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.1999年10月4日；147(1):185–194. 数字对象标识：10.1083/jcb.147.1.185

内皮克劳丁

Claudin-5/Tmvcf构成内皮细胞紧密连接链

森田和美 a、，b条，佐佐木裕久 c、，d日，米基奥·福鲁斯 一，津田昭一郎 一
PMCID:PMC2164984 PMID:10508865

摘要

内皮细胞中的紧密连接被认为决定了血管的通透性。最近，克劳丁-1至-15被确定为TJ链的主要成分。其中，克劳丁-5（也称为腭心面部综合征中缺失的跨膜蛋白[TMVCF]）广泛表达，甚至在缺乏上皮组织的器官中也有表达，表明这种克劳丁可能参与内皮细胞TJ。然后，我们获得了一种克劳丁-6特异性多克隆抗体和一种识别克劳丁-5/TMVCF和克劳丁-6的多克隆抗体。在脑和肺中，使用这些多克隆抗体的免疫荧光显微镜显示，claudin-5/TMVCF仅集中在所有血管段内皮细胞的细胞-细胞边界，而不是上皮细胞的细胞边界。免疫复制电镜显示claudin-5/TMVCF是TJ链的一种成分。相反，在肾脏，claudin-5/TMVCF信号仅限于动脉内皮细胞，但在静脉和毛细血管内皮细胞中检测不到。此外，在我们检查的所有其他组织中，claudin-5/TMVCF在某些血管段的内皮细胞中特异性检测到，但在上皮细胞中未检测到。此外，当claudin-5/TMVCF cDNA导入小鼠L成纤维细胞时，TJ链被重建，类似于体内内皮细胞中的TJ链，即与细胞外表面相关的TJ。这些发现表明claudin-5/TMVCF是TJ链的内皮细胞特异性成分。

关键词：克劳丁，闭塞素，内皮，紧密连接，血管

E类内皮的细胞在血液和组织环境之间提供了重要的界面。内皮细胞的重要功能之一是确定和调节血管通透性，这不仅在维持组织环境的正常生理学中很重要，而且在血管源性水肿和炎症等病理条件下也很重要。跨内皮层运输的物质通过两种不同的途径：跨细胞途径和细胞旁途径（有关综述，请参阅1998年春季).

紧密连接（TJ）1不仅存在于内皮细胞中，也存在于简单的上皮细胞中。在这些细胞中，TJ被认为直接参与屏障和栅栏功能，其作用是将TJ密封起来，形成阻止溶质通过细胞旁途径扩散的初级屏障，并充当顶端和基底外侧质膜域之间的边界，以创建和维持细胞极性，分别（有关审查，请参见Schneeberger and Lynch 1992年;甘比纳1987，Gumbiner 1993年;Anderson和Van Itallie，1995年;Yap等人，1998年). 在超薄切片电子显微照片上，TJ表现为一组离散的明显融合部位，涉及相邻细胞质膜的外叶(Farquhar and Palade 1963年). 在大多数上皮细胞的冷冻断裂电子显微镜下，TJ在原生质面（P面）上表现为一组连续的、网状的膜内颗粒链（TJ链），在细胞外（E面）上具有互补的凹槽(施泰赫林1973，施泰赫林1974).

TJs的分子结构主要使用简单的上皮细胞进行分析。几种外周膜蛋白，如ZO-1(史蒂文森等人1986)、ZO-2(Gumbiner等人，1991年)、ZO-3(Balda等人，1993年;Haskins等人，1998年)，扣带蛋白(Citi等人，1988年)，7H6抗原(Zhong等人，1993年)和辛普利金(Keon等人，1996年)显示集中在TJ的细胞质表面。具有四个跨膜结构域的Occludin是第一个TJ特异性整合膜蛋白(Furuse等人，1993年;Ando-Akatsuka等人，1996年). 闭塞物被认为不仅仅是一个结构部件(藤本1995;Furuse等人，1996年)也是TJ的功能组件；闭塞素被证明直接参与屏障功能(McCarthy等人，1996年;Balda等人，1996年;Chen等人，1997年;Wong和Gumbiner 1997)，TJ的围栏功能(Balda等人，1996年)和细胞内粘附(范·伊塔利和安德森1997).

最近，胚胎干细胞中的闭塞素基因被破坏(Saitou等人，1998年). 出乎意料的是，从封闭性敲除胚胎干细胞分化而来的封闭性不足的内脏内胚层细胞仍然具有发育良好的TJ链网络，这表明存在尚未鉴定的TJ特异性整体膜蛋白。最近，发现了两种新的完整膜蛋白，claudin-1和-2，它们仅定位于TJ链(Furuse等人，1998年a). Claudin-1和-2在结构上相关（氨基酸[aa]序列水平上38%相同），似乎具有四个跨膜结构域，但与闭塞素没有序列相似性。此外，当这些克劳丁cDNA单独导入缺乏TJ或克劳丁表达的L成纤维细胞时，在稳定的转染体之间诱导了巨大的TJ链网络(Furuse等人，1998年b). 这些发现表明克劳丁是TJ链的主要结构成分(Tsukita and Furuse 1999年).

数据库相似性搜索确定了许多与claudin相关的序列，到目前为止，已经分离出编码另外13种claudin样蛋白的cDNA，它们被命名为claudin-3-15(Morita等人，1999a，Morita等人，1999b;Tsukita and Furuse 1999年). Northern印迹显示，不同claudin物种之间的组织表达模式存在显著差异。考虑到内皮细胞表达特定的钙粘蛋白亚型，血管内皮细胞钙粘蛋白（VE-cadherin）(Lampugani等人，1995年)由于具有独特的特征，人们自然会问是否存在内皮细胞特异性克劳丁亚型。Claudin-5（也称为跨膜蛋白在腭心面部综合征[TMVCF]中缺失）被认为是这种内皮Claudin的一个很好的候选者，因为它广泛表达，甚至在缺乏上皮组织的器官中，如大脑、骨骼肌和脾脏中也有表达(Morita等人，1999a). 在本研究中，我们通过免疫荧光显微镜和免疫复制电子显微镜检查了claudin-5/TMVCF的表达和亚细胞分布，发现该claudin物种是TJ链的内皮细胞特异性成分。我们相信，对内皮克劳丁的首次描述将有助于开发新的方法来分析血管通透性调节的分子机制。

材料和方法

抗体和细胞

大鼠抗闭塞素单克隆抗体（MOC37）如前所述(Saitou等人，1997年). 抗VE-cadherin单克隆抗体是N.Matsuyoshi博士（日本京都京都大学）赠送的一份礼物。抗血小板内皮细胞粘附分子（PECAM）多克隆抗体（pAb）购自PharMinen。小鼠L细胞及其转染体在添加10%FCS的DME中培养。

pAbs的生产

两种多肽，KYSAPRRPTANGDYDKKNYV和YSTSVPHSRGPSEYPTKNY，分别对应于小鼠claudin-5/TMVCF（aa 199–218）和claudin-6（aa 200–219）的COOH末端细胞质域（在其NH处添加半胱氨酸残基）2termini），通过半胱氨酸残基合成并偶联到锁孔帽贝血蓝蛋白。将这些肽作为抗原注射到兔子体内。在硝化纤维素膜上用谷胱甘肽亲和纯化兔抗前肽和后肽的抗血清S公司-转移酶（GST）与claudin-5/TMVCF和claudin-6Δ融合蛋白，分别获得抗claudin-5/6 pAb和抗claudin-6 pAb（参见图1A） ●●●●。

图1。

图1

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pAbs的特异性。（A） claudin-5/TMVCF和claudin-6细胞质域的氨基酸序列。COOH-末端KNYV由这两个克劳丁物种共享。用与这些序列相对应的两种多肽作为抗原，在兔子体内产生pAbs。（B） GST融合蛋白具有claudin-1到-8的细胞质结构域，以及缺少其COOH末端KNYV的claudin-6的细胞质区域（参见A中的claudin-6Δ）大肠杆菌。的裂解物大肠杆菌用SDS-PAGE（C.B.B.染色）分离，然后用两种不同的pAb进行免疫印迹，这两种pAb分别针对claudin-5/TMVCF或claudin-6的细胞质域。前者识别GST–claudin-5/TMVCF和GST–claudin-6，但不识别GST-claudin-6Δ，表明该pAb（称为抗–claudin-5/6 pAb）特别与COOH末端KNYV序列结合。后者识别GST-第6条和GST-第一6条Δ，但不识别GST--第5条/TMVCF，表明该pAb（称为反第6条pAb）对第6条的YSTSVPHSRGPSEYPT序列具有特异性（见A）。（C） 抗claudin-5/6 pAb免疫荧光染色L转染剂表达claudin-5/TMVCF（C5L细胞）和claudin-6（C6L细胞），而抗claudin-6 pAb仅染色C6L细胞。棒材，10μm。

表达载体的构建及转染

为了构建在COOH末端带有或不带有FLAG标签的claudin-5/TMVCF或claudin-6表达载体，通过PCR在claudin cDNA的3′端引入EcoRI位点，并将扩增片段亚克隆到pBluescript SK（−）–FLAG或SK（–）中。通过SaII-XbaI消化切除插入物，然后用T4聚合酶钝化，然后导入pCAGGSneodelEcoRI(Niwa等人，1991年)，由J.Miyazaki博士（日本大阪大阪大学）提供。

小鼠L细胞用于转染。将每种表达载体的1μg等分样品用脂质体加（GIBCO BRL）导入1 ml DMEM中的L细胞。培养24或48小时后，将细胞替换并培养在含有10%FCS和500μg/ml Geneticin（GIBCO BRL）的DMEM中，以选择稳定的转染剂。

免疫染色

对于全悬置染色，杀死小鼠12.5-d胚胎。样品在PBS中通过微波预处理20 s，并在4%多聚甲醛/PBS中固定30 min。它们在甲醇中脱水并用30%H漂白2哦2然后将样品重新水化，用PBS-MT（0.2%Triton X-100和1%脱脂牛奶/PBS）封闭，并用一级抗体和二级抗体孵育过夜。HRP结合山羊抗兔Ig（Chemicon International，Inc.）用作二级抗体。然后用PBS-MT和PBS-T（0.2%Triton X-100/PBS）分别清洗它们5小时。通过与0.025%二氨基苯甲醛、0.08%氯化镍孵育，观察结合抗体2和30%H2哦2PBS-T中。

用液氮冷冻小鼠的大脑、肺、肾和肠。将厚度约为6μm的冰冻切片切割在低温恒温器上，安装在玻璃载玻片上，空气干燥，并在4°C的95%乙醇中固定30分钟，然后在室温下用100%丙酮固定1分钟。然后在含有0.2%Triton X-100的PBS中冲洗15分钟，用1%BSA/PBS封闭15分钟，并用一级抗体培养。用PBS洗涤三次后，将样品与二级抗体孵育30分钟。Cy3-共轭山羊抗鼠Ig（Amersham Pharmacia Biotech）和Cy2-共轭山羊抗兔Ig（Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.）用作二级抗体。用PBS将样品清洗三次，然后将其装入含有0.1%对苯二胺和1%的90%甘油/PBS中n个-丙基半乳糖。使用蔡司Axiophot显微镜（卡尔蔡司公司）观察样本。

SDS-PAGE和免疫印迹

的裂解液大肠杆菌表达GST-克劳丁融合蛋白(Morita等人，1999a)根据以下方法进行一维SDS-PAGE（12.5%）莱姆利1970凝胶用考马斯亮蓝R-250染色。对于免疫印迹，蛋白质从凝胶电泳转移到硝化纤维素膜上，然后与第一抗体孵育。用生物素化二级抗体和链霉亲和素结合碱性磷酸酶（Amersham Pharmacia Biotech）检测结合抗体。以硝基四氮唑和溴氯吲哚磷酸为底物检测碱性磷酸酶。

冷冻断裂电子显微镜

按照说明进行免疫电子显微镜检查冷冻断裂复制品(藤本1995). 将小鼠肺切成小块，用HPM 010高压冷冻柜（BAL-TEC）在高压液氮中快速冷冻。冷冻样品在−110°C下断裂，铂以45°kin的角度单向遮蔽Balzers冷冻蚀刻系统（BAF 060；BAL-TEC）。在室温下，将样品浸泡在含有2.5%SDS、10mM Tris-HCl和0.6M蔗糖（pH 8.2）的样品裂解缓冲液中12小时，然后用PBS清洗样品上漂浮的复制品。在这些条件下，复制品捕获完整的膜蛋白，并且其胞质结构域可获得抗体。复制品与抗-克劳丁-5/6 pAb孵育60分钟，然后用PBS洗涤数次。然后用山羊抗兔免疫球蛋白与10nm金（Amersham Pharmacia Biotech）进行孵育。样品用PBS清洗，在formvar薄膜网格上采集，并在JEOL 1200EX电子显微镜中以100 kV的加速电压进行检查。

结果

检测Claudin-5/TMVCF抗体的制备

带有claudin-5/TMVCF细胞质域的GST融合蛋白（参见图1A） 生产于大肠杆菌并作为抗原在兔子体内产生特异性pAbs。获得了几个识别claudin-5/TMVCF的pAb，但在免疫印迹上均与claudin-6发生交叉反应(图1B） 以及免疫荧光显微镜(图1C） ●●●●。如所示图1A、 在claudin-5/TMVCF和claudin-6之间共享COOH末端KNYV序列。这些pAbs没有检测到含有缺乏这四个aa的claudin-6细胞质域的GST融合蛋白（GST–claudin6Δ）(图1B） 表明他们特别识别了COOH终端KNYV。这些pAb被称为抗claudin-5/6 pAbs。另一方面，当以带有claudin-6细胞质结构域的GST融合蛋白作为抗原时，免疫印迹上识别claudin6但不识别clauding-5/TMVCF的几个pAb(图1B） 以及免疫荧光显微镜(图1C） 获得（抗-claudin-6 pAb）。正如预期的那样，这些抗体识别GST–第6条Δ(图1B） ●●●●。因此，为了检测claudin-5/TMVCF在各种组织中的表达和定位，将这些抗claudin-5/6 pAbs和抗claudin-6 pAbs联合使用；如果一些细胞是抗claudin-5/6 pAb阳性和抗claudin-6 pAb阴性，我们得出结论，它们表达claudin-5/TMVCF。幸运的是，Northern blotting显示，在成年小鼠的大多数器官中，claudin-6的表达相当有限(Morita等人，1999a).

Claudin-5/TMVCF在脑和肺中的作用

我们首先检测了claudin-5/TMVCF在大脑中的分布，通过Northern印迹检测，大脑中不含上皮细胞，但表达claudin-5/TMVGF(Morita等人，1999a). 当12.5-d小鼠胚胎用抗claudin-5/6 pAb进行整体免疫染色时，在头部检测到一种典型的树状染色模式(图2、a和b）。抗claudin-6 pAb在头部无明显染色(图2c） 和PECAM的特异性pAb，PECAM是血管内皮细胞的特异性标记物(里索和弗拉梅1995)，显示出与抗claudin-5/6 pAb非常相似的染色模式(图2d） ●●●●。这些发现表明，claudin-5/TMVCF仅在胎脑所有血管段的内皮细胞中表达。

图2。

图2

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大脑内皮细胞中claudin-5/TMVCF的专属表达。（a–d）整体免疫染色。小鼠12.5-d胚胎用抗-克劳丁-5/6 pAb（a和b）、抗-克劳汀-6 pAb。抗claudin-5/6 pAb和抗PECAM pAb在头部血管中都显示出类似的树状染色。相反，抗claudin-6抗体在头部没有产生信号。（e–h）免疫荧光染色。成年小鼠脑冷冻切片用抗-克劳丁-5/6 pAb（e）和抗-VE-卡德林单克隆抗体（f）或抗-克劳汀-6-pAb（g）和抗-VE-卡德林单克隆抗体（h）双重标记。由于抗claudin-6 pAb根本没有产生信号，因此抗claudin-5/6 pAb染色可以被视为代表claudin-5/TMVCF的分布。大脑中的所有血管均为VE-卡德林阳性，claudin-5/TMVCF与VE-卡德林精确共定位；0.2毫米（b）；e–h（h）为40μm。Cln，克劳丁；Cad，钙粘蛋白。

然后用抗-克劳丁-5/6 pAb和抗-VE-卡德林单克隆抗体对成人脑冰冻切片进行免疫荧光双重染色。据报道，VE-cadherin在内皮细胞中特异表达(Lampugani等人，1995年). 如所示图2e和图f，所有血管都与这些抗体特异性共染。这些抗VE粘附素单克隆抗体阳性的内皮细胞经抗克劳丁-6单克隆抗体染色呈阴性(图2g和图h). 此外，在高倍镜下，claudin-5/TMVCF和VE-cadherin均精确地集中在血管内皮细胞的细胞-细胞边界(图3). 综上所述，我们得出结论，claudin-5/TMVCF在成人大脑所有血管段内皮细胞的细胞-细胞接触部位表达和定位。

图3。

图3

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claudin-5/TMVCF和VE-cadherin在大脑内皮细胞的细胞-细胞边界的精确共定位。用抗-克劳丁-5/6单克隆抗体（a，绿色）和抗-血管内皮细胞粘附素单抗（b，红色）对成年小鼠脑冰冻切片中的血管进行双重染色。合并图像（c）显示两种染色模式精确重叠。抗claudin-6 pAb未产生信号（数据未显示）。棒材，10μm。Cln，克劳丁；卡德，卡德林。

接下来，我们检查了克劳丁-5/TMVCF在肺中的分布，其中包括上皮细胞和内皮细胞，并通过Northern印迹法检测到相当大量的克劳丁-5/TMVCF(Morita等人，1999a). 当肺冰冻切片用抗claudin-5/6单克隆抗体和抗VE-cadherin单克隆抗体双重染色时，两种信号完全重叠(图4，a–c）。相反，在抗克劳丁-5/6单克隆抗体和抗闭塞素单克隆抗体双重染色时，这两个信号根本没有重叠(图4，d–f）。此外，抗claudin-6 pAb没有检测到信号（数据未显示）。考虑到闭塞素在上皮细胞中表达，但在非神经组织中的大多数内皮细胞中不表达，这些发现表明，克劳丁-5/TMVCF在所有血管段的内皮细胞中都表达，但不在描绘肺泡腔的上皮细胞中。此外，用抗claudin-5/6 pAb进行免疫组化分析表明，claudin-5/TMVCF定位于肺内皮细胞的TJ链上(图4g） ●●●●。

图4。

图4

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claudin-5/TMVCF在肺部的定位。（a–f）用抗-克劳丁-5/6 pAb（a）和抗-VE-卡德林单抗（b）或抗-克劳汀-5/6 p Ab（d）和抗闭塞素单抗（e）对肺冰冻切片进行双重染色。由于抗claudin-6-pAb没有产生信号（数据未显示），抗claudin-5/6 pAb染色可以被认为代表了claudin-5/TMVCF的分布。合并后的图像（c和f）显示，claudin-5/TMVCF与VE-cadherin精确共定位，claudin-5/TMVCG信号与闭塞素信号互补。考虑到VE-cadherin和clodin分别只在肺的内皮细胞和上皮细胞中表达，这些发现表明claudin-5/TMVCF的表达仅限于内皮细胞。（g） 用抗claudin-5/6 pAb标记肺冷冻骨折复制品。注意内皮细胞TJ链上的特殊标记，它描绘了毛细血管腔（用星号表示）。RC，红细胞；Cln，克劳丁；cad，钙粘蛋白。棒材：a–f（f）中的20μm；100纳米（克）。

肾脏和其他器官中的Claudin-5/TMVCF

在肾脏中，claudin-5/TMVCF似乎没有在所有血管段的内皮细胞中表达(图5). 当肾皮质冰冻切片用抗-克劳丁-5/6 pAb和抗闭塞素单克隆抗体双重染色时，肾小管周围结缔组织中的一些血管用抗-claudin-5/6 p Ab染色，但不用抗闭塞素mAb染色(图5、a和b）。相反，anti-ccludin mAb强烈标记远端小管的TJs(图5b） ●●●●。抗claudin-6 pAb未显示明显信号(图5e） 表明抗claudin-5/6 pAb仅在肾脏中检测到claudin-5/TMVCF。从claudin-5/TMVCF阳性血管的密度/数量来看，只有一些选定的血管似乎被抗claudin-5/6 pAb染色。肾脏冰冻切片用抗克劳丁-5/6单克隆抗体和抗血管内皮细胞粘附素单克隆抗体双重染色(图5c和图d). 抗VE-cadherin单抗使肾小管周围和肾小球内的许多毛细血管染色。这些管间毛细血管和肾小球毛细血管未被抗claudin-5/6 pAb染色。有趣的是，肾小球的传入小动脉和传出小动脉均用抗-克劳丁-5/6 pAb重复染色(图5c和图d). 此外，较厚的动脉（可能是小叶间动脉）而不是静脉也被抗克劳丁-5/6 pAb强烈染色(图5g和图h). 综上所述，我们得出结论，在肾脏中，claudin-5/TMVCF仅在动脉内皮细胞中构成TJ。

图5。

图5

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克劳丁-5/TMVCF在肾脏和肠道的定位。肾脏（a–h）和肠道（i和j）的冰冻切片用抗-克劳丁-5/6 pAb（a）和抗闭塞素单克隆抗体（b）、抗-克劳汀-5/6 p Ab（c）和抗-血管内皮素-卡德林单克隆抗体。由于抗claudin-6 pAb在肾脏（e）和肠道中未产生信号（数据未显示），因此可以认为抗claudin-5/6 pAb染色代表claudin-5/TMVCF的分布。Claudin-5/TMVCF似乎在闭塞阴性的血管子集中表达（a和i中的箭头）。阻塞素集中在肾脏远端小管（箭头在b中）和肠上皮细胞（箭头在j中）的TJ处。在肾脏中，VE-cadherin阳性的管间毛细血管（d和f中的箭头）和肾小球毛细血管（f和d中的星号）不表达claudin-5/TMVCF，但传入和传出小动脉（c和d中箭头）同时表达claudin-5/TMVCF和VE-cadherin。当肾脏较厚的动静脉（箭头和箭头分别以g和h为单位）的横向冰冻切片用抗-克劳丁-5/6 pAb染色时，只有动脉被强烈染色（g）。（h） 相位-对比图像。棒材：a–f（f）为40μm；70μm in g和h（h）；i和j（j）中为40μm。Cln、claudin；卡德，卡德林。

还检测了claudin-5/TMVCF在其他器官中的表达和分布，其中包括肠道、骨骼肌、皮肤、肝脏、睾丸。在这些组织中，claudin-5/TMVCF在某些血管段的内皮细胞中特异性检测到，但在上皮细胞中未检测到。肠中克劳丁-5/TMVCF的内皮细胞特异性定位于图5i和图j。

Claudin-5/TMVCF在L成纤维细胞中重组胞外表面相关TJ链

我们之前报道过，当引入L成纤维细胞时，claudin-1和-2在相邻转染体之间重建TJ链(Furuse等人1998年b). 然后，我们检测了claudin-5/TMVCF在L成纤维细胞中重建TJ链的能力。当表达claudin-5/TMVCF的稳定L转染体用抗-claudin-5/6 pAb染色时，显示claudin/5/TMVCF以平面形式集中在细胞-细胞边界，类似于claudin-1和-2(图6、a和b）。戊二醛固定的L转染子的常规冷冻-断裂电子显微镜显示，在细胞-细胞接触平面中形成了巨大的发育良好的TJ链网络(图6c） ●●●●。如前所示，表达claudin-1和claudin-2的L转染体(Furuse等人，1998年b)，claudin-1诱导的股线主要与P面相关，主要是在E面（P面相关TJ）有空槽的连续结构，而claudin-2诱导的股在P面是不连续的-E面上有由颗粒链占据的互补凹槽的面（E面-相关TJ）。如所示图6c、 claudin-5/TMVCF诱导的TJ是E-face相关TJ的极端病例；几乎所有粒子都与E面相关，在P面上留下无粒子的脊(图6c、 插图）。

图6。

图6

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表达claudin-5/TMVCF的L转染体。（a和b）表达claudin-5/TMVCF的稳定L转染体的免疫荧光（a）和相应的相位对比图像（b）。细胞用抗-克劳丁-5/6 pAb染色。表达的claudin-5/TMVCF以平面（箭头）的形式集中在细胞-细胞边界。（c） 表达claudin-5/TMVCF的稳定L转染体细胞-细胞接触面的冷冻断裂图像。重建了发育良好的TJ链/槽网络。在这些重组TJ中，大多数TJ颗粒都在E面上回收；在E面（E），凹槽完全被颗粒链占据（上插图中的箭头），而在P面（P）上仅观察到无颗粒脊（下插图中的图标）。棒材：a和b（b）中的15μm；200纳米（c）；50 nm（插入）。

讨论

TJ被认为参与上皮细胞和内皮细胞的屏障和栅栏功能，但迄今为止，还没有报道上皮细胞和血管内皮细胞之间TJ分子结构的差异(鲁宾1992;Schneeberger and Lynch 1992年;Bowman等人，1992年;Goodenough 1999年). 在本研究中，我们发现claudin-5/TMVCF在内皮细胞中特异性表达，而不是在上皮细胞中，并且该分子构成内皮细胞中的TJ链。人类TMVCF基因最初被发现定位于染色体22q11，该染色体在腭心面部/DiGeorge综合征患者中经常缺失(Sirotkin等人，1997年)，我们建议将其命名为claudin-5/TMVCF，因为它与claudin-1和claudin-2具有显著的相似性(Morita等人，1999a). 该基因也被鉴定为一种名为MBEC1的膜蛋白，在脑内皮细胞中表达(Chen等人，1998年). 在这两项研究中，没有检测TJ处TMVCF/MBEC1产物的浓度，可能是因为很难产生针对该蛋白的特异性抗体。我们通过生成并结合使用抗claudin-5/6 pAb和抗claudin-6 pAb来避免这一技术难题。用这些pAbs进行免疫荧光显微镜检查显示，在大脑和肺中，抗VE-cadherin单克隆抗体染色阳性的所有血管段的内皮细胞都表达了大量的claudin-5/TMVCF。相反，在肾脏中，静脉和毛细血管缺乏claudin-5/TMVCF的表达，其表达仅限于动脉。此外，在我们检测的所有其他组织中，claudin-5/TMVCF的表达仅限于某些血管段的内皮细胞。因此，我们得出结论，claudin-5/TMVCF是TJ链的内皮细胞特异性成分，但与VE钙粘蛋白相反(Lampugani等人，1995年)claudin-5/TMVCF并不在所有类型的内皮细胞中表达。

由于人们普遍认为TJ在血管通透性的调节中起着核心作用，内皮TJ的结构已被广泛研究，主要是通过冷冻断裂电子显微镜(Dempsey and Bullivant 1973年;Simionescu等人，1975年，Simionescu等人，1976年;Schneeberger 1982年;Bowman等人，1992年). 一般来说，在非神经元组织中戊二醛固定的内皮细胞中，内皮细胞中的TJ链的特征是P面上的无颗粒脊和E面上的连续凹槽，这些凹槽被颗粒链密集占据（E面相关的TJ）(Dempsey and Bullivant 1973年). 有趣的是，L转染体中重组的基于claudin-5/TMVCF的TJ链表现出相同的形态特征（参见图6)支持claudin-5/TMVCF是原位非神经元组织内皮TJ链的主要成分的观点。此外，在先前的冷冻-骨折研究中，TJs也在各种组织的静脉和毛细血管中形成(Simionescu等人，1975年，Simionescu等人，1976年;Schneeberger 1982年;Bowman等人，1992年). 因此，除claudin-5/TMVCF外，某些claudin物种必须参与静脉和毛细血管中TJ链的形成。迄今为止，除了本研究中使用的pAb外，还可以获得针对第2、-3、-4、-8、-11和-14条的pAbs。这些pAbs的初步免疫荧光显微镜显示，在我们检查的所有器官的内皮细胞中均未检测到这些克劳丁。在其他克劳丁物种（克劳丁-1、-7、-9、-10、-12、-13和-15）中，克劳丁-1预计会在内皮细胞中表达，因为这种克劳丁物种的表达相当普遍，甚至在缺乏上皮组织的器官中也有表达，如Northern印迹所示(Morita等人，1999a). 然而，与claudin-5/TMVCF相反，claudin-1似乎也在上皮细胞中表达，因为这种claudin物种最初是从肝细胞中鉴定出来的，并且在肝脏和肾脏中大量表达(Furuse等人，1998年a). 内皮细胞中表达的克劳丁物种的进一步鉴定和表征将在未来的研究中具有重要意义。

成人大脑中的内皮细胞形成血脑屏障（BBB），与通透性极低的TJ结合，更像是上皮屏障(Reese和Karnovsky 1967年;布莱曼和里斯1969;里索和沃尔堡，1990年;鲁宾1992). 尽管已经进行了大量的体内研究，但BBB在体内形成和成熟的发育时间仍有争议，但脑内皮细胞的TJ在胚胎中被认为是泄漏的(莫尔加德和桑德斯1975;法雷尔和里索1994). 如本研究所示，claudin-5/TMVCF在胎儿和成人大脑的内皮细胞中均被明确检测到（参见图2)表明BBB的形成和成熟并非归因于claudin-5/TMVCF表达水平的发育变化。胎儿脑中内皮细胞的TJ链是E面-与上述非神经组织中的内皮细胞相似，而成人脑中的内皮细胞核是P面-相关(Wolburg等人，1994年;Kniesel等人，1996年). 因此，我们很容易推测，在发育过程中，基于克劳丁-5/TMVCF的E-face相关TJ链通过添加其他克劳丁物种或通过一些内-外信号转导而被修饰，以转换为P-face相关形式。

虽然闭塞素和克劳丁被鉴定为上皮TJ链的成分(Furuse等人，1993年;Ando-Akatsuka等人，1996年;Furuse等人，1998年a;Morita等人，1999a)，我们对内皮细胞TJ分子结构的了解有限。据报道，闭塞素在脑内皮细胞中大量表达，但在非神经组织的大多数内皮细胞中检测不到(Saitou等人，1997年;Hirase等人，1997年). 既然claudin-5/TMVCF已被确定为内皮TJ链的一种特殊成分，就有可能从分子水平研究和调节血管通透性的调节机制。例如，血管内皮细胞生长因子已被证明通过与其酪氨酸激酶型受体flt-1和flk-1结合来提高血管通透性(Risau等人，1998年;Gale和Yancopoulos 1999)导致内皮细胞间连接紊乱(Kevil等人，1998年). 因此，研究这些受体的激活是否以及如何调节claudin-5/TMVCF将是一件有趣的事情。此外，分析claudin-5/TMVCF在各种病理状态下可能参与血管源性水肿和炎症的情况也很重要。沿着这些路线对claudin-5/TMVCF进行进一步的详细分析将有助于更好地理解血管通透性背后的分子机制。

致谢

我们感谢H.Yoshida博士和S.I.Nishikawa博士在小鼠胚胎的整体免疫染色方面的技术帮助。我们也要感谢我们实验室（京都大学医学院细胞生物学系）的所有成员进行了有益的讨论。盛田佳彦感谢Y.Miyachi教授（京都大学医学院皮肤科）有机会在细胞生物学系工作。

这项研究得到了日本教育、科学和文化部癌症研究补助金和科学研究补助金（a）的部分支持。

在证明中添加注释。位置克隆已鉴定出克劳丁家族的一个新成员（副细胞素-1），其突变可导致人类遗传性肾低镁血症（Simon，D.B.，Y.Lu，K.a.Choate，H.Velazquez，E.Al-Sabban，M.Praga，G.Casari，a.Bettinelli，G.Colussi，J.Rodriguez-Soriano，et Al.1999）。副细胞蛋白-1，一种副细胞镁所需的肾紧密连接蛋白2+再吸收。科学. 285:103–106). 这种新的克劳丁物种将被称为克劳丁-16。

脚注

1.本文中使用的氨基酸：aa，氨基酸（s）；血脑屏障；E面、细胞外面；谷胱甘肽S-转移酶；pAb，多克隆抗体；血小板内皮细胞粘附分子；P面，原生质面；TJ，紧密连接；腭心面部综合征中跨膜蛋白缺失的TMVCF；VE钙粘蛋白，血管内皮钙粘蛋白

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《细胞生物学杂志》的文章由洛克菲勒大学出版社

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