摘要
促凋亡蛋白BAX在其COOH末端包含一个预测的跨膜结构域。 在未受刺激的细胞中,BAX位于胞浆中,与包括线粒体在内的细胞膜外周联系,但在死亡信号后插入线粒体膜。 这种在没有死亡信号的情况下插入线粒体膜的失败与NH对BAX跨膜信号锚定功能的抑制有关 2 -终端域。 靶向可以通过删除结构域或用BCL-2的跨膜片段取代BAX跨膜片段来实现。 在受刺激细胞中,NH的作用 2 BAX末端与蛋白膜插入后该结构域的进一步暴露相关。 肽基半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂zVAD-fmk部分阻断体内BAX的受刺激线粒体膜插入,这与凋亡细胞提取物支持体外BAX的线粒体靶向性的能力一致,依赖于半胱氨酸蛋白酶的激活。 综上所述,我们的结果表明,BAX对线粒体的调节靶向是由BAX多肽中的离散结构域介导的,以响应死亡信号。 一个或多个半胱天冬酶的作用可能反映了这种调节靶向的启动和/或放大。
关键词: 凋亡、BAX、细胞色素c、半胱氨酸天冬氨酸酶、线粒体
T型 他 后生动物细胞对凋亡死亡信号的反应取决于细胞中各种调节检查点的状态。 其中最突出的是BCL-2蛋白家族,其成员包括显性抑制因子(Ced-9、BCL-2、BCL-X L(左) 、BCL-w、A1、MCL-1)和促凋亡诱导物(BAX、BAK、BCL-X 秒 )以及BCL-2/BCL-X促凋亡抑制剂 L(左) 功能(BAD、BID; Yang和Korsmeyer,1996年 ). 这些家族成员之间的关系是复杂的,而在BCL-2抑制剂和BAX诱导剂的情况下,由于它们在调节细胞死亡方面具有明显的自主功能,因此更加复杂( Cheng等人,1996年 ; Knudson和Korsmeyer,1997年 )同时通过异二聚体相互作用影响彼此的活动( Oltvai等人,1993年 ). BCL-2抑制剂在胱天蛋白酶死亡效应物(如胱天蛋白酶-3)上游发挥作用,抑制细胞死亡( Boulakia等人,1996年 ; Chinnaiyan等人,1996年 ; Armstrong等人,1996年 )这可能通过多种方式实现。 其中包括Ced-4样分子的募集和调节( 沙哈姆和霍维茨,1996年 ; Wu等人,1997年 ; Chinnaiyan等人,1997年 ; Spector等人,1997年 ; James等人,1997年 )和类似Ced-4的适配器( Chinnaiyan等人,1997年 ; Ng和Shore,1998年 )激活启动子半胱天冬酶和激酶招募所必需的( Wang等人,1996年 )和磷酸酶( Shibaski等人,1997年 )可能调节BCL-2相关复合物的活性。 此外,BCL-2复合物的调节可能会影响离子导电孔的形成( Minn等人,1997年 ; Schendel等人,1997年 ; Schlesinger等人,1997年 )或BCL-2所在膜的通道活性。 虽然BAX可能通过异二聚体调节影响所有这些BCL-2介导的事件,但BAX也能够在脂质双层中自主形成孔隙( Schlesinger等人,1997年 ; Antonson等人,1997年)。 体内BAX或BAK水平升高在没有任何额外信号的情况下引发细胞死亡的能力( Xiang等人,1996年 ; McCarthy等人,1997年 ; Rossé等人,1998年 )与严重的细胞内膜功能障碍相关,包括线粒体细胞色素c向胞质溶胶的重新分布和诱导的线粒体通透性转变。
大多数BCL-2和BAX家族蛋白在其COOH末端包含一个预测的跨膜片段(TM) 1 在BCL-2的情况下,TM起信号锚的作用,靶向蛋白质并将其插入N 细胞 -C类 在里面 该蛋白定位于两个主要的膜位置:线粒体外膜和内质网/核膜( Hockenbery等人,1990年 ; Krajewski等人,1993年 ; Nguyen等人,1993年 ; Nguyen等人,1994年 ). 然而,令人惊讶的是,BAX转移到膜部位(包括线粒体)的能力在某些情况下受到调节,并取决于细胞接收到死亡信号( Hsu等人,1997年 ; Wolter等人,1997年 ). 在缺乏这种信号的情况下,BAX被发现游离于胞浆或与胞内膜表面相关的外周。 尽管BAX或BAK的调节靶向机制尚待阐明,但短暂过度表达( Xiang等人,1996年 ; Rossé等人,1998年 )或强制二聚( Gross等人,1998年 )在缺乏其他信号的情况下,蛋白的表达可能导致细胞死亡,这意味着在某些情况下,调控机制可能被推翻。
在这里,我们证明靶向线粒体的BAX可以由zVAD敏感性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶调节。 值得注意的是,在没有死亡信号的情况下防止BAX靶向已经映射到分子的两个区域:NH 2 -ART末端结构域和COOH末端TM。我们的结果表明,死亡信号可导致BAX易位到线粒体,并在线粒体中介导和放大膜功能障碍(综述于 里德,1997年 ; 亨加特纳,1998年 ).
材料和方法
免疫细胞化学
将FL5.12细胞重新悬浮在含有400 nM Mitotracker Green FM(Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR)的新鲜培养基中。 培养15分钟后,将细胞清洗并固定在3%的多聚甲醛中,并用2%的正常山羊血清进行封闭(加利福尼亚州伯林盖姆Vector Labs,Inc.)。 抗-mBAX(P-19)抗体( 圣克鲁斯生物技术 ,Santa Cruz,CA)和Cy3山羊抗兔抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA)用于检测BAX免疫反应性。 Nuclei用Hoechst复染 H33258号 (1μg/ml)。 使用 蔡司 Axioskop荧光显微镜和MC 100相机附件。 共焦激光扫描使用Sarastro 2000共焦激光扫描仪(Molecular Dynamics,Inc.,Sunnyvale,CA)和Image Space软件(Moleculer Dynamics)进行。
质粒
采用标准的重组DNA操作,在T7启动子控制下,在pBluescript SK中构建编码小鼠BAXΔ1-19的cDNA; 由此产生的翻译产物有一个起始的蛋氨酸,位于全长BAX构建物的原始蛋氨酸下游20个氨基酸。 在Bluescript SK中通过PCR创建编码DHFR-BAX™的cDNA,并编码与BAX的COOH末端23个氨基酸(aa 169–192)融合的小鼠二氢叶酸还原酶。 同样,BAX-BCL-2™是通过将BAX的1-168氨基酸与人类BCL-2的218-239氨基酸融合而产生的。
大鼠心脏线粒体
将一只雄性Sprague-Dawley大鼠的心脏(约250 g)置于冰上约100 ml HIM缓冲液(0.2%wt/vol BSA,200 mM甘露醇,70 mM蔗糖,10 mM Hepes-KOH,1 mM EGTA,pH 7.5)中,挤压数次以挤出血液,并在15 ml芯管中转移至7.5 ml HIM。 所有后续步骤均在4°C下进行。 用Polytron均质器(Brinkmann Instruments Canada Ltd.,Mississauga,ON,Canada)将心脏均质化,在6.5的设置下运行1s。 在索瓦尔SS34转子中,以1800 rpm的转速造粒细胞核和未破碎细胞10分钟。 上清液以7000 rpm离心10 min。 所得颗粒在HIM(减去BSA)中再次悬浮,以1800 rpm离心,以7000 rpm收集线粒体。 将线粒体颗粒重悬于cMRM(250mM蔗糖,10mM Hepes KOH,1mM ATP,5mM琥珀酸钠,0.08mM ADP,2mM K 2 高性能操作 4 pH7.5),并在使用前调整为1 mM二硫苏糖醇。
培养细胞的线粒体
收集细胞,用PBS洗涤两次,悬浮在2 ml HIM中,然后在6.5的设置下进行Polytron均质化四次,每次10 s。 然后根据大鼠心脏方案分离线粒体。
体外靶向线粒体蛋白
cDNA在 35 无细胞兔网织红细胞裂解物系统中的S-蛋氨酸( Promega公司。 (威斯康星州麦迪逊市)。 对于标准线粒体蛋白导入反应,5μl翻译反应与20μl缓冲液a(20 mM Hepes-KOH,10 mM KCl,2.5 mM MgCl)孵育 2 在30°C或37°C条件下,1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 m M二硫苏糖醇、pH 7.5)和25μl线粒体或有丝分裂体在cMRM(1 mg蛋白质/ml)中的培养30分钟至2小时。然后将导入反应分层在1×MRM(250 mM蔗糖、10 mM Hepes-KOH,pH 7.5)的500μl缓冲垫上,并在4°C的微型离心机中以最高速度离心4分钟。 对于碱提取,将线粒体颗粒重新悬浮在新制备的0.1 M Na中(0.25 mg蛋白质/ml) 2 一氧化碳 三 pH 11.5,并在冰上培养30分钟。 然后在气浮机中对膜进行造粒( 贝克曼仪器 加拿大公司,蒙特利尔,PQ,加拿大)在30 psi的压力下运行10分钟。 通过SDS-PAGE和荧光图谱对沉淀进行分析。 对于包括凋亡细胞提取物(见下文)的导入分析,它取代了缓冲液A; 用于进行提取的缓冲区(缓冲区A/ext)不影响导入。
凋亡细胞提取物
根据以下程序在4°C下制备提取物 Liu等人(1996) 做了一些小修改。 简而言之,在含有1.3 mM柠檬酸钠和0.6 mM EDTA的PBS中采集人类KB上皮细胞。 在缓冲液A/ext(50 mM管道、50 mM KCl、5 mM EGTA、2 mM MgCl)中清洗细胞颗粒 2 ,1 mM二硫苏糖醇,20μM细胞松弛素B,pH 7.4),然后重新悬浮在等体积的缓冲液A/ext中。用装有B杵的惠顿玻璃均质器将细胞分为五个冷冻-解冻周期和五个冲程,然后在10 5
克 在Beckman Ti75转子中放置1小时。 所得上清液含有10mg蛋白质/ml。为了耗尽细胞色素c的上清液( Liu等人,1996年 )首先将40μl 2G8.B6抗细胞色素c抗体(7.7 mg蛋白/ml)与100μl蛋白a和蛋白G Sepharose的1:1混合物在200μl PBS中在4°c下再次悬浮4小时。 对于对照反应,用40μl缓冲液A代替抗体。 收集珠子,用缓冲液A洗涤,然后在4°C下与125μl KB细胞提取物孵育18 h。 回收珠子并收集上清液。
PARP裂解
KB凋亡细胞提取物(50-100μg蛋白质)与1mM dATP在最终体积为20μl的缓冲液a中于30°C下孵育1小时 35 添加由兔网织红细胞裂解物中的转录翻译衍生的S-蛋氨酸标记的PARP。 在30°C下15 min后,添加5μl 5×SDS样品缓冲液,并通过SDS-PAGE和荧光法分析12.5μl每种反应的等分样品。
结果
BAX在体内死亡刺激后整合到线粒体膜
FL5.12造血细胞的免疫细胞化学分析显示BAX与线粒体相关,并分布在细胞质和核周区域(图。 1 ). 当通过免疫印迹分析时,从这些细胞中分离的线粒体部分显示存在BAX以及BCL-2、细胞色素c氧化酶亚基iv和细胞色素c(图。 2
A类 ,条车道 1 和 2 ). 与BCL-2相反,BCL-2由于整合到膜脂双层中,因此在碱性pH条件下不易萃取( Nguyen等人,1993年 ; Nguyen等人,1994年 ),大多数BAX在相同条件下被释放(图。 2
A类 ,条车道 三 和 4 ; 图。 2
C ,条车道 1 和 5 ),表明与细胞器的外围联系( Fujiki等人,1982年 ). 退出IL-3诱导细胞死亡后( Hockenbery等人,1990年 )然而,这种情况发生了逆转,大多数BAX现在获得了对碱性萃取的抗性(图。 2
A类 ,条车道 5–8 ; 图。 2
C ,条车道 三 和 7 ). 正如预期的那样,细胞色素c在碱性提取时被释放,而BCL-2和细胞色素c氧化酶亚基iv被保留,并且这些分布不受死亡刺激的影响(图。 2
A类 ). 因此,我们得出结论,BAX在体内表现出对死亡信号的特异性反应,从膜周边位置移动到膜整合位置。
图1。
BAX的亚细胞分布。 BAX免疫反应定位于FL5.12细胞中的线粒体、核周膜和胞浆。 用兔抗BAX(P-19)抗体和山羊Cy3抗兔Ig抗体对FL5.12细胞进行免疫荧光共聚焦显微镜观察,发现细胞呈点状和弥散型胞浆免疫反应( A类 ). MitoTracker绿色调频显示独家点状标签( B类 ). BAX和MitoTracker标记的双重暴露揭示了BAX与线粒体的共定位( 黄色的 )以及非线粒体BAX免疫反应( 红色 ; C ). 抗BAX(P-19)免疫反应性(Cy3)和Hoechst的常规荧光检测 H33258号 细胞核染色显示红色细胞质BAX免疫反应性,蓝色细胞核Hoechst染色和粉红色核周信号,两种反应重叠( D类 ).
图2。
线粒体BAX在死亡刺激后改变其碱性和蛋白酶敏感性。 ( A类 )BAX在死亡刺激后变得耐碱。 从IL-3(lanes)培养的FL5.12细胞中制备富含线粒体的厚膜 1–4 )或剥夺IL-3 12小时(车道 5–8 ),在等渗缓冲液中孵育(泳道 1 和 2 和车道 5 和 6 ),或0.1 M Na 2 一氧化碳 三 ,pH 11.5(车道 三 和 4 和车道 7 和 8 ),并在200000下离心 克 45分钟以产生上清液( S公司 )和颗粒( P(P) ). 通过免疫印迹分析组分的BAX、BCL-2、细胞色素c氧化酶亚基iv和细胞色素c( B类 )NH公司 2 -BAX末端在死亡刺激后进一步暴露。 从IL-3(通道)中FL5.12细胞制备的线粒体部分 1 和 2 和车道 6 和 7 )或剥夺IL-3 12小时(车道 3–5 、和车道 8–10 )在等渗缓冲液中培养,并用胰蛋白酶(30μg/ml;lanes)处理 2, 4, 和 5 )或蛋白酶K(100μg/ml; 保护 . K(K) ,条车道 7, 9, 和 10 ),在4°C下保持20分钟。 通过添加30倍重量过量的大豆胰蛋白酶抑制剂使胰蛋白酶失活,并用苯基甲基磺酰氟(1mM)使蛋白酶K失活。 用抗BAX 651抗体(氨基酸43–61;lanes)进行免疫印迹分析 1–4 和车道 6–9 )或抗BAX N20抗体(氨基酸11–30; 圣克鲁斯生物技术 ; 车道 5 和 10 ). ( C )zVAD-fmk减少IL-3退出后BAX的线粒体膜整合。 由IL-3(通道)中保存的FL5.12细胞制备的线粒体部分 1, 2, 5, 和 6 )或剥夺IL-3 12小时(车道 3, 4, 7, 和 8 )不在(车道 1, 3, 5, 和 7 )或存在(车道 2, 4, 6, 和 8 )对50μM zVAD-fmk进行12小时的直接分析(车道 1–4 )或用0.1 M Na萃取后 2 一氧化碳 三 ,pH 11.5(车道 5–8 ),如中所述 A类 .
值得注意的是,在IL-3退出后,BAX整合到线粒体膜中,在NH极限时也伴随着明显的变化 2 蛋白质的末端。 在分离的线粒体中,BAX分子的这一区域现在可以通过外源性胰蛋白酶或蛋白酶K进行有限的蛋白水解,这可以通过切割产物对针对BAX的氨基酸11-30的抗体(N20)的免疫反应性丧失来揭示(图。 2
B类 ). 另一方面,剩余的抗蛋白酶BAX片段保留了对针对氨基酸43–61的抗体(651)的免疫反应性。
最后,广谱半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂zVAD-fmk部分阻断了BAX在FL5.12细胞中的整合,以响应IL-3从细胞中提取12 h。 然而,抑制剂并没有显著影响与线粒体相关的BAX总量的恢复(图。 2
C ,条车道 三 和 4 ),它减少了与细胞器一起回收的抗碱性膜整合BAX的数量(图。 2
C ,条车道 7 和 8 ). 这表明半胱氨酸天冬氨酸酶(caspases)在体内刺激BAX的线粒体膜整合,caspases在IL-3撤除后被激活。
凋亡细胞提取物体外刺激靶向线粒体的BAX
为了在体外检测BAX靶向线粒体,我们使用 35 S标记的转录-翻译产物 行李 兔网织红细胞裂解物中的cDNA与大鼠心脏分离的完整线粒体结合。 这是一个有充分记录的系统,它忠实地反映了不同线粒体蛋白质的体内输入,包括将完整蛋白质插入线粒体外膜( 李和肖,1992年 ; McBride等人,1992年 ). 图中总结了用于这些分析的各种BAX结构及其体外靶向能力。 三 .
图3。
BAX构建物及其体外线粒体靶向能力。 ART域( 灰色方框 ); TM(TM)( 黑匣子 ); +, 目标能力;−, 瞄准能力不足。 显示了所示物种BAX的1–20氨基酸。 有关其他详细信息,请参阅文本。
转录-翻译 行李 cDNA产生全长蛋白,以及一个显著的小约2 kD的产物,明显来自内部翻译起始,导致NH 2 -终端截断BAX(指定BAXΔART)。 然而,只有截短的BAXΔART是膜整合的,这是根据在碱性pH条件下获得的抗萃取性来判断的(图。 4
A类 ; 比较车道 2 和 5 ). 该产品的插入对温度敏感; 它发生在30°C,而不是4°C(图。 5 ,条车道 2–5 ),表示膜整合,而不是紧密但非特异性的结合( McBride等人,1992年 ). 对BAX序列的检查显示,密码子位置20处存在一个内部蛋氨酸(图。 三 ). 通过删除密码子1实现了met密码子20的强制翻译起始,该密码子产生的产物在SDS-PAGE中与BAXΔART结合,并证明了温度敏感性膜整合(图。 4
B类 ). 因此,我们得出结论,全长BAX的1-19位氨基酸含有一个被称为ART的结构域,该结构域是将BAX保留在膜插入不合格状态所必需的。 该结构域富含甘氨酸和羟基氨基酸残基(图。 三 ).
图4。
凋亡细胞提取物支持BAX体外靶向线粒体。 ( A类 ) 35 S标记的转录翻译产物 行李 将兔网织红细胞裂解物(BAX和BAXΔART)中的cDNA与来自大鼠心脏的纯化完整线粒体进行孵育,在标准蛋白导入反应中添加1 mM dATP(lanes 3, 4, 6, 和 7 )或1 mM dATP和200μg凋亡胞浆蛋白( 提取 ; 车道 4 和 7 )体积为50μl。 反应结束时,通过离心法回收线粒体,直接或用0.1M Na萃取后,通过SDS-PAGE和荧光照相法分析颗粒 2 一氧化碳 三 ,pH 11.5( 碱性 ; 车道 5–7 ). 车道 1 ,输入翻译产品的10%。 ( B类 )如中所示 A类 除了进口是用 行李Δ1-19 cDNA转录产物(lane 2 )如图所示,在4°C或30°C下,用0.1M Na提取线粒体后进行分析 2 一氧化碳 三 ,pH 11.5(车道 4 和 5 ). ( C ) 35 S标记的转录-翻译产物 帕普 网织红细胞裂解物(5%体积)中的cDNA与(lanes)孵育 2 和 三 )或不带(车道 1 )100μg凋亡细胞溶质蛋白,总体积为20μl,存在(lane 三 )或不在(车道 1 和 2 )对1 mM dATP和等效部分的PARP 24-kD裂解产物的外观进行分析( 24K帕尔普 )通过12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光成像。 ( D类 )如中所示 A、, 除进口前外,线粒体均用0.4mg/ml胰蛋白酶和50倍重量的大豆胰蛋白酶抑制剂处理(− 胰蛋白酶前体 ; 柱 2 和 4 )或者在最后(+ 胰蛋白酶前体 ; 柱 1 和 三 )反应的结果。 通过离心收集线粒体,并在存在的情况下导入(柱 三 和 4 )或不存在(列 1 和 2 )凋亡细胞溶质( 提取 ),并测定了碱不溶性全长BAX的相对量(最大设置为100)。
图5。
BAX体外靶向线粒体的失败取决于BAX TM.编码BAX的cDNA 2–5 ),细胞溶质二氢叶酸还原酶在其COOH末端与BAX的169–192氨基酸融合( DHFR-BAX公司 ™,车道 7–10 )和BAX,其中COOH末端24个氨基酸被BCL-2的相应结构域(氨基酸218-239)取代( BAX-BCL-2型 ™,车道 12–15 )在网织红细胞裂解物中转录和翻译 35 用SDS-PAGE和荧光法分析S-标记的碱不溶性线粒体输入产物。 车道 1, 6, 和 11 如图所示,占输入翻译产品的10%。 显示了BAX的COOH端24个氨基酸和BCL-2的22个氨基酸的序列(单字母代码); 粗体字母表示预测的TM。
重要的是,通过向导入的反应混合物补充KB上皮细胞产生的凋亡细胞提取物,克服了全长BAX体外靶向线粒体的无能。 该提取物的制备方法如下 Liu等人(1996) 以及涉及细胞在低渗介质中的冷冻/解冻和均质循环,导致线粒体肿胀,并因外膜破裂而导致细胞色素c释放。 由此产生的高速细胞溶质上清液含有内源性前蛋白酶,其激活可通过添加dATP并在37°C下培养提取物来实现,从而导致caspase-3死亡底物聚ADP-核糖基聚合酶(PARP)的诊断性裂解; Liu等人,1996年 ). 这种提取物在导入反应中的存在刺激了结合(图。 4
A类 ,条车道 三 和 4 )以及全长BAX(车道)的耐碱膜插入 6 和 7 ),但未刺激BAXΔART插入(车道 6 和 7 ). 在这些完整的线粒体(未显示)中,膜整合的BAX可被外源胰蛋白酶所利用,表明其插入了外膜。 细胞提取物的凋亡活性通过证明其产生PARP 24-kD凋亡片段以响应dATP的能力而得到验证( Liu等人,1996年 )(图。 4
C ). 非凋亡的高速细胞液不刺激BAX的输入,也不支持PARP的裂解(未显示)。 此外,在缺乏凋亡提取物(未显示)的情况下,BAX未能靶向有丝分裂体(线粒体部分或全部剥离外膜),这表明不能用完整的外膜构成屏障来解释为什么不能导入BAX。 最后,用胰蛋白酶对完整的线粒体进行预处理,以消除随后对凋亡提取物的反应中全长BAX的膜插入(图。 4
D类 ),表明插入依赖于暴露在细胞器表面的蛋白质。
体外调节BAX靶向需要ART和TM域
结果如图所示。 4 证明通过删除NH可以绕过体外靶向BAX的凋亡调节 2 -末端ART结构域,导致蛋白质的结构性靶向。 同样,用单体报告蛋白二氢叶酸还原酶(DHFR-BAX™)替换BAX的整个细胞溶质部分(氨基酸1–168),可以在没有凋亡细胞提取物的情况下导入完整线粒体的外膜, 如碱性pH条件下耐萃取性的温度敏感性采集所示(图。 5 ,车道 6–10 ). 这表明BAX TM可以作为一个信号锚定序列发挥作用,在适当的环境下,该序列在靶向和膜插入方面独立活跃。 它还表明,ART直接或间接地阻止了BAX TM在全长BAX分子背景下的这种信号锚定功能的表现。 然而,重要的是,将含有TM的全长BAX的COOH末端22氨基酸替换为BCL-2的相应TM结构域,现在允许靶向先前的膜插入-无能的BAX(图。 5 ,条车道 11–15 ). 因此,BAX在体外不能靶向线粒体的机制需要在分子中存在特定的BAX TM以及NH 2 -终端ART域。
BAXΔART和BAX-BCL-2™表现出增强的细胞毒性
荧光素酶报告子作为COS-7和CHO细胞存活指标的联合转染实验( Ng等人,1997年 ),血凝素表位(HA)-BAXΔART或HA-BAX-BCL-2™的表达导致荧光素酶活性比转染后24小时用HA-BAX获得的荧光素酶活性低三到五倍(未显示)。 此外,当用抗HA抗体进行免疫荧光显微镜分析时,在24小时时,7.5%的细胞表达HA-BAX,而<1%的细胞表达微弱的HA-BAXΔART(未显示),表明大多数表达HA-BAX-ART的细胞之前已经死亡。 因此,与体内HA-BAX相比,HA-BAXΔART的细胞毒性增强与体外ART结构域抑制BAX膜整合有关。
细胞提取物刺激BAX靶向需要细胞色素c并被zVAD-fmk抑制
当检测补充有dATP的高速凋亡细胞液在体外支持全长BAX靶向线粒体的能力时,观察到明显的剂量依赖性刺激(图。 6
A类 ). 值得注意的是,通过提供额外的细胞色素c(通道)没有改善BAX的线粒体膜插入 6–9 ). 未评估凋亡提取物中核苷酸辅因子的需求,因为在半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活中可以替代dATP的ATP通常是线粒体蛋白导入所必需的。 在添加dATP并在37°c下孵育之前,通过免疫吸附从高速细胞液中耗尽细胞色素c(图。 6
B类 , 左边 )另一方面,抑制提取物支持BAX靶向的能力(图。 6
B类 , 中间的 ,比较车道 4 和 6 )和PARP解理(图。 6
B类 , 正确的 ,比较车道 三 和 6 ); 当细胞色素c重新添加到提取物中时,这两个事件都恢复了(图。 6
B中间 和 正确的 ; 比较车道 6 和 7 ). 此外,提取物中至少还需要一个其他因子来对BAX靶向线粒体的细胞色素c依赖性调节,因为仅用细胞色素c补充网织红细胞裂解物翻译混合物无法刺激BAX靶作用(未显示)。 与此相一致,也与细胞色素c在启动caspase级联激活中的作用相一致( Li等人,1997年 )半胱天冬酶的广谱抑制剂zVAD-fmk( 朱等人,1995年 )发现,可有效抑制由凋亡高速胞质溶胶支持的BAX靶向作用(图。 6
C、 左 ; 比较车道 三 和 4 )浓度降低了提取物驱动PARP裂解的能力(图。 6
C、 右 ; 比较车道 2 和 三 ).
图6。
凋亡的高速细胞液在体外支持BAX靶向线粒体的能力依赖于细胞色素c,并被zVAD-fmk抑制。 ( A类 ) 35 BAX cDNA的S标记转录翻译产物在0(lanes)存在的情况下进行体外线粒体导入 2 和 6 ),13(车道 三 和 7 ),65(车道 4 和 8 )或260(车道 5 和 9 )μg凋亡高速cytrosolic蛋白( 提取 )带(车道 6–9 )或不带(车道 2–5 )添加细胞色素c( 细胞色素C ; 75μg/ml),并在SDS-PAGE和荧光成像后观察耐碱产品。 车道 1 ,输入翻译产品的10%。 ( B类 ; 左边 )通过免疫吸附从凋亡细胞提取物中去除细胞色素c( Cyt C减去提取物 )使用小鼠单克隆2G8.B6抗体( 米勒和杰默森,1996年 )如前所述( Liu等人,1996年 ). 之前提取物的等效等分试样(泳道 1 )和之后(车道 2 )用小鼠抗细胞色素c单克隆抗体7H8.2C12进行免疫印迹分析( Liu等人,1996年 )、和通过增强化学发光显示。 ( 中部 )BAX翻译产物的膜插入是通过在pH 11.5下的抗萃取性来测定的,按照 A类 如图所示,在存在或不存在凋亡细胞液的情况下,细胞液在添加dATP和37°c孵育之前,已经或没有用抗细胞色素c进行免疫吸附或补充细胞色素c。 ( 赖特 )如图所示,在所示的条件下,测定相同凋亡细胞液生成PARP 24-kD凋亡裂解产物的能力。 4 . ( C )凋亡的高速胞浆支持BAX膜插入的能力 2–4 ; 左边 )和PARP裂解( 正确的 )按中的方法进行分析 A类 在存在或不存在50μM四肽zVAD-fmk的情况下,在加入dATP并在37°C下孵育之前,从溶解在二甲基亚砜中的100倍浓缩原液中递送zVAD-fmk。 该溶剂的当量体积对BAX进口没有影响( 左边 ,车道 三 ).
讨论
在体内,BAX被抑制插入靶膜,包括线粒体,直到细胞收到死亡信号。 同样,在兔网织红细胞翻译系统中合成的BAX在体外不能靶向线粒体。 在这种重组线粒体输入反应中未能靶向取决于BAX多肽中的两个区域:NH 2 -末端ART结构域和COOH-末端TM。值得注意的是,TM作为信号锚,是靶向并插入线粒体外膜所必需的。 然而,在正常条件下,这种信号锚活性的表现受到抑制,不仅取决于信号锚本身的性质,还取决于NH 2 -终端ART域。 正如预期的那样,ART结构域的缺失增强了体内BAX的细胞毒性,这与体外细胞膜整合的刺激有关。 虽然刺激BAX靶向的潜在机制尚待阐明,但值得注意的是,体内蛋白的过度表达会导致细胞死亡( Xiang等人,1996年 ; Rossé等人,1998年 ). 例如,这与BAX靶向饱和抑制剂的存在是一致的。 有趣的是,NH 2 BAX在体内膜插入后,包括ART结构域在内的末端进一步暴露(图。 2
B类 ).
向培养细胞传递不同的死亡信号后( Hsu等人,1997年 ; Wolter等人,1997年 ),BAX移动到线粒体和其他膜位点,并触发线粒体功能的灾难性转变。 这种转化包括将细胞色素c释放到周围的细胞液中,产生活性氧,跨膜电位丧失,以及诱导线粒体通透性转变( Xiang等人,1996年 ; Rossé等人,1998年 ),导致凋亡细胞死亡的事件( 里德,1997年 ; 克罗默,1997年 ). 值得注意的是,BCL-2蛋白有可能在多个水平上干预和阻止BAX诱导的事件,包括阻止死亡信号后BAX的重新分布( Gross等人,1998年 ),与线粒体BAX异二聚( Oltvai等人,1993年 )和抑制细胞色素c释放( Kluck等人,1997年 ; Yang等人,1997年 )和细胞色素c介导的下游通路的拦截( Li等人,1997年 ; Rossé等人,1998年 ; Zhivotovsky等人,1998年 ; Pan等人,1998年 ).
鉴于zVAD-fmk部分阻断BAX插入线粒体膜以响应体内死亡信号的事实(图。 2
C ),我们检测了凋亡细胞溶质提取物( Liu等人,1996年 )具有激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶级联反应的潜力,及其对体外靶向线粒体的BAX的影响。 此前对这种提取物的分析导致在哺乳动物细胞中发现了核心半胱氨酸蛋白酶激活复合物,其中细胞色素c和核苷酸辅因子dATP/ATP( Liu等人,1996年 )与Ced-4同源物Apaf-1相互作用( Zou等人,1997年 ),使其招募并激活启动子procasase-9。 Caspase-9反过来处理procasase-3( Li等人,1997年 ). 当这种提取物在体外添加到含有BAX的网织红细胞裂解液中时,靶向性和线粒体膜整合受到刺激。 这种刺激活性取决于培养期间这些提取物中存在的细胞色素c,以激活caspase,并被广谱caspase抑制剂zVAD-fmk阻断。 鉴于目前的模型表明BAX启动线粒体释放细胞色素c(参见 Jürgensmeier等人,1998年 )然而,这些发现出乎意料。 因此,一种可能性是,这里描述的体外重建系统反映了放大BAX靶向性的机制。 在这种情况下,靶向线粒体的BAX可能由信号转导事件启动; BAX,由于其成孔特性( Schlesinger等人,1997年 )然后触发细胞色素c的释放和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活,从而裂解调节BAX靶向性的蛋白质(例如,它使BAX靶向性抑制剂失活或激活诱导剂)。 该模型与zVAD-fmk在体内对BAX刺激性膜整合的部分抑制作用相一致。
或者,低水平细胞色素c的释放可能由BAX非依赖性事件启动,可能涉及线粒体的受控肿胀和外膜的局部破裂(Vander Heiden等人,1997年)。 这种释放反过来会导致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活、BAX靶向的刺激以及随后通过BAX介导的过程放大细胞色素c的释放。 在BAX靶向线粒体之前,外膜的有限破裂可能会导致一种后果,这与蛋白质最终目的地的选择有关。 在这种情况下,BAX可能接触并直接影响内外膜。 然而,无法进入内膜并不能解释BAX在没有死亡信号的情况下不能靶向线粒体,因为在没有凋亡细胞液的情况下,有丝分裂体不会插入BAX(未显示)。
总之,我们发现一种或多种zVAD敏感性半胱天冬酶的激活刺激BAX靶向线粒体,可能是通过直接或间接影响控制BAX膜插入的调节因子的活性。 BAX的监管目标取决于NH 2 -BAX分子中的ART末端结构域和COOH末端TM。 然而,这些结构域是否介导BAX与控制靶向性的细胞溶质或膜蛋白的物理结合,或者它们是否易受其他形式的调控,还有待确定。
致谢
这项工作得到了加拿大国家癌症研究所和医学研究委员会以及CA49712的运营资助。 J.N.Lavoie和A.Gross分别获得了医学研究理事会和欧洲分子生物学组织的博士后奖学金。
本文中使用的缩写
哈
血凝素表位
PARP项目
聚(ADP核糖基)聚合酶
TM(TM)
跨膜段
脚注
将所有信件寄给Gordon C.Shore,加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学麦金太尔医学科学大楼生物化学系H3G 1Y6。 电话:(514)398-7282。 传真:(514)398-7384。 电子邮件: shore@med.mcgill.ca公司
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