摘要
类Toll受体(TLR)识别微生物病原体并触发先天免疫反应。 在TLR家族成员中,TLR7、TLR8和TLR9在浆细胞样树突状细胞(pDC)中诱导干扰素(IFN)-α。 这种诱导需要形成由适配器MyD88、肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子6(TRAF6)和干扰素调节因子(IRF)7组成的复合物。 在这里,我们展示了IL-1受体相关激酶(IRAK)-1在TLR7-和TLR9-介导的IRF7信号通路中的重要作用。 IRAK-1在体外直接结合并磷酸化IRF7。 IRAK-1的激酶活性是IRF7转录激活所必需的。 年,TLR7-和TLR9-介导的IFN-α的产生被废除 伊拉克 - 1 –缺陷小鼠,而炎症细胞因子的产生没有受损。 尽管NF-κB和有丝分裂原活化蛋白激酶正常激活,IRF7在 伊拉克-1 –缺乏pDC。 这些结果表明IRAK-1是pDC中TLR7-和TLR9-介导的IFN-α诱导的特异性调节因子。
类Toll受体(TLR)在哺乳动物先天免疫反应中起着关键作用( 1 , 2 ). 到目前为止,已经确定了TLR家族(TLR1–11)的11个成员( 三 ). 在这些成员中,TLR7、TLR8和TLR9具有密切相关的分子结构,并通过识别核酸配体发挥类似的免疫反应( 4 ). TLR7和TLR8识别单链(ss)RNA和咪唑啉,TLR9识别CpG寡核苷酸(CpG ODN)以及某些微生物DNA( 5 – 10 ). 在配体结合后,TLR7和TLR9招募一个Toll–IL-1受体(TIR)域包含适配器MyD88。 然后,MyD88通过其死亡域之间的亲同性相互作用与IL-1受体相关激酶(IRAK)家族成员相关联。 TNF受体相关因子6(TRAF6)也被招募,NF-κB和有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)最终被激活。 这些事件导致炎症细胞因子的诱导,如TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-12( 三 ). 这是TLR信号的一种常见途径,称为MyD88依赖性途径( 2 ).
有四个IRAK家族成员,包括IRAK-1、IRAK-2、IRAK-M和IRAK-4( 11 – 14 ). 其中,只有IRAK-1和IRAK-4具有内在的丝氨酸/苏氨酸激酶活性( 15 ). 据报道,IRAK-1是一种在体外严重参与IL-1R信号传导的激酶( 16 , 17 ). IL-1介导的IL-6生成以及MAPK和NF-κB的激活在 伊拉克-1
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− 胚胎成纤维细胞(EFs;14,18)。 然而,巨噬细胞来自 伊拉克-1
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− 小鼠对TLR配体的反应仅表现出细胞因子产生和NF-κB活化的部分损伤( 19 ). 相反, 伊拉克-4
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− 小鼠对IL-1、IL-18或各种TLR配体的反应出现严重损伤( 20 ). 这种表型与 Myd88(Myd88)
−
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− 老鼠。 因此,IRAK-4被认为对MyD88依赖性途径至关重要。 体外实验表明IRAK-1被磷酸化并被IRAK-4激活( 12 , 20 ). 然而,IRAK-1和IRAK-4之间的关系以及IRAK在各种信号传导事件中对激酶活性的要求仍不清楚( 21 , 22 ).
除了产生炎性细胞因子外,TLR7、TLR8和TLR9的配体刺激还可以在一种特殊的树突状细胞亚群pDCs中诱导IFN-α( 8 , 9 , 23 , 24 ). 这种独特的树突状细胞亚群以其在病毒感染时产生大量I型干扰素的能力而闻名( 25 – 27 ). 干扰素-α诱导对这些TLR配体的反应在 我的D88
−
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− pDC( 24 )表明TLR7、TLR8和TLR9具有独特的机制,以MyD88依赖的方式激活pDC中编码IFN-α的基因。 我们最近的研究表明,TLR7-和TLR9-介导的IFN-α诱导需要形成由MyD88、TRAF6和IRF7组成的复合物( 28 ). 复合物中激活的IRF7转位到细胞核,并诱导I型干扰素基因的转录。 最近,Honda等人报道,TLR7和TLR9配体产生的IFN-α在来源于 伊拉克-4
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− 老鼠( 29 ). 尽管IRAK-1被认为在MyD88的下游发挥作用,但IRAK-1在TLR7和TLR9介导的IFN-α产生中的作用仍有待观察。
在这里,我们检测了IRAK-1在TLR7-和TLR9-介导的信号通路中的作用。 IRAK-1在体外与IRF7相关并磷酸化,表明IRAK-1也参与了由MyD88和TRAF6组成的复合物。 在中观察到对TLR7和TLR9配体的应答导致IFN-α的产生严重受损 伊拉克-1
−
/Y(Y) 老鼠。 另一方面,TLR7和TLR9配体产生的炎性细胞因子没有受到影响。 IRF7未能在TLR9配体的作用下转位到细胞核 伊拉克-1
−
/Y(Y) pDC,表明IRAK-1是激活IRF7的先决条件。 总之,IRAK-1是一种分子,特别参与TLR7和TLR9配体诱导IFN-α。
结果
IRAK-1与IRF7关联
在之前的研究中,我们发现IRF7与MyD88和TRAF6形成复合物以诱导IFN-α( 28 ). 由于IRAK-1和IRAK-4与MyD88相关,我们研究了IRAK-1与IRAK-4是否参与IRF7复合物。 我们首先通过共免疫沉淀实验分析了IRF7与IRAK-1或IRAK-4的相互作用。 当用编码FLAG标记的IRF7和Myc-tagged IRAK-1或IRAK-4的质粒瞬时转染人类胚胎肾(HEK)293细胞时,FLAG–IRF7与表达Myc–IRAK-1而非Myc–IRAK-4的细胞中的抗Myc共沉淀( 图1 A) ●●●●。 这表明IRAK-1而非IRAK-4与IRF7相互作用。 我们进一步分析了IRAKs和IRF7在活细胞中的物理相互作用。 我们用标记IRF7的黄色荧光蛋白(YFP)和标记IRAK-1或标记IRAK-4的青色荧光蛋白(CFP)转染HEK293细胞,然后通过反向荧光显微镜观察。 与IRAK-4–CFP共表达时,IRF7–YFP在细胞质中广泛表达。 相反,当与IRAK-1–CFP共表达时,IRF7–YFP在细胞质中以浓缩形式表达,IRAK-1-YFP位于细胞质中( 图1 B) ●●●●。 当我们分析这些细胞的IRF7-YFP和IRAK-1–CFP或IRAK-4–CFP之间的物理相互作用时,我们在与IRAK-1合并但未与IRAK-4合并的区域检测到来自IRF7的强荧光共振能量转移(FRET)信号( 图1 B) ●●●●。 当我们用IRF7-CFP和IRAK-1–YFP转染细胞时,我们还发现了相同的共定位和物理相互作用(未公布的数据)。 我们通过流式细胞术测量FRET进一步证实了这一观察结果( 28 ). 当用IRF7–YFP和IRAK-1–CFP或IRAK-4–CFP转染HEK293细胞时,只有用IRAK-1表达IRF7但不表达IRAK-4的细胞显示出强烈的FRET信号,这表明IRF7与IRAK-1直接相互作用,但在活细胞的细胞质中不与IRAK-4相互作用( 图1 B) ●●●●。 反过来,当细胞被引入IRF7–CFP和IRAK-1–YFP时,也获得了类似的结果(未公布的数据)。
图1。
IRAK-1而不是IRAK-4与IRF7相关。 (A) 将FLAG–IRF7与Myc–IRAK–1或Myc-IRAK-4瞬时转染HEK293细胞。 细胞裂解物用抗Myc或抗FLAG进行免疫沉淀(IP),然后用抗FLAG或抗Myc进行免疫印迹(IB)分析,如图所示。 缓慢迁移的FLAG–IRF7形式以星号显示。 (B,顶部)用IRF7-YFP(黄色)和IRAK-1–CFP或IRAK-4–CFP(蓝色)转染HEK293细胞,并通过FRET(假彩色)观察这两个分子的物理相互作用。 (B,底部)用IRF7-YFP、IRAK-1-CFP或IRAK-4-CFP转染HEK293细胞。 (左)单细胞CFP激发的CFP发射荧光强度(水平轴)和单细胞CFP激发的YFP发射荧光强度。 通过CFP激发,YFP和CFP均阳性的细胞在门控区显示为FRET。 (右)IRAK-1–CFP或IRAK-4–CFP和IRF7–YFP的计算FRET。 (C) 如图所示,从瞬时转染FLAG–IRF7缺失突变体和Myc–IRAK-1组合的HEK293细胞制备的细胞裂解物用抗Myc或抗FLAG进行免疫沉淀,然后用抗FLAG或抗Myc进行免疫印迹分析。
接下来,我们研究了IRF7的哪一部分负责与IRAK-1的相互作用。 将Myc–IRAK-1与FLAG–IRF7或编码氨基酸1–285或1–237的FLAG–IR F7缺失突变体瞬时转染HEK293细胞。 HEK293细胞中表达的FLAG–IRF7和FLAG–IRF7 1–285与抗Myc共沉淀,表明IRF7的238和285氨基酸之间的区域是与IRAK-1相互作用所必需的( 图1 C) ●●●●。 先前显示IRF7的这一部分是与MyD88和TRAF6相互作用所必需的,这表明IRAK-1通过与这一部分的相互作用参与了复合体( 28 ).
IRAK-1激酶活性
IRF7已被证明在病毒感染期间通过磷酸化COOH末端丝氨酸残基而被激活,并转位到细胞核中调节靶基因的表达,包括IFN-α( 30 ). 因此,我们检测了IRAK-1的激酶活性是否对IRF7的激活是必要的。 用FlAG–IRF7和IRAK-1的Myc–IRAK-1或Myc–激酶阴性(KN)突变体转染HEK293细胞。 然后在表达IRAK-1和IRAK-1 KN的细胞中与抗Myc共沉淀FLAG–IRF7( 图2 A) ●●●●。 我们在表达Myc–IRAK-1的细胞中检测到缓慢迁移形式的FLAG–IRF7,但在与IRAK-1 KN共存的细胞中没有检测到,这表明IRAK-1通过其激酶活性诱导IRF7磷酸化( 图2 A) ●●●●。 为了确定IRAK-1是否可以磷酸化IRF7的COOH末端,我们使用细菌表达的GST-IRF7作为底物进行体外激酶分析。 IRAK-1、IRAK-1 KN、IRAK-4和IRAK-4 KN在HEK293细胞中表达,细胞裂解物用抗FlAG免疫沉淀。 在IRAK-1的免疫沉淀物中发现GST–IRF7的磷酸化,但在IRAK-4中未发现( 图2 B) ●●●●。 这些数据表明,IRAK-1在体外磷酸化IRF7,而不是IRAK-4。 接下来我们测试了IRAK-1的激酶活性是否对IRF7的转录活性是必要的。 在之前的工作中,我们通过共表达IRF7和MyD88显示了IFN-α启动子的协同激活( 28 ). 然而,IRAK-1或IRAK-4与IRF7的过度表达均未导致HEK293细胞中IFN-α启动子的协同激活(未发表数据)。 因此,我们将IRF7、MyD88和不同数量的IRAK-1 KN与携带IFN-α4启动子的报告质粒联合瞬时转染HEK293细胞。 IRAK-1 KN以剂量依赖的方式抑制由MyD88和IRF7共表达诱导的IFN-α4启动子的激活,而IRAK-1 KN不抑制MyD88对NF-κB的激活。 IRAK-1 KN的这种作用与仅包含COOH末端TRAF结构域(TRAF6C)的TRAF6截短突变形成鲜明对比,TRAF6作为显性阴性突变,干扰IFN-α4和NF-κB启动子的激活( 图2 C) ●●●●。 这些数据表明IRAK-1在体外可以磷酸化IRF-7,IRAK-1的激酶活性对IRF7的转录活性是必需的,而对NF-κB的转录活性则不是必需的。
图2。
IRAK-1激活IRF7。 (A) 如图所示,从瞬时转染FLAG–IRF7的HEK293细胞以及Myc–IRAK1或Myc–IRAK1 KN制备的细胞裂解物用抗Myc或抗FLAG进行免疫沉淀,然后使用抗FLAG或抗Myc进行免疫印迹分析。 (B) 用FLAG–IRAK-1、FLAG–IRAK-1 KN、FLAG-IRAK-4或FLAG–IRAK-4 KN瞬时转染HEK293细胞。细胞裂解物用抗FLAG免疫沉淀,并在GST–IRF7存在下进行体外激酶反应。 蛋白质在SDS-PAGE上分离,然后通过放射自显影进行可视化。 (C) 将IRF7、MyD88和IRAK-1(IRAK-1 KN)KN突变株1、10或50 ng的组合以及携带IFN-α4启动子的报告质粒瞬时转染HEK293细胞(左)。 HEK293细胞还转染了MyD88和1、10或50 ng IRAK-1 KN的组合以及携带ELAM启动子的报告质粒(右)。 转染后36小时,通过报告基因测定分析细胞的IFN-α4-或ELAM依赖性启动子活性。
对A/D型CpG ODN的响应 伊拉克-1
−/年 pDC
为了阐明IRAK-1在TLR-介导的IFN-α产生中的体内作用,我们通过使用来源于 伊拉克-1
−/年 老鼠。 大量IFN-α的产生来自 伊拉克-1
+/年 Flt3L–观察到BMDC对A/D型CpG ODN,D35的反应( 31 ). 然而,干扰素-α的产生在 伊拉克-1
−/年 Flt3L–BMDC。 相反, 伊拉克-1
+/Y(Y) 和 伊拉克-1
−
/Y(Y) Flt3L–BMDC对D35产生相似水平的TNF-α、IL-6和IL-12p40( 图3 A) ●●●●。 此外,Northern blot分析显示,尽管IL-6 mRNA的诱导在 伊拉克-1
−/年 D35诱导的Flt3L–BMDCs、IFN-α4 mRNA在 伊拉克-1
−/年 Flt3L–BMDC( 图3 B) ●●●●。
图3。
D35对干扰素-α诱导的损伤 伊拉克-1
-/Y(Y) 老鼠。 (A) Flt3L–来自 伊拉克-1
+
/Y(Y) 和 伊拉克-1
−
/Y(Y) 用指示浓度的D35刺激小鼠24小时。用ELISA法测定培养上清中IFN-α、TNF-α、IL-6和IL-12p40的浓度。 数据显示为平均值±SD。(B)来自Irak-1的Flt3L–BMDCs +/Y(Y) 和伊拉克-1 −
/Y(Y) 用1μM D35刺激小鼠,持续指定时间。 提取总RNA并进行Northern blot分析。 (C) Irak-1来源的Flt3L–BMDCs的细胞内IFN-α和IL-12染色 +/Y(Y) 和伊拉克-1 −
/Y(Y) 用3μM CpG DNA(D35)刺激小鼠。 CD11c公司 + B220型 + Flt3L–BMDCs的群体分别作为pDC进行分析。
用Flt3L培养BM细胞可诱导两种pDC(B220 + )和传统(B220 − )跟单信用证( 32 ). 虽然pDC是IFN-α产生的主要来源,但两种DC亚群都会产生前炎症细胞因子,如IL-12( 4 ). 由于难以区分pDC中促炎细胞因子的诱导是否受损,我们进一步分析了B220中IFN-α和IL-12的产生 + 流式细胞术检测pDCs。 Flt3L–BM–DC来自 伊拉克-1
+/Y(Y) 和 伊拉克-1
−/年 用D35刺激小鼠,并用干扰素-α或IL-12抗体染色,同时用CD11c和B220染色。 流式细胞术分析表明,D35诱导IFN-α的产生 伊拉克-1
−/年 B220型 + 与来自 伊拉克-1
+
/Y(Y) B220型 + pDC。 另一方面,IL-12的产生在 伊拉克-1
−/年 B220型 + pDC( 图3 C) ●●●●。 这些结果表明TLR9配体诱导的IFN-α生成在 伊拉克-1
−
/Y(Y) pDC。
的响应 伊拉克-1
−/年 细胞与其他TLR配体
ODN1668、K型或传统CpG ODN可刺激野生型Flt3L–BMDCs在0.01至0.1μM的低浓度下产生IFN-α( 24 )虽然最大诱导值小于D35刺激的DC。 与A/D型CpG ODN的结果类似,对ODN1668应答的IFN-α的产生在 伊拉克-1
−/年 Flt3L–骨髓基质干细胞。 然而,其他细胞因子的产生,如TNF-α、IL-6和IL-12 p40在 伊拉克-1
+/Y(Y) 和 伊拉克-1
−/年 单元格( 图4 A) ●●●●。
图4。
其他TLR配体对IFN-α的诱导作用 伊拉克-1
−/年 老鼠。 (A) Flt3L–BMDC来自 伊拉克-1
+
/Y(Y) 和 伊拉克-1
−
/Y(Y) 用指定浓度的ODN1668刺激小鼠24小时。用ELISA测定培养上清中IFN-α、TNF-α、IL-6和IL-12p40的浓度。 数据显示为平均值±标准偏差。(B) 伊拉克-1
+
/Y(Y) 和 伊拉克-1
−
/Y(Y) 老鼠( n个 =3)静脉注射50 nmol R-848。 采集血清样本,通过ELISA测定IFN-α和IL-12p40的浓度。 (C) Flt3L–BMDC来自 伊拉克-1
+
/Y(Y) 和 伊拉克-1
−
/Y(Y) 用10μg/ml poly(I/C)转染小鼠24小时。通过ELISA测量培养上清液中IFN-α的浓度。 数据显示为未检测到的平均值±标准偏差N.D。
由于TLR9配体诱导的IFN-α生成在 伊拉克-1
−/年 小鼠,我们还检测了TLR7介导的IFN-α诱导 伊拉克-1
−/年 老鼠。 我们静脉注射 伊拉克-1
+/年 和 伊拉克-1
−/年 使用TLR7配体R-848的小鼠,并检测IFN-α的血清浓度。 R-848注射后一小时内, 伊拉克-1
+/Y(Y) 小鼠的血清干扰素-α浓度增加,而血清干扰物-α水平在 伊拉克-1
−/年 老鼠。 相反,IL-12p40的血清浓度在 伊拉克-1
+/Y(Y) 和 伊拉克-1
−/年 老鼠( 图4 B) ●●●●。 这些结果表明,IRAK-1也参与了TLR7介导的IFN-α的产生。
排除干扰素-α产生中固有缺陷的可能性 伊拉克-1
−/− 小鼠,我们将双链RNA,poly(I/C)转染到来源于 伊拉克-1
+/Y(Y) 小鼠并测量IFN-α的产生。 伊拉克-1
+/Y(Y) 和 伊拉克-1
−/年 Flt3L–BMDC对poly(I/C)的反应产生了类似水平的IFN-α( 图4 C) ,表明了这一点 伊拉克-1
−/年 小鼠具有产生IFN-α的能力。 因此,IRAK-1特别参与TLR7-和TLR9-介导的IFN-α的产生。
中IRF7的激活有缺陷 伊拉克-1
−
/Y(Y) 细胞
接下来我们研究了IRF7是否被TLR9配体激活 伊拉克-1
−/年 老鼠。 我们从 伊拉克-1
+/Y(Y) 和 伊拉克-1
−/年 用抗IRF7或抗NF-κB、RelA免疫印迹分析核蛋白。 在D35刺激后1 h,IRF7易位到细胞核,6 h时减少 伊拉克-1
+/Y(Y) 细胞。 相反,IRF7未能在D35作用下进入细胞核 伊拉克-1
−/年 单元格( 图5 A) ●●●●。 RelA在D35作用下转位到细胞核 伊拉克-1
+/Y(Y) 和 伊拉克-1
−
/Y(Y) 细胞,尽管在 伊拉克-1
−/年 ( 图5 A) ●●●●。 我们还通过免疫印迹分析分析了MAP激酶家族成员ERK1对D35的反应。 ERK1的酪氨酸磷酸化在两者中都被诱导 伊拉克-1
+/Y(Y) 和 伊拉克-1
−/年 细胞,尽管磷酸化 伊拉克-1
−/年 细胞比 伊拉克-1
+/Y(Y) 单元格( 图5 B) ●●●●。 这些结果表明,IRAK-1对IRF7的激活起着关键性的调节作用,并参与了对CpG ODN的应答而产生IFN-α。
图5。
IRF7对D35的核转位受损 伊拉克-1
−/年 细胞。 (A) Flt3L–BMDC来自 伊拉克-1
+
/Y(Y) 和 伊拉克-1
−
/Y(Y) 用D35刺激小鼠1、2或6小时。制备核蛋白,并使用抗IRF7和抗RelA进行免疫印迹分析。 星号表示IRF7蛋白。 (B) Flt3L–BMDC来自 伊拉克-1
+
/Y(Y) 和 伊拉克-1
−
/Y(Y) 用D35刺激小鼠10、30或60分钟。使用抗磷酸特异性ERK1和抗ERK1对全细胞裂解物进行免疫印迹分析。 (C) TLR7和TLR9介导的信号通路示意图。 IRF7与MyD88相互作用形成复合物,为IFN-α的诱导奠定了基础。 IRAK-1直接与IRF7结合,并包含在该复合物中。 IRAK-1对NF-κB的激活是不必要的,但通过IRF7的激活专门调节IFN-α的诱导。 IRAK-4可能位于IRAK-1的上游,参与IRAK-1激活。
讨论
IRAK-1最初被鉴定为IL-1治疗后IL-1R复合体中的激酶( 16 , 17 ). 体外研究表明IRAK-1参与IL-1R–TLR信号的NF-κB活化( 15 ). 体内研究使用 伊拉克-1
−
/
− EFs证实IRAK-1对IL-1介导的IL-6的产生以及MAPK和NF-κB的激活至关重要( 14 , 18 ). 然而,细胞因子的产生以及NF-κB对TLR4配体、LPS的激活仅在 伊拉克-1
−
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− 巨噬细胞( 19 )这表明IRAK-1在某些细胞类型对TLR配体的反应中是多余的。 在本报告中,我们发现IRAK-1在pDC中的一种新功能。 IRAK-1是TLR7和TLR9信号通路中IRF7激活所必需的调节因子。 IRAK-1对于TLR9介导的NF-κB和MAP激酶激活以及pDC中的促炎细胞因子产生是可有可无的。 IRAK-1是激活IRF7途径诱导IFN-α产生的网关( 图5 C) ●●●●。
基于对IL-1R信号通路的研究,已经建立了一个解释IRAK-1激活机制的精细模型( 15 ). 在配体刺激后,IRAK-1被招募到IL-1R,并与MyD88、IRAK-4和TRAF6形成复合物。 提示IRAK-4位于IRAK-1的上游,在IL-1R复合物中磷酸化IRAK-1。 磷酸化触发IRAK-1自身激酶活性的诱导,导致多重磷酸化事件并增加其对TRAF6的亲和力( 33 , 34 ). 因为据报道IRAK-1的激酶活性对下游NF-κB的激活是不必要的( 35 )激酶活性的确切作用尚不清楚。 在pDC的TLR7和TLR9信号通路中,假设在配体刺激时形成类似的受体复合物。 遗传研究表明,MyD88和IRAK-4对IFN-α和炎症细胞因子的诱导至关重要( 29 ),表明这些分子不能决定信号传导的特异性。 此外,IRAK-4不直接与IRF7结合,表明IRAK-4在信号传递中作用于IRAK-1的上游。 总之,IRAK-4可能通过IRAK-1的磷酸化参与IRF7途径。
人们认为IRF7的活化也受其磷酸化调节( 36 , 37 ). 先前的研究表明,两种IKK相关激酶,TANK-binding kinase 1(TBK1)和inducible IKK(IKK 我 )参与IRF7和IRF3的磷酸化( 38 , 39 ). TBK1型
−
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− 细胞对TLR3和TLR4刺激未能产生I型IFN( 40 – 43 ). 然而,我们发现来自TBK1或IKK缺陷小鼠的pDC中对CpG ODN产生IFN-α 我 与野生型细胞相比没有受损( 28 ). 尽管进一步研究使用了缺乏TBK1和IKK的小鼠 我 将需要排除冗余的可能性( 44 )更有可能认为其他激酶参与TLR7和TLR9信号传导。 另一方面,据报道,IRF7被MAPK激酶4(MKK4)–c-Jun NH激活 2 -末端激酶(JNK)通路对紫外线和化疗药物的反应,导致DNA损伤( 45 ). 这些观察结果表明,IRF7的激活可能发生在MAPK级联的下游,以响应某些刺激。 然而,MAPK对TLR9配体的激活在 伊拉克-1
−
/Y(Y) pDC,表明另一条途径负责IRF7的激活。
在本研究中,我们发现IRAK-1在体外磷酸化了IRF7,IRAK-1 KN的表达抑制了MyD88和IRF7共表达诱导的IFN-α4启动子的激活。 这些数据表明IRAK-1可能是IRF7的激酶。 然而,我们无法显示IRAK-1对IRF7的内源性磷酸化,因为这些实验在技术上难以实现IRF7的少量表达和IRAK-1的刺激依赖性降解。 此外,以前的研究表明,将IRAK-1 KN引入IRAK-1缺陷的293细胞中可以重建对IL-1的责任( 35 ). 因此,不能排除IRAK-1的激酶活性对IRF7活化是不必要的。 需要进一步的研究来阐明IRAK-1的激酶活性对于使用表达IRAK-1 KN的pDC发挥其功能是否必要和充分。
总之,我们目前的研究表明,IRAK-1是pDC中TLR7-和TLR9-介导的IFN-α生成的关键调节因子。 这些结果为IRAK-1成为特异性调节IFN-α生成的治疗靶点提供了可能,从而治疗病毒感染和自身免疫性疾病。
材料和方法
质粒
IFN-α4启动子结构和内皮白细胞粘附分子(ELAM)启动子结构已在前面描述过( 28 ). FLAG–IRF7,IRF7和TRAF6c的一系列缺失突变如前所述( 28 ). 编码融合蛋白IRF7-CFP、IRAK-1-CFP、IRAK-4-CFP和IRAK-4-YFP的质粒基本上如前所述构建( 28 ). 通过PCR获得IRF7的COOH末端部分,并将其连接到pGEX-5X1载体(Amersham Biosciences)的EcoRI和SalI位点。 编码IRAK-1和IRAK-4的cDNA片段通过PCR从人类脾脏cDNA文库(CLONTECH Laboratories,Inc.)中扩增,用适当的限制性内切酶消化,并插入pFLAG–CMV2(Sigma-Aldrich)或pCMV-Myc(CLONTECH Laboratory,Inc.)。 为了产生人类IRAK-1(K239A)和IRAK-4(K213/214A)的激酶阴性突变体,按照制造商(Stratagene)的规定,使用QuickChange XL-site定向突变试剂盒进行定点突变。 PCR获得的DNA片段序列经DNA测序证实。
老鼠
伊拉克-1 −/年 小鼠由J.A.Thomas博士(德克萨斯大学西南医学中心,达拉斯,德克萨斯州;18)提供。
细胞和试剂
Flt3L–BMDC的制备如前所述( 24 ). 如前所述制备CpG寡核苷酸(D35和ODN1668)( 24 ). R-848由日本能源公司制药和生物技术实验室提供( 9 ). Poly(I/C)购自Amersham Biosciences,Inc.。Anti-IRF7、Anti-ERK和Anti-phosphalated-ERK分别购自Zymed Laboratories和New England Biolabs,Inc。
转染、免疫沉淀和免疫印迹分析
HEK293电池(10 6 )在一个100毫米的盘子里播种。 12小时后,将总计6.0μg的不同质粒与Lipofectamine 2000(Invitrogen)瞬时转染细胞。 如前所述进行免疫沉淀和免疫印迹分析( 28 ).
烦恼
如前所述,对HEK293细胞在胶原涂层玻璃皿上进行成像( 28 ). 简而言之,细胞在配备冷却CCD摄像头的倒置显微镜上成像,并由MetaMorph软件(Universal Imaging Corp.)控制。 在HEK293细胞中表达了一对与YFP或CFP融合的蛋白。 使用以下滤波器组对细胞进行成像:用于CFP图像的MX0420激发滤波器和BP470-490发射滤波器(Olympus),用于FRET图像的MX0420激发过滤器和535DF35发射滤波器(欧米茄光学公司),以及510DF23激发过滤器(欧米加光学公司) 以及用于YFP图像的560DF15发射滤波器(Omega Optical,Inc.)。 在整个实验过程中使用了XF2052二向色反射镜(Omega Optical,Inc.)。 CFP和FRET图像的曝光时间为200毫秒,YFP图像为100毫秒。 数据采集后,测量CFP、FRET和YFP的平均强度,并通过由FRET分量组成的FRET滤波器组计算荧光强度(“校正”FRET、FRET C类 ). 如前所述减去非FRET成分( 28 ). 对于我们的实验条件,我们使用了以下方程式:FRET C类 =FRET−(0.34×CFP)−(0.02×YFP)。
为了流式细胞术分析FRET,将如上所述转染CFP和/或YFP融合蛋白的HEK293细胞重新悬浮在293表达介质(Invitrogen)中,并测量YFP(激发:488 nm;发射:530 nm)、CFP(激发:407 nm;发射:510 nm)、FRET(激发:40.7 nm;释放:535 nm) 通过使用FAC aria(Becton Dickinson)和BD FACSDiVa软件。 FRET表示为CFP激发获得的YFP发射除以CFP激发得到的CFP发射。
荧光素酶报告试验
HEK293细胞接种在24孔板(10 5 cells/well)瞬时转染100ng荧光素酶报告质粒和总计900ng的各种表达载体。 然后,36小时后,用双荧光素酶报告分析系统(Promega)测量总细胞裂解物中的荧光素素酶活性。 同时转染肾素荧光素酶报告基因(50ng)作为内部对照。
酶联免疫吸附试验
Flt3骨髓基质干细胞(10 6 细胞/孔)用不同浓度的CpG寡核苷酸D35和ODN1668刺激24小时。 根据制造商的说明(TNF-α和IL-12 p40的Genzyme、IL-6的研发和IFN-α的PBL生物实验室),用ELISA测定培养上清液中TNF-β、IL-6、IL-12 p 40和IFN-β的浓度。 用ELISA法测定血清细胞因子IFN-α和IL-12 p40的浓度。
体外激酶测定
200万个HEK-293细胞接种在一个60毫米直径的培养皿中。 24小时后,使用制造商规定的Lipofectamine 2000(Invitrogen)瞬时转染细胞,共转染5.0μg空质粒或指示质粒(2.0μg pFLAG-CMV2 IRAK-1或IRAK-1,4.0μg pFLAG-CMV2 IRAK-4或IRAK-4 KN)。 转染36 h后收集细胞,进行裂解,然后用蛋白G–Sepharose和1.0μG抗FLAG M2单克隆抗体(Sigma-Aldrich)进行免疫沉淀,并旋转12 h。 用裂解缓冲液洗涤珠子四次,用激酶分析缓冲液洗涤另外三次(20 mM Hepes,pH 7.5,20 mM MgCl 2 ,3 mM氯化锰 2 和10mMβ-甘油磷酸)。 免疫沉淀剂与2.0μg GST-IRF7和10 mCi[γ- 32 P] ATP(Amersham Biosciences)在30°C下保持30分钟。通过添加Laemmli样品缓冲液停止激酶反应,并在4~20%聚丙烯酰胺梯度凝胶上分离。 凝胶被扣留、干燥并暴露于X射线胶片。
流式细胞术
对于细胞内IFN-α和IL-12p40染色,用3μM D35处理Flt3L-DC并培养5 h。再添加高尔基球蛋白(BD Biosciences)3 h,收集细胞并固定在多聚甲醛中。 使用大鼠抗鼠IFN-α(克隆F18,Hycult Biotechnology b.v.,克隆RMMA-1;PBL Biomedical Laboratories)、生物素化鼠抗鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laborators)和链霉亲和素APC(BD Biosciences)的混合物在含皂苷的缓冲液中进行IFN-α染色; 46 ). 使用抗IL-12-PE(BD Biosciences)在含皂苷的缓冲液中对IL-12进行染色。 随后用抗CD11c-FITC(克隆HL3)和抗B220–cychrome(克隆RA3-6B2)对细胞进行染色,并在FACSCalibur(BD Biosciences)上进行分析。
致谢
我们感谢James A.Thomas博士 伊拉克-1
-/Y(Y) 老鼠。 我们感谢H.Tomizawa为FRET分析提供R-848和K.Terai和S.Tanaka(BD Biosciences)。 我们还感谢N.Kitagaki的技术援助和M.Hashimoto的秘书协助。
这项工作得到了特别协调基金、教育、文化、体育、科学和技术部以及日本青年科学促进会研究金的资助。
作者没有相互冲突的经济利益。
使用的缩写:CFP,青色荧光蛋白; CpG ODN、CpG寡核苷酸; ds,双绞线; EF,胚胎成纤维细胞; 内皮细胞白细胞粘附分子; Flt3L,Flt3配体; FRET,荧光共振能量转移; HEK,人类胚胎肾脏; IKK公司 我 ,诱导性IKK; IRAK、IL-1受体相关激酶; JNK,c-Jun NH公司 2 -末端激酶; KN,激酶阴性; 丝裂原活化蛋白激酶; MKK4、MAPK激酶4; ss,单股; TBK1,TANK-binding激酶1; TIR、Toll–IL-1受体; TLR,Toll样受体; TRAF、TNF受体相关因子; YFP,黄色荧光蛋白。
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