形细胞突起分布。 棒材,20μm。 (F) pro-BDNF/GFAP共定位的时间进程(四片九个细胞)。 (G) 刺激10分钟后,Pro-BDNF/GFAP在对照组星形胶质细胞(三片12细胞)或TBS片(六片24细胞)或无茴香霉素(五片11细胞)、TrkB-Fc(四片九细胞)和纤溶酶(五片二十四细胞)的星形胶质细胞中共定位。 神经核,神经元核。 数据为平均值±SEM(误差线)。*, P≤0.05。
A1区单个神经元的高分辨率共焦分析证实,TBS后前BDNF免疫反应增强( 图1 E 和图S1,可在 http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200806137/DC1 ). 令人惊讶的是,前BDNF也定位于神经元周围星形胶质细胞( 图1 E ). 由于星形胶质细胞缺乏BDNF的mRNA( Ernfors等人,1990年 ; Conner等人,1997年 )这些数据表明,这些细胞在从附近激活的神经元分泌时会摄取前BDNF。 值得注意的是,前BDNF免疫反应在与邻近神经元接触的星形细胞突起中典型地呈点状,而它似乎集中在细胞体中较大的簇中( 图1 E ). 这种免疫反应模式表明,前BDNF在从邻近神经元转移到神经元-胶质细胞接触部位的星形胶质细胞后,在细胞内被贩运。 因此,我们决定遵循TBS后星形胶质细胞内前BDNF分布的时间过程( 图1 F ). 通过测量前BDNF免疫反应性与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(一种星形胶质细胞特异性细胞骨架蛋白)的共定位来测定单个星形胶质细胞中前BDNF-的摄取。 根据前BDNF从神经元转移到星形胶质细胞,在TBS后5分钟,在星形胶质细胞过程的外围首次发现前BDNF与GFAP的共定位。在随后的时间点(10-30分钟),在星形胶质细胞中发现的前BDNF的总量增加, 细胞内分布逐渐从突起转移到胞体。 最后,在3小时后,前BDNF水平在两个隔间恢复到基础水平。
虽然在基础刺激下星形胶质细胞基本上不含前BDNF,但在TBS后10分钟,10–12%的GFAP标记的单个星形胶质细胞表达前BDNF-( 图1 G 和图S1)。 预先用茴香霉素孵育阻止了这种作用,这表明星形胶质细胞中前BDNF的积累需要神经元中的活性依赖性合成,或用TrkB-Fc,一种前体和成熟形式分泌BDNF清除剂( Fayard等人,2005年 ). 引人注目的是,星形细胞对前BDNF的摄取是有选择性的,因为在先前与纤溶酶孵育后,其显著减少( 图1 G 和图S1),一种负责将前BDNF细胞外蛋白水解为成熟蛋白的酶。
我们观察到前BDNF分泌的事实与最近的一项研究相反,该研究认为BDNF可能只以其加工成熟的形式释放( 松本等人,2008年 ). 这种差异可能是因为,在后一项研究中,在长时间(1天)刺激后,在未刺激的海马组织和海马培养物中研究了BDNF的处理,而我们在TBS后几分钟内获得了短暂的前BDNF分泌的证据。大部分这种分泌的前BDNF是新合成的, 鉴于向星形胶质细胞的快速转移,可能来自局部翻译的BDNF mRNA。有趣的是,另一项最近的研究表明,BDNF的mRNA存在于两种剪接变体中,其中一种选择性地转移到海马神经元的树突, 来自该转录物的BDNF是突触和形态修饰所必需的( An等人,2008年 ). 考虑到树突中可能没有处理神经营养素的机制,局部合成可能确实有利于分泌前BDNF。
接下来我们研究了星形胶质细胞是否通过受体介导的内化作用摄取前BDNF。 我们观察到星形胶质细胞内与p75共定位的前BDNF免疫反应性 NTR公司 TBS后10分钟。pro-BDNF簇–p75 NTR公司 在与附近神经元和星形细胞突起接触的部位发现,这种模式提示p75 NTR公司 -前BDNF的介导内化( 图2 A ). 因此,在p75切片中 NTR公司 敲除小鼠(p75 NTR−/− ; Naumann等人,2002年 )与野生型小鼠切片不同(p75 NTR公司 +/+ ),前BDNF未在星形胶质细胞中积聚( 图2 B 和图S2,网址为 http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200806137/DC1 ). 然而,用激酶抑制剂K252a阻止TrkB内化并不影响GFAP/pro-BDNF共定位( 图2 C )这与星形胶质细胞不表达全长形式的TrkB的概念一致( Rose等人,2003年 ). 因为切片中获得的数据不排除截断的TrkB(TrkB-t)形式参与BDNF内吞( 卢比奥,1997年 )缺乏催化域( Klein等人,1990年 ),实验扩展到皮层星形胶质细胞的原代培养。 表面生物素化实验表明,除了p75 NTR公司 ,培养的星形胶质细胞表达TrkB-t,但不表达全长TrkB( 图2 D ). 然而,星形胶质细胞暴露于BDNF后,前体和成熟亚型的混合物(混合物; 图1 B ),只有p75的膜表达 NTR公司 但TrkB-t没有减少。 因此,血浆中p75水平的相同裂解物 NTR公司 被含有大量BDNF蛋白的BDNF(混合物)还原。 总之,这些数据表明前BDNF摄取主要发生在p75 NTR公司 ,这与前BDNF优先与该受体结合的概念一致( Teng等人,2005年 ).
图2。
第75页 NTR公司 –网格蛋白介导星形胶质细胞中前BDNF的内化。 (A) GFAP、pro-BDNF和p75之间的Colocalization NTR公司 切片暴露于TBS后10分钟,星形胶质细胞中的氯氰菊酯或EEA1免疫反应。星形胶质细胞与神经元接触的部位(方框和插图1)和星形胶质细胞突起(方框和附图2)显示出结肠化信号。 棒材,10μm。 (B) Pro-BDNF/GFAP在p75的对照组(5片22细胞)或TBS片(5片18细胞)星形胶质细胞中的共定位 NTR公司+/+ 和p75 NTR−/− 老鼠。 (C) 在没有K252a(四片九细胞)、MDC(三片十一细胞)或D15(三片十一月细胞)的对照组(六片九细胞组)或TBS片(四片十二细胞组)的星形胶质细胞中,Pro-BDNF/GFAP共定位。 (D) 蛋白质印迹显示p75的表面表达 NTR公司 来自对照星形胶质细胞或暴露于BDNF的星形胶质细胞的TrkB、TrkB或TrkB-t(混合物)。 显示培养神经元中TrkB和TrkB-t的表达以进行比较。 右侧面板显示了星形胶质细胞中BDNF浓度的ELISA测量。 数据为平均值±SEM(误差线)。*, P≤0.05。
进一步研究pro-BDNF–p75的分子机制 NTR公司 -通过介导内化,我们检测了内吞原-BDNF是否与网格蛋白共定位( Bronfman等人,2003年 ). 我们发现,TBS后,氯氰菊酯免疫反应与前BDNF免疫反应共定位( 图2 A ). 这种作用被之前使用克拉苏林抑制剂单丹磺酰卡达韦(MDC)或动态蛋白阻滞剂D15治疗所阻断( 图2 C 和图S2; 威格和麦克马洪,1998年 ). 同样,我们观察到前BDNF与早期内胚标记物EEA1共定位( 图2 A ). 总的来说,这些数据提供了证据表明,星形胶质细胞通过p75摄取内源性前BDNF NTR公司 -氯氰菊酯介导的内化作用。
为了进一步了解星形胶质细胞中前BDNF摄取的可能调节,全内反射荧光(TIRF)显微镜( 汤普森和斯蒂尔,2007年 )用于实时可视化单个内吞囊泡的形成( 图3 A 和视频1,可在 http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200806137/DC1 ). 培养的星形胶质细胞转染p75 NTR公司 用GFP(p75-GFP)标记,用于对位于质膜内或附近的p75-GFP进行消逝光激发。 使用与10 nM量子点(QD;图S3)形成的前BDNF免疫复合物实时成像前BDNF-与p75-GFP的结合。 一旦在表达p75-GFP的星形胶质细胞的质膜附近发现前BDNF-QD,几秒钟内,p75-GFF荧光就会集中在QD的位置,这可能反映了内吞小泡的形成和前BDNF-QD的内化。 共焦显微镜( 图3 B )结果表明,在非允许温度(冰凉)下,前BDNF-QDs的内化被抑制,并通过将温度升高至37°C 10–20分钟恢复。QD的摄取也取决于p75的水平 NTR公司 表达:尽管过度表达p75-GFP的星形胶质细胞表现出较高的QD内化水平,但转染质膜连接GFP(Lck-GFP)的星形胶质胶质细胞中的QD明显较少,后者仅依赖内源性p75 NTR公司 用于内部化( 图3、B和D ). 同样,在p75制备的星形胶质细胞中,QD摄取几乎被消除 NTR−/− 老鼠( 图3 C ). 此外,QD内化需要事先与前BDNF偶联,因为当α–前BDNF-抗体从免疫复合物中被省略以进行控制时,它就停止了( 图3 B ). 最后,内化的QD与氯氰菊酯和EEA1共定位(图S3),在原代培养中证实了刺激切片中显示的前BDNF内吞机制。
图3。
pro-BDNF的内部化–p75 NTR公司 培养星形胶质细胞中的复合物。 (A) TIRF成像显示培养星形胶质细胞中前BDNF–QD–p75-GFP内化的时间序列。 白色箭头表示前BDNF-QD(红色)与转染p75-GFP的星形胶质细胞膜非常接近(绿色)。 黄色箭头指向参考QD。 插图描述了集中在QD位置的p75-GFP荧光。 棒材,5μm。 (B) 用p75 GFP(9个细胞)或Lck GFP(6个细胞)转染的星形胶质细胞中的前BDNF–QD内化。 (C) p75星形胶质细胞中Pro-BDNF–QD内化 NTR公司+/+ (22个细胞)和p75 NTR−/− (11个细胞)小鼠。 (D) 免疫细胞化学显示QD(蓝色)和p75之间的共定位(箭头) NTR公司 (红色)转染p75-GFP或Lck-GFP(绿色)的星形胶质细胞。 棒材,2μm。 数据为平均值±SEM(误差线)。*, P≤0.05。
内化pro-BDNF的命运是什么? 内吞囊泡的分类被认为导致囊泡再循环或囊泡进入降解途径( Maxfield和McGraw,2004年 ; Soldati和Schliwa,2006年 ). 这促使我们研究内化的前BDNF是否最终可以被回收用于调节分泌。 为此,用标记有YFP(BDNF-YFP混合物; 图4 A ). 内化的BDNF-YFP在培养的星形胶质细胞的细胞周围呈点状分布( 图4 B ). 使用免疫金标记的BDNF-YFP(BDNF-YFP金;图S3)通过预埋实验进行的超微结构表征揭示了囊泡结构内的金颗粒(平均直径,125±22nm; n个 = 32; 图4C ). 接下来,通过利用BDNF-YFP的pH敏感性来评估含有内化BDNF-YFP的囊泡是否最终用于再循环。 通过TIRF成像,YFP在酸性隔室中荧光猝灭,然后不影响BDNF-YFP分泌到细胞外介质中,显示荧光闪烁( Santi等人,2006年 ). 短暂暴露于BDNF-YFP(混合物)(1–5分钟)使星形胶质细胞负载后,在质膜附近出现荧光小泡( 图4 D 和视频2,网址为 http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200806137/DC1 ). 谷氨酸刺激星形胶质细胞引发持续数百毫秒的闪光。 只有当荧光增强、扩散并随后下降时,闪光才被视为胞外事件。 定量分析表明,谷氨酸诱导了约10倍的细胞外事件增加(73±12平均闪光/星形胶质细胞±SD; n个 =18)相对于对照浴溶液(6±3平均闪光/星形胶质细胞±SD; n个 = 6; 图4 E ). 大多数融合事件发生在谷氨酸应用的前10秒。 由于外源性BDNF-YFP给药后,TIRF可快速观察到再循环,因此含有BDNF-YFP的内吞小泡可能会直接进入胞外过程。 因此,在进入分泌途径之前,内吞小泡可能是内吞BDNF-YFP的主要储存室。
图4。
星形胶质细胞再循环内吞原-BDNF以调节分泌。 (A) 使用α-BDNF或α-pro-BDNF抗体对BDNF-YFP(混合物)进行Western blot分析。 (B) 未经治疗的星形胶质细胞的免疫细胞化学( n个 =12)或与BDNF-YFP(混合; n个 =18),然后进行酸剥离。 棒材,10μm。 (C) 星形胶质细胞暴露于BDNF-YFP金10分钟后的超微结构特征。箭头指向囊泡细胞器中的金颗粒。 条形,500 nm。 (D) 用BDNF-YFP孵育5分钟的星形胶质细胞的代表性TIRF图像。顶部序列描绘了谷氨酸灌注前后选定星形胶质细胞区域(白色矩形)中的胞外融合(箭头)。 底部序列显示单个囊泡融合。 荧光强度在以囊泡为中心的圆形掩模和圆周上的同心环中测量。 棒材,2μm。 (E) 谷氨酸应用后融合事件(闪光)的时间分布。 插图显示了之前每个星形胶质细胞的闪光总数( n个 =17)及之后( n个 =13)谷氨酸。 (F) ELISA定量检测星形胶质细胞BDNF分泌( n个 =18)及之后( n个 =22)施加谷氨酸5分钟。在没有谷氨酸的情况下,用谷氨酸刺激之前暴露于BDNF(混合物)10分钟的星形胶质细胞( n个 =14)或存在( n个 =TeNT的4)。 (G) 无AMPA或t-ACPD诱导BDNF分泌( n个 =23)或存在( n个 =17)各拮抗剂CNQX或AIDA和50 Hz( n个 = 6). 数据为平均值±SEM(误差线)。*, P≤0.05。
最后,通过ELISA测量从培养的星形胶质细胞或暴露于BDNF(混合物)10分钟并彻底清洗的星形细胞上清液中收集的BDNF来确定神经营养素的再循环( 图4 F ). 尽管谷氨酸刺激5分钟不会导致对照细胞内源性BDNF分泌,但同样的刺激增加了BDNF预孵育细胞中的神经营养素分泌。 通宵中毒40 nM破伤风神经毒素(TeNT)可显著降低神经营养素的释放,TeNT是一种已知的蛋白酶,可裂解SNARE蛋白囊泡相关膜蛋白2(Vamp2)/synaptobrevin2( Montana等人,2006年 )与星形胶质细胞神经递质的调节释放有关( Bezzi等人,2004年 ). 谷氨酸的作用由50μM AMPA或100μM t-ACPD模拟,它们分别激活AMPA或代谢性Ⅰ/Ⅱ组谷氨酸受体( 图4 G ). AMPA拮抗剂CNQX或代谢型I组受体拮抗剂AIDA可显著降低AMPA或t-ACPD诱导的BDNF分泌。 高频(50 Hz)电刺激,已知可触发培养神经元中BDNF的分泌( Balkowiec和Katz,2000年 ),无效( 图4 G )表明星形胶质细胞BDNF分泌不能直接受活性调节。
内吞原-BDNF是如何循环用于胞吐的? 使内吞小泡可用于分泌的一个潜在机制涉及到细胞外融合的分子机制。 已知星形胶质细胞表达核心SNARE复合体的成分,包括Vamp2( Montana等人,2006年 ). TBS后10分钟,在切片中的星形胶质细胞中检测到前BDNF与Vamp2的集落化( 图5 A )或在转染p75-GFP并暴露于前BDNF-QDs的培养星形胶质细胞中( 图5 B ). 对包裹α-p75的磁珠纯化的内吞囊泡进行Western blot分析,证实Vamp2在含BDNF的囊泡上的表达 NTR公司 抗体( 图5 C ). 相反,使用涂有α-Vamp2抗体的珠纯化的内吞囊泡对p75具有免疫反应性 NTR公司 有趣的是,BDNF(混合)治疗10分钟可促进表达Vamp2和p75的囊泡的恢复 NTR公司 用涂有抗神经元标记物微管相关蛋白2(Map2)抗体的珠作为对照。 这些数据表明,胞内囊泡表达p75 NTR公司 可能是进入分泌途径前内吞pro-BDNF的主要储存室。 该过程可以通过回收pro-BDNF–p75来进行 NTR公司 配合物表面或在其与p75分离后通过前BDNF再循环 NTR公司 此外,考虑到TeNT阻止BDNF分泌( 图4F )所有这些数据表明,星形胶质细胞内吞后,含有神经营养素的囊泡可能通过SNARE依赖机制进行调节性再循环。
图5。
含有前BDNF–p75的囊泡 NTR公司 表达SNARE核心复合物的Vamp2组分用于囊泡融合。 (A) TBS后10分钟,星形胶质细胞中GFAP、前BDNF和Vamp2免疫反应性之间的结肠化。结肠化信号(箭头)显示在星形胶质细胞与神经元接触的部位(方框和插图1)和星形胶质细胞突起(方框和附图2)。 棒材,20μm。 (B) 免疫细胞化学显示转染p75-GFP的星形胶质细胞中,前BDNF-QDs和Vamp2共定位。 右侧面板显示了选定星形细胞区域(方框区域)中的QD/Vamp2共定位(箭头)。 棒材,2μm。 (C) 蛋白印迹显示p75 NTR公司 α-p75包被磁珠免疫纯化(IP)的内吞囊泡中Vamp2的表达 NTR公司 来自未经处理或经BDNF(混合物)处理的星形胶质细胞的α-Vamp2或α-Map2。
我们的总体研究结果表明,星形胶质细胞在清除神经元活动分泌的前BDNF和随后内吞性神经营养素的再循环中发挥重要作用,从而调节其空间和时间可用性。 在这方面,星形胶质细胞介导的BDNF清除和再循环与星形胶质细胞清除突触间隙的神经递质有一些相似之处。 因此,这些细胞回收BDNF可能有助于神经胶质细胞调节突触可塑性( 海登,2001 ; Fields和Stevens-Graham,2002年 ; 艾伦和巴雷斯,2005年 ; Haydon和Carmignoto,2006年 ).
材料和方法
电生理学
按照之前的报告进行切片准备和记录( Aicardi等人,2004年 ). 用50μM茴香霉素、1μg/ml TrkB-Fc(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)、200 nM K252a、50μM MDC和20μM D15预培养切片20分钟或100 nM纤溶酶2小时,并在整个记录过程中通过再循环系统保持。
免疫组织化学和免疫细胞化学
使用鸡α-前-BDNF(Millipore)、鸡α-BDNF(Promega)、兔或小鼠α-GFAP(Sigma-Aldrich)、小鼠α-神经元核(Millipore)、山羊α-p75进行常规实验 NTR公司 (R&D Systems)、兔α-EEA1(Abcam)、兔甲氰菊酯(Abcam)、小鼠α-Vamp2(Synaptic Systems)和小鼠(Invitrogen)或鸡α-GFP(Aves Laboratory)初级抗体。 使用配备有氪-氩和红色二极管激光器以及20×/0.75、60×/1.40和100×/1.40油物镜(尼康)的共焦激光扫描显微镜(Radiance 2000;Bio-Rad Laboratories)评估免疫反应性。 使用运行在Indigo工作站(Silicon Graphics)上的ImageSpace软件(分子动力学)执行图像处理和体积渲染。
蛋白质印迹
样品使用鸡α-BDNF(R&D系统)、兔和鸡α-pro-BDNF、小鼠α-TrkB(BD生物科学)、兔α-p75进行常规实验 NTR公司 (Abcam)、小鼠α-Vamp2(Synaptic Systems)和小鼠α-Map2(瑞士巴塞尔弗里德里希·米歇研究所a.Matus赠送)主要抗体。
细胞培养
从出生后第1-2天的Wistar大鼠和p75制备皮质星形胶质细胞的原代培养物 NTR公司+/+ 或p75 NTR−/− 小鼠(由Y.-A.Barde提供,Biozentrum,University of Basel,Basel,Switzerland),如前所述( 麦卡锡和德维利斯,1980年 ).
BDNF免疫复合物的表征
临BDNF–QD。
用α-兔抗体(Invitrogen)固定的QD-565表面被动结合兔α-pro-BDNF(Millipore)。 制造商表示,单个QD-565具有与<10个抗体分子生物结合的潜力; 因此,通过将量子点和α-前BDNF之间的混合化学计量调节到1:10的浓度来设定所需的免疫偶联程度。 在37°C的中性缓冲液中培养10分钟。 通过将QD/α–pro-BDNF混合物与100 ng/ml BDNF(混合物)孵育,在第二步中获得最终免疫复合物,我们显示( 图1 B )包含前体和成熟形式的BDNF。 免疫细胞化学证实了前BDNF-QD免疫复合物的正确形成(图S3)。 测定了pro-BDNF–QD荧光的强度分布(图S3),并将其与单个QD进行了比较,作为参考。 虽然单个pro-BDNF-QD显示出高荧光波动(闪烁),但pro-BDNF–QD簇产生的亮度变化较大,但闪烁较低。 共聚焦成像显示,10 nM pro-BDNF–QD足以显示单个圆点内化到转染p75-GFP或Lck-GFP的培养星形胶质细胞中(由德国纽赫堡Helmholtz Zentrum Muenchen的H.Lickert提供; 图3 B ). 较高浓度(20–500 nM)增加了细胞间隙处的QD聚集,QD修饰了细胞表面,但内部化严重受损。
BDNF-YFP黄金。
免疫复合物通过两步偶联程序制备,其中BDNF-YFP(混合物;由德国马丁斯里德马克斯普朗克神经生物学研究所O.Griesbeck提供)首先与α-GFP偶联10分钟,并与二级抗体偶联5纳米金颗粒。
电子显微镜
在预埋实验中,培养的星形胶质细胞用BDNF-YFP金处理10分钟,在4°C的2.5%戊二醛(0.1M磷酸盐缓冲液)中固定30分钟,然后在1%OsO中固定 4 在室温下保持60分钟。 脱水后,将样品包埋在epon 812中,并用乙酸铀酰-柠檬酸铅进行复染。 切片用电子显微镜检查(EM 109;卡尔蔡司公司)。 这些图像是用一个电荷耦合设备摄像头(DMX 1200F;尼康)拍摄的。 使用Image Pro+软件(Media Control,Inc.)收集并分析数字图像。 对至少200张显微照片进行了分析,揭示了含有金颗粒的细胞内结构。 参照校准的乳胶珠测量囊泡直径。
灌注设置和释放实验的特点
如前所述进行释放试验( Canossa等人,1997年 ). 通过在5分钟内添加50和500μM谷氨酸、50μM AMPA和100μM t-ACPD获得刺激。 在灌注开始前30分钟开始使用特异性受体拮抗剂(50μM CNQX和500μM AIDA)治疗,并在整个收集期内保持。 TeNT中毒在灌注开始前12小时开始,在整个收集期内未维持。 如前所述进行高频刺激( Santi等人,2006年 ). 通过双位点ELISA测定每个组分中BDNF的含量( Canossa等人,1997年 ).
囊泡免疫净化
如前所述进行净化( Santi等人,2006年 ). 用涂有小鼠α-p75的α-小鼠Dynabeads(M-280)从核后上清液中免疫分离囊泡 NTR公司 (Sigma-Aldrich)、小鼠α-Vamp2(Synaptic Systems)或小鼠α-Map2(a.Matus馈赠)抗体。
在线补充材料
图S1和S2显示在不存在或存在樟柳霉素、TrkB-Fc、纤溶酶和MDC的情况下,或在p75中,来自对照或TBS切片的单个星形胶质细胞中的前BDNF内化 NTR公司+/+ 和p75 NTR−/− 老鼠。 图S3显示了(a)原-BDNF–QD和BDNF-YFP金免疫复合物的示意图,以及(b)原-BDNF–QDs与表达p75-GFP的培养星形胶质细胞中的网格蛋白或EEA1之间的共定位。 视频1显示了通过TIRF成像获得的表达p75-GFP的培养星形胶质细胞内吞pro-BDNF-QD的实时可视化。 视频2显示了通过TIRF显微镜分析的含BDNF-YFP囊泡的胞外融合。 在线补充材料可在 http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200806137/DC1 .
致谢
我们感谢H.Thoenen和M.Schliwa对手稿的评论。
这项工作得到了国立理工大学Ricerca Programmi di Ricerca di Rilevante Interesse Nazionale部、Ricerca Fondamentale Orientata基金会(授予M.Canossa)、欧盟Synapse(授予M.Matteoli)和德国Forschungsgemeinschaft(授予R.Blum)的支持。
M.Bergami和S.Santi对本文的贡献相同。
本文中使用的缩写:BDNF,脑源性神经营养因子; 胶质纤维酸性蛋白; 微管相关蛋白2; MDC,单丹酰卡达韦; 量子点; TBS,θ-突发刺激; 破伤风神经毒素; TIRF,全内反射荧光; 原肌球蛋白相关激酶B受体TrkB; TrkB-t,截断的TrkB; Vamp2,囊泡相关膜蛋白2。
工具书类
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