摘要
我们在不同的细胞系中表达了与绿色荧光蛋白(GFP)融合的蛋白激酶C(γ-PKC)γ亚种,并在共焦激光扫描荧光显微镜下观察了该融合蛋白在活细胞中的运动。 γ-PKC-GFP融合蛋白的酶学性质与天然γ-PKC非常相似。 在瞬时转染COS-7细胞的细胞质中观察到γ-PKC-GFP的荧光。 活性佛波酯(12- 哦 -十四烷基佛波醇13-醋酸盐[TPA]),但不通过非活性佛波醇酯(4α-佛波醇12,13-双癸酸酯)诱导γ-PKC-GFP从细胞质到质膜的显著移位。 A23187,a加利福尼亚州 2+ 与TPA相比,离子载体诱导的γ-PKC-GFP易位更快。 A23187诱导的移位被细胞外和细胞内钙的消除所消除 2+ TPA诱导的γ-PKC-GFP易位是单向的,而Ca 2+ 离子载体诱导的易位是可逆的; 也就是说,γ-PKC-GFP转位到膜上,回到细胞液中,最后在质膜上堆积成斑点状。 为了研究γ-PKC的C1和C2结构域在易位中的意义,我们表达了突变的γ-PKC-GFP融合蛋白,其中C1区的两个富含半胱氨酸的区域被破坏(命名为BS 238)或C2区被删除(BS 239)。 BS 238突变体被Ca转位 2+ 电离层,但不通过TPA。 相反,BS239突变体通过TPA易位,而不是通过Ca易位 2+ 电离层。 为了检测生理条件下γ-PKC-GFP的易位,我们将其表达在NG-108细胞中, N个 -甲基- d日 -天冬氨酸(NMDA)受体-转染COS-7细胞或表达代谢型谷氨酸受体1的CHO细胞(CHO/mGluR1细胞)。 在NG-108细胞中,K + 去极化诱导γ-PKC-GFP快速易位。 在NMDA受体转染的COS-7细胞中,应用NMDA加甘氨酸也能转位γ-PKC-GFP。 此外,在CHO/mGluR1细胞中,在受体刺激下观察到γ-PKC–GFP的快速易位和顺序再翻译。 细胞松弛素D和秋水仙碱均不影响γ-PKC-GFP的易位,表明γ-PKC易位独立于肌动蛋白和微管。 γ-PKC-GFP融合蛋白是研究γ-PKC易位的分子机制以及γ-PQC在中枢神经系统中的作用的有用工具。
P(P) 蛋白质 激酶C(PKC), 1 磷脂依赖性丝氨酸/苏氨酸激酶家族至少有12个亚种,在各种细胞信号转导中起着重要作用( 西冢,1984年 , 1988 , 1992 ). 尽管PKC在各种组织中普遍表达,但中枢神经系统中却富含几种独特的PKC。 特别是,PKC的γ亚种(γ-PKC)仅存在于中枢神经系统,被认为参与许多神经元功能,包括神经可塑性和记忆的形成( 西冢,1986年 ; Abeliovich等人,1993年 一
, b条 ; 田中和西冢,1994年 ).
PKC同工酶根据调节域的不同分为三个亚家族:传统PKC(cPKC)、新型PKC(nPKC)和非典型PKC(aPKC)。 传统PKC在调节域中有两个共同区域,C1和C2。 C1区有两个富含半胱氨酸的环(锌指状基序),与二酰甘油(DG)或佛波酯相互作用( 西冢,1988 ; Ono等人,1989年 ). C2区介导钙结合( Ono等人,1989年 )并且仅存在于cPKC中( Ono等人,1988年 b条
)尽管最近在nPKC中报道了一个与C2区相关的区域,但这是一个钙非依赖性PKC( Parker和Dekker,1997年 ). cPKC(包括γ-PKC)的完全激活需要DG和钙。 C1区也存在于nPKC中,在aPKC中发现了一个富含半胱氨酸的环。
已知常规PKC和nPKCs的调节域包含C1,当被DG或佛波酯激活时,它们会从细胞质转移到颗粒部分( 卡夫等人,1982年 ). 因此,PKC的易位是这些酶是否被激活的良好标志。 尽管这一现象众所周知,但PKC易位的机制和生理意义尚未阐明。 通过传统的酶学或免疫组织化学方法,除了使用直接结合PKC的荧光探针进行研究外,不可能实时观察PKC在相同细胞和活态下的移位( Chen和Poenie,1993年 ). 此外,建议这些荧光化合物在高浓度下抑制PKC本身的活性。
为了解决这些问题,并直接观察γ-PKC在活细胞中的移位,我们制备了γ-PKC-与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白。 从水母中分离出的GFP 维多利亚多管发光水母 ,具有无额外底物和辅因子的荧光( Cubitt等人,1995年 ). 最近的研究表明,GFP是一种很好的候选分子报告蛋白,用于监测活细胞中蛋白质定位、基因表达和蛋白质运输的变化( Cubitt等人,1995年 ). 在这项研究中,我们使用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察和分析了γ-PKC-GFP融合蛋白的易位,使用了各种刺激,如佛波酯、Ca 2+ 电离层,K + 去极化和受体介导的刺激。
材料和方法
材料
A23187购自 钙生物化学 (加利福尼亚州拉霍拉)。 N个 -甲基- d日 -天冬氨酸(NMDA),12- O(运行)- 十四烷基佛波醇13-乙酸酯(TPA)和4α-佛波醇12,13-二癸酸酯(4α-PDD)购自 西格玛化学公司。 (密苏里州圣路易斯)。 (1S,3R)-1-氨基环戊烷-1,3-二羧酸( 反式 -ACPD)、2-氨基-8-磷酸(AP-5)和(RS)-α-甲基-4-羧苯基-甘氨酸([RS]-MCPG)均来自Tocris(英国布里斯托尔)。 尼卡地平(Nicardipine)和他司加净(thapsigargin)来自Wako Pure Chemical Ltd.(日本大阪)。 ω-芋螺毒素GVIA来自Peninsula Laboratories Inc.(加利福尼亚州贝尔蒙特)。 细胞分裂素D和秋水仙碱来自nacalai tesque(日本京都)。 所有其他化学品均为分析级。
细胞培养
COS-7和NIH3T3细胞购自理研细胞库(日本筑波)。 小鼠神经母细胞瘤×胶质瘤杂交细胞(NG 108-15细胞)来自T.Amano博士(日本东京三菱Kasei生命科学研究所)。 稳定表达代谢型谷氨酸受体1的CHO细胞(CHO/mGluR1细胞)( Tanabe等人,1992年 )这是Nakanishi博士(日本京都京都大学医学院生物科学系)赠送的礼物。 COS-7细胞在含有25mM葡萄糖的DME中培养,该DME用44mM NaHCO缓冲 三 并在含有5%CO的增湿大气中补充10%FBS 2 37°C时。 NG 108-15细胞在与COS-7细胞相同的条件下培养。 NIH3T3细胞在补充有10%小牛血清而不是FBS的DME中培养。CHO/mGluR1细胞按说明培养( Tanabe等人,1992年 ). 所有培养基均添加青霉素(100 U/ml)和链霉素(100μg/ml),所用的FBS未经热灭活。
γ-PKC-GFP融合蛋白质粒的构建
含有GFP cDNA的质粒(pGFP 10.1)由D.C.Prasher博士(纽约哥伦比亚大学)捐赠( Prasher等人,1992年 ). 以pGFP10.1为模板,通过PCR获得了编码GFP的cDNA片段,该片段在5′端具有HindIII位点,在3′端具有EcoRI位点。 所用的正、反义引物分别为5′-TTAAGCTTTATGGTGAGAGCCAGGAG-3′和5′-CCGAATTTACTGTACAGCTCCAT-3′。 从λCKRγ1的cDNA克隆中获得大鼠γ-PKC cDNA( Ono等人,1988年 一
). 用EcoRI消化后,将编码大鼠γ-PKC的插入片段亚克隆到哺乳动物细胞表达质粒pTB 701中( Ono等人,1988年 一
)(指定为BS 55)(图。 1 ). 以BS55为模板,PCR扩增出5′端有EcoRI位点,3′端有HindIII位点的γ-PKC cDNA片段。 所用的正义和反义引物分别为5′-TTGAAATTCATGGCGGGTCTGTCCTGG-3′和5′-TTSAAGTTATGGCGGGTCTGTCCTGG-3′。 GFP和γ-PKC的PCR产物一起亚克隆到pTB701(BS 186)的EcoRI位点(图。 1 ).
图1。
γ-PKC-GFP融合蛋白及其突变体的构建。 BS186是一种γ-PKC-GFP融合蛋白,其中γ-PKC(BS55)和GFP在γ-PKC-COOH末端结合。 在γ-PKC的C1区,有两个富含半胱氨酸的序列与DG或佛波酯(例如TPA)相互作用。 为了产生BS 238(C1突变),通过定点突变将两个富含半胱氨酸区域中的每个半胱氨酸残基替换为丝氨酸。 BS 238的C1区域不再显示结合佛波酯的活性( Ono等人,1989年 ). γ-PKC的C2区,Ca 2+ 如文中所述,为了生产BS 239(C2删除),删除了绑定域。
接下来,我们产生了一个编码突变γ-PKC-GFP的结构体,其C1区锌指样基序发生突变。 我们使用pTB966,一种含有突变C1区cDNA的质粒,作为PCR模板( Ono等人,1989年 ). 据报道,从pTB966中提取的蛋白质对TPA没有结合活性( Ono等人,1989年 ). 我们还产生了一个突变的γ-PKC–GFP构建体,其C2区被删除。 为此,使用pTB971作为PCR模板( Ono等人,1989年 ). 来自pTB971的蛋白质不再具有钙结合活性 2+ ( Ono等人,1989年 ). 以pTB966或pTB971为模板,用有义引物(5′-TTGGAATTCATGGCGGGTCTGTCCTGG-3′)和反义引物(5′-TTTGGATCCTGCGCTCTGCCAG-3′)进行PCR以获得含有C1和C2区域的cDNA片段。 这些PCR产物用EcoRI和BamHI酶切,然后亚克隆到BS 186中,其γ-PKC中的EcoRI/BamHI片段被删除。 这些结构分别被指定为BS 238(C1突变)和BS 239(C2缺失)。 所有PCR产物均通过测序进行验证。 图中总结了三种γ-PKC-GFP蛋白(BS 186、BS 238和BS 239)的结构。 1 .
γ-PKC-GFP蛋白在培养细胞中的表达
电穿孔法瞬时转染COS-7细胞。 编码每种类型γ-PKC-GFP或γ-PKC的质粒(~32μg)被转染到6×10 6 使用基因脉冲器的细胞(960μF,220 V;加州Hercules生物实验室)。 通过Tfx脂质体转染NG-108、NIH3T3和CHO/mGluR1细胞- TM(TM) -50 ( Promega公司。 (威斯康星州麦迪逊市)。 转染后,细胞在30℃培养以获得GFP的最佳荧光。 转染后2或3天检测γ-PKC-GFP的荧光。 转染后3-5天进行实验。
NMDA受体和γ-PKC-GFP在COS-7细胞中的共表达
编码NMDARζ1和NMDARε1亚单位的小鼠cDNA,由Mishina博士(日本东京医学院东京大学药理学系)捐赠( Ikeda等人,1992年 ; Meguro等人,1992年 ; 山崎等人,1992年 ),亚克隆到表达质粒pTB 701中。 如上所述,通过电穿孔将等量的γ-PKC-GFP、NMDARζ1和NMDARε1质粒(总计32μg)转染到COS-7细胞中。 为了防止NMDA受体介导的细胞死亡,转染细胞在100μM AP-5(NMDA受体拮抗剂)的存在下培养,直到实验完成。
γ-PKC-GFP和γ-PKC的免疫印迹、激酶分析和免疫沉淀
γ-PKC-GFP(BS 186)或γ-PKC(BS 55)cDNA瞬时转染到6×10 6 电穿孔COS-7细胞。 将相同数量的转染细胞分为两个直径为8cm的培养皿,在30°C下培养3d。在室温下用5μM TPA处理90min后,用PBS(−)收集细胞并离心。 将细胞颗粒/培养皿重新悬浮在200μl匀浆缓冲液中(250 mM蔗糖、10 mM EGTA、2 mM EDTA、50 mM Tris/HCl、200μg/ml亮氨酸蛋白酶、1 mM PMSF,pH 7.4)。 超声波处理后(UD-210 TOMY SEIKO Co.Ltd.,日本东京;输出3,负载50%,10倍,4°C),样品在19000℃下离心 克 在4°C下持续30分钟,收集上清液作为胞浆部分。 用含有0.5%Triton-X的200μl匀浆缓冲液重新悬浮颗粒,并在如上所述的超声处理后用作颗粒部分。
为了进行免疫印迹,对每个组分的样品进行相同体积的10%SDS-PAGE,并将分离的蛋白质电泳转移到聚二氟乙烯(PVDF)过滤器上( Millipore公司。 ,马萨诸塞州贝德福德)。 PVDF过滤器上的非特异性结合位点通过与5%明胶孵育18 h而被阻断。然后PVDF滤器与抗PKC-γ单克隆抗体孵育(稀释1:2000)( Hashimoto等人,1988年 )或抗GFP多克隆抗体(稀释1:2000)(CLONTECH Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA)在25°C下保持30分钟。 用含有0.03%Triton X-100的0.01 M PBS清洗后,将过滤器与山羊抗鼠IgG(用于γ-PKC抗体)或抗兔Ig G(用于GFP抗体)孵育15 min,然后与兔过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物孵育15min。 冲洗三次后,用化学发光检测试剂盒(ECL; 阿默沙姆 (英国白金汉郡)。
如前所述,对COS-7细胞中表达的γ-PKC、γ-PKC-GFP及其突变体进行激酶分析( Kikkawa等人,1983年 ). 通过测量加入 32 来自[γ]的Pi进入小牛胸腺H1组蛋白- 32 P] 含有8μg/ml磷脂酰丝氨酸(PS)、0.8μg/ml二醛(DO)和0.5 mM Ca的ATP 2+ 在存在0.5 mM EGTA而不是PS、DO和Ca的情况下测量基础活性 2+ .
为了免疫沉淀γ-PKC-GFP和γ-PKC,在直径为8 cm的培养皿中用1 ml含有1%Triton X-100的匀浆缓冲液收集转染细胞,并用移液管进行匀浆。 19000离心机之后 克 将上清液与抗γ-PKC单克隆抗体在4°C下旋转5分钟,然后与蛋白A–Sepharose再旋转30分钟。样品在2000年离心 克 在4°C下保持5 min,并用PBS(−)洗涤三次颗粒。 最后,如上所述,使用10μl悬浮颗粒和50μl PBS(−)进行激酶测定。
γ-PKC-GFP易位的观察
在观察之前,将γ-PKC-GFP转染细胞铺在玻璃底培养皿(MatTek Corp.,Ashland,MA)上并培养至少16 h。 对于COS-7细胞和CHO/mGluR1细胞,用正常的Hepes缓冲液替换培养基,该缓冲液由135 mM NaCl、5.4 mM KCl、1 mM MgCl组成 2 ,1.8 mM氯化钙 2 ,5 mM Hepes,10 mM葡萄糖,pH 7.3。 必要时,CaCl 2 或氯化镁 2 被淘汰。 对于NG-108细胞,使用的缓冲液由以下成分组成:165 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl 2 ,1 mM氯化钙 2 ,5 mM Hepes,10 mM葡萄糖,pH 7.4。
使用共焦激光扫描荧光显微镜(LSM 410型反转;德国耶拿卡尔蔡司公司)在488-nm氩气激发下,使用515-nm-长通屏障过滤器监测γ-PKC-GFP的荧光。 将各种高浓度刺激物直接应用于Hepes缓冲液中,以获得适当的最终浓度,从而触发γ-PKC-GFP的转移。 为了观察NMDA诱导的易位,将NMDA在含有10μM甘氨酸且不含MgCl的培养皿中施用 2 .诱导K + 在NG-108细胞中去极化,缓冲液被交换为高K + -包含由52 mM NaCl、100 mM KCl、1 mM MgCl组成的缓冲液 2 ,10 mM氯化钙 2 ,5 mM Hepes,10 mM葡萄糖,pH 7.4。 所有实验均在室温下进行。
抗γ-PKC抗体对γ-PKC-GFP转染细胞的免疫染色
在玻璃底培养皿中培养的γ-PKC–GFP转染的COS-7细胞受到TPA或A23187的刺激,证实荧光完全易位。 然后用4%多聚甲醛和0.2%苦味酸将细胞固定在pH 7.4的0.1M磷酸盐缓冲液中30分钟。用pH 7.4、0.1M PBS冲洗两次后,用含有0.3%Triton X-100和5%正常山羊血清的PBS处理细胞10分钟。细胞依次用抗PKC-γ单克隆抗体孵育( Hashimoto等人,1988年 )用0.03%Triton X-100(PBS-T)和5%正常山羊血清在PBS中(1:1000稀释)40分钟,然后用Cy5标记的山羊抗鼠IgG在室温下保持30分钟。 在633nm氩激发和665nm红玻璃滤光片下,用共焦激光扫描荧光显微镜观察γ-PKC样免疫反应的荧光。
结果
γ-PKC–GFP融合蛋白的特性
为了检测γ-PKC-GFP是否具有磷脂依赖性/钙激活蛋白激酶(PKC)的特性,我们对COS-7细胞中表达的γ-PKC-GFP和γ-PKC进行了免疫印迹和激酶分析。 如图所示。 2
A类 、γ-PKC和γ-PKC-GFP被识别为具有合理分子量分别为80和110kD的特异性条带。 γ-PKC-GFP也被抗GFP多克隆抗体检测为单个110-kD带(数据未显示)。 用TPA治疗后,膜相关γ-PKC-GFP的数量增加,如γ-PKC的情况所示(图。 2
A类 ). 抗γ-PKC和GFP抗体不能检测到γ-PKC-GFP和γ-PKCC的降解产物。 此外,γ-PKC-GFP和γ-PKC的激酶活性从胞浆转移到膜组分(图。 2
B类 ). 激酶分析表明,免疫沉淀的γ-PKC和γ-PKC-GFP均依赖于PS/DO和Ca 2+ (图。 2
C类 ). 这些结果表明,γ-PKC-GFP与天然γ-PKC具有相似的酶学性质。
图2。
γ-PKC和γ-PKC-GFP在COS-7细胞中瞬时表达的酶学性质。 ( A类 )抗γ-PKC抗体的免疫印迹分析表明,表达的γ-PKC(BS 55)和γ-PKC-GFP(BS 186)分别是分子量为80和110kD的蛋白质。 用5μM TPA处理90分钟,增加了与微粒分数相关的γ-PKC和γ-PKC-GFP的数量。 第页 ,颗粒(颗粒分数); 秒 ,上清液(胞浆部分)。 ( B类 )胞浆和颗粒组分中表达的γ-PKC和γ-PKC-GFP的激酶活性。 用5μM TPA处理90分钟后,γ-PKC和γ-PKC-GFP的激酶活性从胞浆转移到颗粒组分。 幻灯片演示文件 ,颗粒(颗粒部分) 啜饮 ,上清液(胞浆部分)。 ( C类 )抗γPKC抗体免疫沉淀的γ-PKC和γ-PKC-GFP的酶学性质。 在存在或不存在γ-PKC活化剂的情况下,测定由抗γ-PKCC抗体免疫沉淀的表达的γ-PKC-和γ-PKC-GFP的激酶活性。 在PS、DO和Ca的存在下,γ-PKC-GFP的激酶活性最大 2+ γ-PKC也是如此。 γ-PKC和γ-PKC-GFP的酶学性质非常相似。
TPA和A23187诱导γ-PKC-GFP易位
在转染COS-7细胞的胞体周围观察到γ-PKC-GFP的强荧光,在细胞核中观察到微弱荧光(图。 三 , A类 和 B类 ). 5μM TPA激活γ-PKC-GFP后,荧光明显从细胞质转移到细胞膜。 用TPA治疗后10分钟开始移位,60分钟完成移位(图。 三
A类 ). TPA处理后,荧光在质膜上停留至少90分钟,并且没有回到被测细胞的细胞质中。 细胞核中的γ-PKC-GFP似乎没有移位。 在37°C下进行实验时,TPA诱导的γ-PKC-GFP易位发生得更快(图。 三
B类 , 上部记录道 ). 低浓度TPA(200 nM)处理10分钟后,移位完成。 相反,500 nM的无活性佛波酯4α-PDD未能在30分钟内诱导易位(图。 三
B类 , 下部记录道 ).
图3。
福尔波酯诱导COS-7细胞中γ-PKC-GFP移位。 ( A类 )室温下用5μM TPA改变COS-7细胞中表达的γ-PKC-GFP的荧光。 在转染的COS-7细胞中,在整个细胞质中观察到γ-PKC–GFP融合蛋白。 5μM TPA激活PKC后,γ-PKC-GFP荧光从胞浆向细胞膜明显移位。 TPA治疗后60分钟内几乎完成移位。 刺激前在Nomarski干涉显微镜下拍摄了相同的照片,并显示在左上角。 ( B类 )37℃下200 nM TPA和500 nM 4α-PDD对COS-7细胞中表达的γ-PKC-GFP荧光的影响。 在37°C下检测时,较低浓度的TPA(200 nM)诱导γ-PKC–GFP从细胞质转移到膜( 上部记录道 ). TPA治疗后10分钟,易位发生更快,观察到完全易位。 相反,在500 nM时,4α-PDD(一种非活性佛波酯)即使在37°C时也无法诱导γ-PKC-GFP的易位。 棒材,10μm。
在80μM,A23187时,Ca 2+ 离子载体也产生γ-PKC-GFP易位,其时间进程与TPA诱导的易位有显著差异。 加利福尼亚州 2+ 离子载体诱导的易位快速且可逆(图。 4
A类 ). 刺激后仅30秒,γ-PKC-GFP的荧光发生短暂移位。 第一阶段的易位很快被逆转。 刺激后90秒,γ-PKC-GFP重新定位到细胞质。 刺激后20分钟和45分钟观察到易位的第二和第三阶段,最后在A23187治疗后60分钟,γ-PKC–GFP在质膜上以斑片状小点的形式积聚(图。 4
A类 , 上部和中部记录道 ). 在图的下部轨迹中。 4
A类 图中显示了不同时间点细胞同一条线上的GFP强度分布。 在30 s和45 min时,随着细胞边缘强度的增加,检测到γ-PKC-GFP向细胞膜的移位。在0和5 min时,获得了非常相似的GFP强度曲线,并且两个不同时间点之间的荧光衰减可以忽略不计。
图4。
钙 2+ 离子载体诱导COS-7细胞中γ-PKC-GFP易位。 ( A类 )80μM A23187、Ca对COS-7细胞表达的γ-PKC-GFP荧光的影响 2+ 电离层。 A23187还将γ-PKC-GFP的荧光从胞浆转移到膜; 然而,易位的时间进程与TPA诱导的时间进程有显著差异。 钙 2+ 离子载体诱导的易位快速且可逆( 上部和中部记录道 ). 在较低的迹线中,显示了穿过细胞的同一条线上的GFP强度剖面。 (测量线位于左上角的箭头之间。)易位表示为30秒和45分钟时细胞边缘荧光的增加。比较GFP强度的分布,在0和5分钟时获得了非常相似的分布,荧光的衰减可以忽略不计。 ( B类 )A23187的γ-PKC-GFP易位并不总是可逆的。 左细胞显示单向易位,而右细胞显示可逆易位,如 A类 单向易位比可逆易位更常见。 γ-PKC-GFP最终在质膜和邻近细胞质中以斑片状小点的形式积聚。 棒材,10μm。
A23187的γ-PKC–GFP易位并不总是可逆的(图。 4
B类 , 左侧单元格 ). 单向易位(图。 4
B类 , 左侧单元格 )比可逆易位更常见(图。 4
B类 , 右侧单元格 ). 然而,γ-PKC-GFP总是以斑块状的小点聚集在质膜上(图。 4
B类 ). 低浓度(10μM)的A23187也表现出类似的效果(数据未显示)。
Thapsigargin对γ-PKC-GFP易位的影响
检查钙的影响 2+ 从细胞内钙释放 2+ 我们研究了抑制内质网Ca的thapsigargin对γ-PKC-GFP易位的影响 2+ -ATP酶和增加胞浆Ca浓度 2+ ,关于γ-PKC-GFP易位。 应用5μM thapsigargin可诱导荧光快速移位,该移位在刺激后1分钟内开始(图。 5 ). 最后,如A23187诱导的移位所示,荧光在质膜上以斑片状小点的形式积聚。 γ-PKC–GFP在核周也有积累。
图5。
Thapsigargin诱导γ-PKC-GFP易位。 5μM thapsigargin,内质网钙的抑制剂 2+ -ATP酶还诱导γ-PKC-GFP的快速移位。 γ-PKC-GFP的荧光像A23187诱导的易位一样,以斑点状聚集。 棒材,10μm。
钙的作用 2+ γ-PKC–GFP易位的螯合剂
阐明钙 2+ 离子载体诱导的移位依赖于细胞内钙的增加 2+ 浓度([Ca 2+ ] 我 ),我们检查了钙的影响 2+ 螯合剂对A23187诱导的易位作用。 钙 2+ 钙预处理完全阻断了离子载体诱导的移位 2+ 螯合剂、2.5 mM EGTA和15μM BAPTA-AM(图。 6 , 上部记录道 ). 此外,钙处理逆转了A23187诱导的易位 2+ 螯合剂刺激A23187后。 γ-PKC-GFP的荧光部分返回细胞质(图。 6 , 下部记录道 ). 钙处理前后TPA诱导的移位均未受到抑制 2+ 螯合剂(数据未显示)。
图6。
钙的作用 2+ 螯合剂对A23187诱导的γ-PKC-GFP易位的影响。 2.5 mM EGTA和15μM BAPTA-AM预处理完全阻断A23187(50μM)诱导的γ-PKC-GFP易位( 上部记录道 ). 使用2.5 mM EGTA和15μM BAPTA-AM将γ-PKC–GFP从细胞膜重新定位到细胞液中,即使在A23187诱导的易位发生后( 下部记录道 ). 棒材,10μm。
转基因γ-PKC-GFP的免疫染色
已知PKC在调节域和催化域之间被蛋白酶(如钙蛋白酶)消化( Kishimoto等人,1983年 )表明转位γ-PKC-GFP的荧光不能准确地揭示γ-PKC的定位。 因此,我们使用单克隆抗γ-PKC抗体对转染细胞进行免疫染色,该抗体在转位完成后识别γ-PKC的调节域。 如图所示。 7 ,即使在TPA-或A23187诱导的易位完成后,γ-PKC-样Cy5荧光仍与GFP荧光共定位。 这些结果表明,GFP的荧光显示了γ-PKC自身的定位。
图7。
γ-PKC-GFP荧光与γ-PKC-样免疫反应性的比较。 用抗γ-PKC抗体对γ-PKC-GFP转染的COS-7细胞进行免疫染色,结果表明,即使在TPA-或A23187诱导的移位完成后,GFP荧光和γ-PKC-样免疫反应也有非常相似的定位。 棒材,10μm。
突变γ-PKC-GFP融合蛋白的易位
为了检测γ-PKC的C1和C2区域在γ-PKC-GFP易位中的意义,我们构建了突变的γ-PKC-GFP、BS 238(C1突变)和BS 239(C2缺失),如上所述(图。 1 ). BS 238是结合TPA的C1区域的突变; 因此,预计TPA不会激活它。 事实上,TPA并没有诱导BS 238(C1突变)的易位,而A23187却诱导了(图。 8
A类 ). 加利福尼亚州 2+ 与野生型γ-PKC-GFP(BS 186)相比,BS238的离子载体诱导易位不足(图。 8
A类 和4 A类 ). BS 239(C2缺失)是结合钙离子的C2区域的缺失突变。 与BS 238相反,BS 239被TPA转运,但没有被A23187转运(图。 8
B类 ).
图8。
COS-7细胞中表达的突变γ-PKC-GFPs(BS 238和BS 239)的易位。 ( A类 )BS 238(C1突变γ-PKC–GFP)的易位。 5μM的TPA没有诱导BS238的易位,而50μM的A23187则诱导了BS238易位。 与BS186(对照γ-PKC-GFP)相比,A23187诱导的BS238易位不足。 ( B类 )BS 239的易位(C2缺失γ-PKC–GFP)。 与BS 238相比,BS 239被5μM TPA转运,但没有被50μM A23187转运。 棒材,10μm。
我们还检测了BS238和BS239的激酶特性。 BS238的激酶活性依赖于钙 2+ (对照组的157.8±9.1%;在EGTA存在下测量对照激酶活性),但TPA未激活(对照组94.5±5.6%)。 相反,BS 239的激酶活性没有被Ca激活 2+ (对照的100.4±5.6%)或TPA(对照的81.2±7.2%)。 然而,经1μM staurosporine处理后,BS239的激酶活性降低至对照的27.2%±0.4%,而BS238的活性受到staurosoprine的轻度抑制(对照的70.9±14.5%)。
K(K) + 去极化诱导转染NG108-15细胞γ-PKC-GFP转位
在生理条件下进一步检测γ-PKC-GFP蛋白的易位。 研究电压门控钙的去极化和随后的激活 2+ 通道诱导γ-PKC易位,我们在具有电压门控钙的NG108-15细胞中表达γ-PKC-GFP融合蛋白 2+ 通道( 阿特拉斯和阿德勒,1981年 ). 细胞外K后 + 从5 mM升高到100 mM,γ-PKC–GFP的荧光迅速从胞浆转移到膜(图。 9 ). 易位完成后,如A23187或thapsigargin诱导的易位所示,斑片状点状荧光积聚在细胞膜和胞浆中(图。 9 ). 可逆易位,如图所示。 三
B类 ,也发生在其他测试细胞中(数据未显示)。 K(K) + 10μM尼卡地平或10μMω-芋螺毒素GVIA、L型和N型钙的阻滞剂可消除去极化诱导的易位 2+ 通道,但不通过2μM河豚毒素 + 通道阻断器(未显示数据)。 这些发现表明,钙离子触发了易位 2+ 通过某种电压门控钙的流入 2+ 通道在NG 108-15细胞中表达。
图9。
K(K) + 去极化诱导NG108-15细胞表达的γ-PKC-GFP易位。 用高K替换外部溶液 + -包含一个快速诱导的γ-PKC–GFP易位。 γ-PKC-GFP的荧光在质膜和邻近细胞质上以斑片状斑点的形式积聚,如Ca 2+ 离子载体诱导的易位。 棒材,10μm。
NMDA受体介导的γ-PKC-GFP转位
通过受体介导的刺激进一步检测γ-PKC-GFP的易位。 在共表达NMDA受体通道(ζ1和ε1亚单位)的COS-7细胞中,用1 mM NMDA加10μM甘氨酸处理可诱导γ-PKC-GFP轻微但显著的移位(图。 10 ). 同时应用500μM AP-5(NMDA受体拮抗剂)阻断NMDA诱导的易位(图。 10 ).
图10。
NMDA诱导COS-7细胞中与NMDA受体共存的γ-PKC-GFP易位。 通过电穿孔将NMDARζ1和NMDARε1亚单位与γ-PKC-GFP共转染到COS-7细胞中。 在不含镁的情况下,将1mM的NMDA用于细胞 2+ 以及存在10μM甘氨酸。 NMDA诱导γ-PKC-GFP轻微但显著的易位。 同时应用100μM AP-5和1 mM NMDA阻断NMDA诱导的γ-PKC-GFP易位。 棒材,10μm。
mGluR1介导的γ-PKC-GFP转位
我们将γ-PKC-GFP转染到稳定表达mGluR1的CHO细胞中,以研究G蛋白偶联受体介导的γ-PKC易位。 1mM对mGluR1受体的激活 反式 -mGluR1的激动剂ACPD在20分钟内诱导了γ-PKC-GFP的快速易位并重新转移到细胞质(图。 11 ). 同时应用mGluR1拮抗剂2.5 mM RS-MCPG,完全阻断了mGluR2介导的γ-PKC-GFP易位(图。 11 ).
图11。
mGluR1介导的γ-PKC-GFP易位。 如文中所述,通过脂质体感染将γ-PKC-GFP转染到稳定表达mGluR1的CHO细胞中。 ( 上部记录道 )施用1 mM 反式- ACPD可快速诱导γ-PKC-GFP从胞浆向细胞膜移位。 荧光在20分钟内从细胞膜重新定位到细胞液( 下部记录道 )500μM MCPG与1 mM同时使用 反式 -ACPD完全阻断了mGluR1介导的γ-PKC-GFP易位。 棒材,10μm。
细胞分裂素D和秋水仙碱对γ-PKC-GFP易位的影响
为了研究丝状肌动蛋白在γ-PKC易位中的作用,我们研究了肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素D对γ-PKC-GFP易位的影响。 用10μM细胞松弛素D预处理25~40分钟,改变细胞形状; 然而,它并没有抑制TPA或A23187诱导的γ-PKC-GFP易位(图。 12
A类 ). 我们还检测了微管聚合抑制剂秋水仙碱的作用,以研究γ-PKC易位与微管之间的关系。 秋水仙碱与细胞松弛素D一样,不影响TPA或A23187诱导的γ-PKC-GFP易位(图。 12
B类 ). 为了评估上述细胞松弛素D或秋水仙碱预处理是否真的对细胞骨架起作用,我们用罗丹明-球蛋白染色丝状肌动蛋白,或用抗α-微管蛋白抗体染色微管。 10μM细胞松弛素和100μM秋水仙碱分别破坏肌动蛋白纤维和微管(数据未显示)。
图12。
γ-PKC-GFP易位参与细胞骨架。 ( A类 )10μM细胞松弛素D对γ-PKC-GFP易位的影响。 10μMγ-PKC-GFP治疗既不影响TPA-也不影响A23187诱导的γ-PKC-GFP易位。 ( B类 )100μM秋水仙碱对γ-PKC-GFP易位的影响。 用100μM秋水仙碱处理不会影响TPA或A23187诱导的移位。 在这些实验中,如文中所述,通过脂质体感染将γ-PKC-GFP转染到NIH3T3细胞。 TPA和A23187的浓度分别为1和50μM。 棒材,10μm。
讨论
我们首先通过测量含有或不含PKC活化剂的激酶活性来检测γ-PKC-GFP蛋白的酶学性质。 如图所示。 2
C类 ,COS-7细胞中表达的γ-PKC-GFP蛋白与天然γ-PKC具有相似的酶学特性。 此外,免疫印迹分析显示,分子大小合理的γ-PKC-GFP,而不是γ-PKC-GFP的降解产物,是GFP荧光的供体,即使是在TPA刺激下从细胞液转移到膜后(图。 2
A类 ). γ-PKC-GFP的激酶活性也从细胞质转移到膜(图。 2
B类 ). 这些结果表明,尽管在γ-PKC的COOH末端添加了一种含有238个氨基酸的GFP蛋白,但γ-PKC-GFP蛋白作为γ-PKC-并没有失去其酶学特性。 当GFP加入NH时 2 在γ-PKC(GFP-γ-PKCs)末端,GFP-β-PKC在细胞内的分布与目前观察到的γ-PKC-GFP相似(数据未显示)。 NH公司 2 -然而,已知cPKC的末端蛋氨酸在翻译后被裂解并被乙酰基取代( Tsutakawa等人,1995年 ). 因此,建议用融合蛋白γ-PKC-GFP而不是GFP-γ-PKC来监测γ-PKC-自身的准确定位。
据报道,PKCs被蛋白酶如钙蛋白酶(一种Ca 2+ -依赖性中性蛋白酶( Kishimoto等人,1983年 ). 如果γ-PKC–GFP在其转位过程中被蛋白水解,GFP荧光不能揭示γ-PKC-的准确定位。 因此,我们还用在易位完成时识别γ-PKC调控域的抗体进行了γ-PKC-GFP的免疫染色。 如图所示。 7 γ-PKC-GFP的免疫反应与GFP的荧光反应一致。 此外,跨细胞的线强度分布在短暂移位到细胞膜之前和之后是相似的(图。 4
A类 )表明γ-PKC-GFP的荧光准确地揭示了γ-PKC-GFP自身的定位,GFP荧光的时间依赖性运动实时显示了γ-PQC的移位事件。
免疫组织化学和酶学分析表明,TPA诱导的移位在5分钟内完成( 卡夫等人,1982年 )尽管γ-PKC-GFP的易位速度较慢,但在室温下需要高剂量的TPA才能进行易位。 这种差异是由于温度造成的,因为200 nM TPA足以将γ-PKC–GFP转运到膜上,当实验在37°C下进行时,转运在10分钟内完成(图。 三
B类 ).
与TPA诱导的易位相比,Ca 2+ 离子载体诱导的易位快速且可逆。 即使在37°C时TPA诱导的γ-PKC-GFP易位仍比Ca诱导的慢 2+ 电离层。 钙 2+ 螯合剂阻断钙诱导的移位 2+ 离子载体,表明Ca 2+ -诱导易位依赖于细胞内钙 2+ 浓度([Ca 2+ ] 我 ). 在这方面,A23187的波状易位可能反映了[Ca的改变 2+ ] 我 为了证明这一点,我们观察到A23187诱导的[Ca 2+ ] 我 通过将钙绿-1-AM(一种荧光钙 2+ 指示器,使用共焦激光荧光显微镜。 观察到荧光暂时增强; 然而,[Ca没有波动现象 2+ ] 我 无法检测到(数据未显示)。 此外,A23187通常诱导γ-PKC–GFP的单向易位,典型的可逆易位如图所示。 三 很少发生。 Ca的原因 2+ 目前,离子载体诱导γ-PKC-GFP波状易位尚不清楚; 然而,可以提出可能的解释。 首先,[Ca的波浪状交替 2+ ] 我 仅在特定条件下由A23187诱导,而使用钙绿-1-AM的实验并不是在这种条件下进行的,或者钙绿-1-AM不是一种合适的药物来微调[Ca的变化 2+ ] 我 因为它的钙效应 2+ 螯合剂。 或者,当A23187引起[Ca 2+ ] 我 不足,γ-PKC–GFP易位是不完整和短暂的,但随后不同钙产生磷脂 2+ -活化的磷脂酶诱导γ-PKC-GFP第二或第三次移位。 γ-PKC–GFP激酶测定结果表明,磷脂和Ca 2+ γ-PKC-GFP的完全激活需要支持这一观点。 Thapsigargin还诱导γ-PKC-GFP的快速易位,表明Ca 2+ 细胞内钙内流 2+ 储存物可以转移γ-PKC-GFP。
当易位完成时,γ-PKC在TPA诱导的易位中的定位与在Ca 2+ -诱导一个。 在TPA诱导的易位过程中,γ-PKC-GFP的荧光在质膜中积累,而在质膜和膜下细胞质中以斑片状小点的形式在Ca中积累 2+ -诱导易位。 这些发现表明TPA诱导的钙 2+ -诱导易位由不同的途径介导,每次刺激后γ-PKC的最终定位是不同的。
TPA治疗引起心肌细胞亚型特异性亚细胞分布( Disatnik等人,1994年 ). 在稳定过度表达γ-PKC的NIH3T3细胞中,TPA也报道了γ-PKC转位到高尔基体细胞器( Goodnight等人,1995年 ). 相反,在我们的研究中,γ-PKC-GFP主要通过TPA从胞浆转运到膜。 据我们所知,在各种细胞(COS-7、CHO、NG-108等)中,γ-PKC没有转位到高尔基复合体。 瞬时表达的γ-PKC可能具有与天然或稳定表达的γ-BKC不同的易位特性。 否则,添加GFP可能会改变γ-PKC的易位性质。
在我们的研究中,γ-PKC-GFP被各种生理刺激转位。 结果表明,γ-PKC在活细胞中被激活并移位。 此外,受体介导的γ-PKC-GFP易位快速且可逆。 特别是,mGluR1介导的易位是短暂的,表明受体介导的磷脂酰肌醇分解诱导的γ-PKC易位在活细胞中不持续。 As mGluR1介导的Ca升高 2+ 通过测量细胞内负载钙的荧光发现是短暂的 2+ green-1-AM(数据未显示),mGluR1介导的γ-PKC-GFP易位可能依赖于细胞内Ca 2+ .
为了阐明γ-PKC的易位是否与激活机制有关,我们检测了突变γ-PKC-GFPs的易位。 TPA诱导了BS 239(C2突变)的易位,但没有诱导BS 238(C1突变)的转位。 相反,Ca 2+ 离子载体转位了BS238,但没有转位BS239。 BS238的激酶活性依赖于钙 2+ 与BS238易位结果平行,而BS239的激酶活性既不依赖于Ca 2+ 也不是TPA,但被一种有效的激酶抑制剂staurosporine阻断,表明BS239可能通过突变而成为一种成分活性形式。 TPA诱导的γ-PKC易位可能与其激酶活性无关,因为staurosporine没有阻断TPA诱导易位(数据未显示)。 如图所示。 8
A类 ,加利福尼亚州 2+ 在所有测试细胞中,离子载体诱导的BS238(C1突变)易位不足。 根据激酶分析的结果(图。 2
C类 ),加利福尼亚州 2+ 单独使用似乎不会诱导γ-PKC的完全易位。 作为Ca 2+ 据报道,可以激活磷脂(包括DG)的产生,钙和磷脂都是诱导γ-PKC完全易位所必需的。
虽然PKC易位是一个众所周知的现象,但PKC易损的分子机制和意义尚未阐明。 磷酸酯类将PKC的某些亚型从胞浆转移到颗粒组分,包括细胞骨架( Zalewski等人,1988年 ; Jaken等人,1989年 ; 帕帕佐普洛斯和霍尔,1989年 ; Kiley和Jaken,1990年 ; Mochly-Rosen等人,1990年 ). 在βII-PKC中,据报道可转位到肌动蛋白纤维( Goodnight等人,1995年 )据推测,存在于洗涤剂不溶部分和结合活化βII-PKC中的活化C激酶受体(RACK)在PKC易位机制中起作用( Mochly-Rosen等人,1991年 ; Ron和Mochly-Rosen,1995年)。 为了阐明肌动蛋白或微管等细胞骨架蛋白是否参与PKC易位,我们检测了肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素D和微管聚合抑制剂秋水仙碱对γ-PKC-GFP易位的影响。 如图所示。 12 细胞松弛素D和秋水仙碱预处理均不影响γ-PKC-GFP易位。 此外,即使去除了外溶液中的葡萄糖,也会发生γ-PKC-GFP易位(数据未显示)。 这些结果表明,PKC易位不需要细胞骨架和葡萄糖依赖性运动蛋白,而这些对某些类型的蛋白质运输(如轴突流或囊泡运输)是必不可少的( 布鲁姆,1992年 ; Cheney等人,1993年 ). 此外,根据发现γ-PKC(BS 239)的C2缺失突变体可以被TPA转位的结果,佛波酯诱导的γ-PKC从细胞质到质膜的转位可能对RACK的结合没有必要,因为据报道RACK与PKC的C2区域结合(Ron和Mochly-Rosen,1995)。
总之,GFP与γ-PKC的融合蛋白是研究γ-PKC在活细胞中易位的机制和意义的有用工具。
致谢
我们感谢Ushio Kikkawa博士进行了许多有益的讨论。
这项工作得到了日本教育、科学、体育和文化部、山口代谢紊乱研究基金会和加藤纪念生物科学基金会的资助。
本文中使用的缩写
4α-PDD
4α-佛波醇12,13-二癸酸酯
DG公司
二酰甘油
执行
二醛
绿色荧光粉
绿色荧光蛋白
NMDA公司
N个 -甲基- d日 -天冬氨酸
MCPG公司
α-甲基-4-羧苯基-甘氨酸
mGluR1型
代谢型谷氨酸受体1
PKC公司
蛋白激酶C
PS(聚苯乙烯)
磷脂酰丝氨酸
TPA公司
12个- 哦 -十四烷基佛波醇13-乙酸酯
反式 -交流局部放电
(1S,3R)-1-氨基环戊烷-1,3-二羧酸
脚注
地址:日本神户657,Nada-ku,1-1 Rokkodai-cho,神户大学生物信号研究中心分子药理学实验室Naoaki Saito。 电话:81-78-803-1251。 传真:81-78-803-0993。 电子邮件: naosaito@inherit.biosig.kobe-u.ac.jp
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