摘要
结节性硬化综合征(TSC)是一种由基因突变引起的遗传病 任何一个 TSC1类 或 TSC2系统 TSC1和TSC2基因产物形成 功能复合物并抑制S6K和4EBP1的磷酸化。 这些 TSC1/TSC2的功能可能由mTOR介导。 这里我们报告TSC2 是一种针对Rheb(Ras家族GTPase)的GTPase激活蛋白(GAP)。 瑞布 刺激S6K和4EBP1的磷酸化。 Rheb的此功能被阻止 雷帕霉素和显性阴性mTOR。 Rheb刺激磷酸化 并在调节S6K和4EBP1的反应中发挥重要作用 营养素和细胞能量状态。 我们的数据表明Rheb的行为 TSC1/TSC2下游和mTOR上游调节细胞生长。
关键词: TSC2、Rheb、mTOR、S6K、GAP、结节性硬化综合征
结节性硬化综合征(TSC)以错构瘤形成为特征 广泛的组织,是由 要么是 TSC1类 或 TSC2系统 基因 ( Kwiatkowski 2003年 ). 最多 严重的临床并发症有智力迟钝、癫痫和自闭症 由脑部肿瘤生长引起( 戈麦斯 1991 ). 其他症状包括肾功能不全、皮肤病 异常和心脏问题。 任一种基因的杂合缺失 TSC1类 或 TSC2系统 产生相似表型并增加肿瘤 发病率特别是在肾脏,而两者的纯合子缺失 基因是胚胎致死的( Au等人。 1998 ; 小林等。 2001 ). 遗传数据来自 果蝇属 显示TSC1和 TSC2负调节细胞生长和细胞大小 ( 高和潘2001 ; Potter等人2001 ; Tapon等人,2001年 ).
最近的研究已经证实TSC1/TSC2抑制 核糖体S6激酶(S6K)和真核生物起始因子4E结合 蛋白质(4EBP1),翻译的两个关键调节器 ( Goncharova等人,2002年 ; Inoki等人,2002年 ; Manning等人,2002年 ; Tee等人,2002年 ). S6K和4EBP1的磷酸化增强翻译 ( Gingras等人,1999年 ). 怎么 TSC1/TSC2调节S6K的磷酸化,4EBP1是一个关键问题 待回答。 雷帕霉素(mTOR)的哺乳动物靶点是 负责S6K和4EBP1的磷酸化 ( Brown等人,1995年 ; Hara等人,1998年 ). 最近 研究表明TSC1/TSC2通过mTOR调节 S6K和4EBP1的磷酸化( Gao等人 2002年 ; Inoki等人。 2002 ; Tee等人。 2002 ). 与此模型一致的是TSC1和TSC2 对细胞营养反应很重要,这需要mTOR的功能 ( Gao等人,2002年 ). 然而,它 尚不清楚TSC1/TSC2如何抑制mTOR活性。
TSC2的C末端区域与Rap具有显著同源性 GTPase激活蛋白(GAP); 这个 1993年欧洲16号染色体结节性硬化联盟 ). 在 事实上,TSC2对Rap1和Rab5的GAP活性此前已有报道 ( Wienecke等人,1995年 ; Xiao等人,1997年 ). 然而, 报告的GAP活性极低,且具有功能重要性 尚不清楚。 Rheb是一种小的GTPase,最初作为Ras同源物分离 富含大脑( Yamagata等人。 1994 )并且被广泛表达。 Rheb拥有更高的序列 与Ras的身份比与Rho家族成员的身份更重要。 生物功能 哺乳动物Rheb尚不清楚。 相互矛盾的研究报告称,瑞布都能抑制 并激活Raf-MAP激酶途径 ( Clark等人,1997年 ; Yee和Worley 1997 ). 有趣的是 Rheb公司 中的基因 裂殖酵母 蓬贝 产生类似于营养缺乏的表型,表明 Rheb可能参与营养信号传递 ( 马赫等人,2000年 ).
在本报告中,我们提供了直接的生化数据,证明TSC2 在体外对Rheb具有GAP活性。 此外,我们还表明TSC2 调节体内Rheb-GTP水平。 我们表明Rheb的角色之一是 刺激S6K和4EBP1的磷酸化 TSC1/TSC2的细胞下游靶点。 效应域和GTP 结合对Rheb功能至关重要。 Rheb刺激S6K的能力 磷酸化需要mTOR的功能,表明mTOR发挥作用 Rheb下游。 与此一致的是,Rheb刺激 丝氨酸残基2448上mTOR的磷酸化。 此外,我们的数据支持 Rheb在细胞对能量限制的反应中起着重要作用 和营养缺乏。 总之,本研究提供了一个模型,即Rheb是一个 直接指向TSC2的下游目标,并在mTOR的上游进行调节 翻译和细胞生长。
结果和讨论
TSC2刺激Rheb的GTP水解
TSC2的C末端区域包含一个假定的GAP域 与RapGAP具有显著同源性( 这个 1993年欧洲16号染色体结节性硬化联盟 ; Scheffzek等人,1998年 ). 然而,推测的确切生理生化功能 尚未证明TSC2 GAP域。 有趣的是 TSC相关突变发生在TSC2的C末端假定GAP结构域, 指出GAP域对TSC2功能可能很重要 ( Jin等人,1996年 ; Momose等人,2002年 ; Kwiatkowski 2003年 ). 学习 TSC2的生化功能,我们表达并纯化了 TSC2输入 大肠杆菌 并测试了Ras的GAP活动 GTPases亚家族(Ras、Rap、TC21和Rheb)和Rho家族GTPases(Rac 和Cdc42)。 我们的体外试验未能检测到显著的GAP活性, 而RasGAP1的阳性对照显示出对Ras的活性(数据没有 如图所示)。 值得注意的是,催化精氨酸残基对 Rap GAP家族中的GAP活性在TSC2中不保守 ( 图1A ),表明TSC2 可能没有GAP活动( Scheffzek等人。 1998 ). TSC2也可能具有GAP活动,但 不同的精氨酸或完全不同的催化机制可能是 已使用。
图1。
TSC2对Rheb具有GAP活性。 ( A类 )Rheb和TSC2是 GTPase和GAP异常。 催化活性位点精氨酸( 粗体)在TSC2中不保守。 Rheb含有精氨酸残基 (粗体的残基)位于Ras密码子12对应的位置,其中 含有甘氨酸。 数字表示最后残留物的位置。 ( B类 ) 免疫沉淀TSC1/TSC2刺激Rheb的GTP水解。 增加的 免疫沉淀TSC1/TSC2的量(微升)与 GST-Rheb在室温下放置20分钟。释放游离 32 用放射性计数法测定对磷酸盐。 背景 减去对照免疫沉淀的活性。 基础GTPase Rheb的活性被任意设置为1。 ( C )与时间相关的GTP TSC1/TSC2刺激的Rheb水解。 GTP水解在 缺席( ▪) 以及TSC1/TSC2的存在(°)。 ( D类 )两者都不是 TSC2的N端和C端区域对Rheb具有GAP活性。 两个截断的TSC2结构(TSC2N,氨基酸1-1007;TSC2C,氨基酸 1008-1765)与TSC1共表达,并进行免疫沉淀和分析 GAP体外活性。 本试验中使用的HA-TSC2的量相等 至1μL英寸 B类 。这些蛋白的表达水平为 通过Western blot测定。 ( E类 )TSC2(而非TSC1)具有GAP活性。 转染HEK293细胞未经处理或用D-PBS、雷帕霉素(20 nM)或LY294002(50μM)持续30分钟,如图所示。 相对数量 GAP测定中使用的TSC2通过蛋白质印迹进行测定,如图所示 在下面 每个酒吧。 ( F类 )TSC1/TSC2降低Rheb-GTP水平 体内试验。 将Myc-Rheb转染HEK293细胞并用 32 磷酸。 Myc-Rheb免疫沉淀,结合 核苷酸洗脱并在纤维素板上溶解。 与联合转染 显示TSC1和TSC2。 Myc-RacL61作为对照。 比率 GTP/GDP的计算公式为GTP计数/3除以GDP计数/2, 和上所示 顶部 每条车道的。
为了进一步测试TSC2的GAP活性,我们将TSC2与 HEK293细胞中的TSC1。 TSC1/TSC2复合物通过 免疫沉淀和体外GAP活性使用各种 小GTP酶。 我们对Rheb做出了特别的努力,因为在 S.pombe公司 产生类似于营养饥饿的表型 ( Mach等人,2000年 ). 我们发现 TSC1/TSC2复合物刺激了Rheb的GTP水解 ( 图1B、C )但Ras没有。 这个 TSC2的GAP活性需要全长蛋白,因为 N端或C端区域,包含GAP同源结构域, 向Rheb显示的活动( 图。 一维 ). 排除在中检测到GAP活动的可能性 TSC1/TSC2免疫沉淀是由于另一种共沉淀GAP,我们 制造TSC2-R1701Q和TSC2-R170 3Q突变体,这些突变体在TSC患者中发现,以及 检测到没有GAP活动(数据未显示)。 因此,我们认为TSC2是 Rheb间隙。 TSC2C缺乏GAP活动可能是因为该要求 TSC2 N末端区域的GAP活性残基或不正确 TSC2C的折叠。 TSC2刺激Rheb GTPase活性的能力是 非常有趣,因为TSC2没有保守的活性位点精氨酸 在其他相关的RapGAP和Rheb中发现了一种不寻常的GTPase ( 图1A ). 几乎所有Ras GTPases家族在等位基因中含有一个保守的甘氨酸残基 Ras中的密码子12( 罗伊和威卢姆森 1993 ). 这种甘氨酸突变为几乎任何残基,包括 在许多癌症中发现的缬氨酸激活Ras家族的GTPase。 RasV12突变体 已知对RasGAP下调有抵抗力 ( Trahey和McCormick 1987 ). 有趣的是,Rheb在相应位置有精氨酸残基 密码子12和具有比Ras低得多的基础GTPase活性(数据未显示)。 然而,Rheb的GTPase活性可以通过 TSC1/TSC2。 因此,Rheb和TSC2是不寻常的GTPase和GAP, 分别是。
为了确定TSC2的GAP活动是否需要TSC1,HA-TSC2 仅在HEK293细胞中表达并免疫沉淀。 沉淀物 TSC2也可能免疫沉淀少量内源性TSC1, 对Rheb表现出显著的GAP活性 ( 图1E ). 相反, 免疫沉淀的TSC1对Rheb显示出非常低水平的GAP活性 可能是内源性TSC2蛋白共沉淀所致。 这些观察结果 表明TSC1在体内稳定TSC2,但不是直接需要的 GAP活动。 在各种条件下,TSC1/TSC2也被免疫沉淀, 包括雷帕霉素、LY294002和D-PBS治疗,这些都是已知的 抑制S6K和4EBP1的磷酸化。 我们观察到这些治疗 不会直接影响免疫沉淀TSC1/TSC2的GAP活性 ( 图1E ).
TSC2对Rheb GTP水平的影响也在体内测定。 这个 通过体内标记法测定Rheb的核苷酸结合状态 32 磷酸。 有趣的是,Rheb的基础GTP水平较高 ( 图1F ). 高GTP水平 野生型Rheb与它在某一位置含有精氨酸相一致 相当于Ras的密码子12( 图。 1安培 ). TSC1/TSC2的表达降低了 共转染Rheb~10倍( 图。 1楼 ). 作为对照,TSC2的N末端结构域的表达 对Rheb的GTP水平无显著影响。 这些数据提供了体内 证明TSC2是Rheb GAP的证据。
Rheb刺激S6K和4EBP1的磷酸化
如果Rheb是TSC2的关键下游目标,Rheb应刺激 S6K和4EBP1的磷酸化。 诱导的野生型Rheb的表达 S6K磷酸化的急剧增加和4EBP1的流动性改变 ( 图2A ). Rheb也增加了 转染HEK293细胞内源性S6K的磷酸化。 在 相反,Rheb没有刺激ERK磷酸化(数据未显示)。 这个 野生型Rheb的高活性与其主要为GTP相一致 绑定( 图1F ). Rheb也是 以剂量依赖的方式刺激S6K磷酸化 ( 图2B ).
图2。
Rheb刺激S6K和4EBP1的磷酸化。 ( A类 )Rheb公司 刺激S6K和4EBP1的磷酸化。 HA-S6K和Flag-4EBP1分别为 在有或无Myc-Rheb(100 ng)的情况下转染到HEK293细胞。 S6K的磷酸化通过磷酸特异性抗体pS6K(T389)、, 而4EBP1的磷酸化是由迁移率变化决定的 ( 上面的 面板)。 还测定了内源性S6K的磷酸化 ( 降低 面板)。 ( B类 )Rheb刺激S6K磷酸化 以剂量依赖的方式。 HA-S6K(15 ng)与0,2,5,20, 50和100 ng Myc-Rheb。 ( C )Rheb的效应域是 需要刺激S6K磷酸化。 HA-S6K与 野生型Rheb(100 ng)、RhebL64(40 ng)、Reheb-5A(200 ng)和RhebN20(300 ng)。 还显示了Rheb突变体的相对表达。 ( D类 ) 不同GTP酶对S6K磷酸化的刺激。 构成活跃 Cdc42、Rap1、Rab5、RhoA和野生型Rheb的突变体(每个100 ng) (40 ng)用于刺激S6K的磷酸化。 ( E类 )TSC2,但 不是TSC1,抑制S6K磷酸化。 HA-S6K与 Myc-TSC1或HA-TSC2。 测定了S6K的磷酸化。
Rheb效应域中38到42之间的5个残基发生突变 生成Rheb5A的丙氨酸。 我们发现效应域的突变 完全消除了Rheb刺激S6K磷酸化的能力 ( 图2C ). 我们还测试了 组成活性Rheb(RhebL64),并观察到RhebL 64是 大约是野生型的两到三倍 ( 图2C ). 试图 创造一个显性-阴性突变体,我们制造了一个RhebN20。 令人惊讶的是,RhebN20 没有表现出任何显性的负面影响,也没有刺激S6K ( 图2C ). A类似 RasN17的显性负突变体能有效阻断Ras功能 通过隔离Ras鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF; Lowy and Willumsen 1993年 ). 这个 观察表明,Rheb可能不需要GEF,因为它的基础很高 GTP级别,需要GTP绑定来刺激S6K 磷酸化。
为了确定Rheb的特异性,检测了其他几种GTPase, 包括Cdc42、Rap1、RhoA和Rab5。 这些成分活性突变体 GTPases不能刺激S6K磷酸化 ( 图2D ). 这些结果 证明Rheb对刺激S6K磷酸化具有特异性。 我们测试了 TSC1或TSC2单独对S6K磷酸化的影响。 TSC2的表达, 而不是TSC1,显著降低了 共同转染的S6K( 图3E ), 这与TSC2单独具有GAP活性的事实一致。 TSC2的能力 但TSC1不抑制S6K表明TSC2是 TSC1/TSC2复合物,而TSC1可能具有调节功能,例如 定位和稳定。 此外,这些观察结果表明 TSC2抑制内源性Rheb降低S6K磷酸化,因此 支持Rheb在S6K监管中的重要性。
图3。
TSC1/TSC2抑制体内Rheb功能。 ( A类 )TSC1/TSC2抑制 Rheb诱导S6K磷酸化的能力。 ( B类 )TSC1/TSC2 抑制Rheb诱导4EBP1磷酸化的能力。
TSC1/TSC2抑制Rheb功能
TSC1/TSC2和Rheb之间的功能关系在 活泼地。 TSC1/TSC2共转染抑制了Rheb刺激的能力 S6K系列( 图3A ). 类似结果 用4EBP1观察( 图。 3B公司 ). 这些数据进一步支持TSC2作为GAP的观点 朝向Rheb。
mTOR作用于Rheb下游
先前的研究表明,mTOR作用于TSC2下游 ( Gao等人,2002年 ; Inoki等人,2002年 ; Tee等人,2002年 ). 要确定 Rheb与mTOR之间的关系,雷帕霉素的作用是 调查。 雷帕霉素对细胞的治疗完全阻断了 Rheb对S6K磷酸化的刺激作用 ( 图4A )表明Rheb mTOR上游的功能。 为了进一步测试功能关系 在Rheb和mTOR之间,mTOR的一个激酶失活突变体与 莱布。 我们发现显性负性mTOR-KD显著阻断了 Rheb对S6K的磷酸化作用( 图。 4B类 ). 我们之前观察到TSC1/TSC2抑制 mTOR的S2448磷酸化( Inoki等人 2002年 ; Kenerson等人。 2002 ). Rheb的共表达导致mTOR显著增加 S2448磷酸化,而Akt磷酸化不受影响 ( 图4C )表明Rheb 激活mTOR。
图4。
Rheb在mTOR上游发挥作用,并参与对各种 信号。 ( A类 )Rheb在营养信号的下游和 mTOR。 如图所示,HA-S6K与RhebL64或RasV12共转染。 细胞是 用雷帕霉素或D-PBS处理30分钟 已确定。 ( B类 )激酶失活mTOR KD阻断Rheb诱导的S6K 磷酸化。 ( C )Rheb刺激mTOR的磷酸化。 Flag-mTOR或GST-Akt与Rheb共转染并免疫沉淀。 ( 左侧 )mTOR的磷酸化通过抗磷酸mTOR检测 (S2448)抗体。 ( 赖特 )Akt的磷酸化由 抗磷酸化Akt(S473)抗体。 ( D类 )Rheb在S6K监管中的作用 通过各种信号途径。 HA-S6K单独转染( 左边 一半)或与RhebL64一起( 正确的 一半)。 用 D-PBS、1-丁醇(0.3%)、山梨醇(600 mM)、2-DG(25 mM)或雷帕霉素(20 nM) 如图所示,持续30分钟。
Rheb参与多种信号通路调节 S6K系列
S6K的磷酸化受多种细胞信号调节,包括 营养素( 自豪2002 ). 这个 分析了大黄酸在营养信号传导中的功能意义。 在 Rheb转染HEK293细胞,营养缺乏(用D-PBS治疗 含有葡萄糖,但不含氨基酸)引起的 S6K系列( 图4A ). 相反, 营养饥饿抑制RasV12转染细胞中S6K磷酸化 ( 图4A ). 这些结果 证明Rheb在营养信号传导中起着重要作用 但Ras并不直接参与营养信号传导。 我们还 通过山梨醇检查渗透胁迫的影响,通过 2-脱氧葡萄糖(2-DG)和1-丁醇对磷脂酶D的抑制。 这些 已知治疗可诱导S6K去磷酸化 ( 图4D ; Dennis等人,2001年 ; Fang等人,2001年 ; Desai等人,2002年 ). Rheb公司 显著阻断了2-DG和1-丁醇的作用,但效果甚微 山梨醇诱导S6K脱磷反应的研究 ( 图4D ). 这些数据表明 Rheb在细胞能量传感途径和磷脂酶D中发挥作用 但不直接参与渗透胁迫途径。 一直以来,TSC1/TSC2在调节S6K 对细胞能量消耗的反应(数据未显示)。
TSC1/TSC2在细胞生长调节中的重要性 已建立( 波特和徐 2001 ). TSC1/TSC2的主要细胞功能是抑制 S6K和4EBP1的磷酸化,可能通过mTOR。 本研究提供了 在理解 TSC1/TSC2调节S6K和4EBP-1的磷酸化。 基于中的两者 体外和体内生化实验表明,TSC2是一种 Rheb-specific GAP和Rheb是TSC1/TSC2的关键下游目标 ( 图5 ). Rheb与 与Ras相关,是一种不寻常的GTPase,因为它主要与GTP结合 在细胞中。 Rheb的生物学功能尚未明确定义。 我们的 研究支持Rheb通过刺激磷酸化促进细胞生长 S6K和4EBP1,但在ERK激活中没有作用。
图5。
TSC1/TSC2下游和 m任务大纲。 TSC2作为GAP,通过直接刺激GTP使Rheb失活 水解作用。 Rheb刺激mTOR。 营养和细胞能量状态信号 通过Rheb,而渗透胁迫信号独立于Rheb。
TSC1/TSC2对Rheb的抑制可能对其功能至关重要 这两种抑癌蛋白中,Rheb能有效调节 S6K和4EBP1的磷酸化。 有趣的是,Rheb同源基因的突变 在里面 S.pombe公司 表现出营养缺乏的表型特征 ( 马赫等人,2000年 ). 我们的数据 与 S.pombe公司 和 支持Rheb在营养信号传递中发挥重要作用的观点。 S.pombe公司 还包含TSC1和TSC2相关分子 ( 松本等人,2002年 ). 我们 也表明TSC2是一个不寻常的GAP,因为它缺乏保守的 在其他Rap家族GAP中发现的精氨酸。 但它有很高的选择性 Rheb的GAP活动。 阐明催化机理的未来研究 关于Rheb-GTP水解的TSC2将为这一异常现象提供新的见解 GTP和GAP工作。
我们的研究提出了Rheb参与S6K调控的模型 对营养素和能量水平的反应 ( 图5 ). 相反,渗透性 压力独立于Rheb调节S6K。 Rheb的主要功能是 刺激mTOR; 然而,我们没有发现 Rheb和mTOR,提示Rheb可能间接激活mTOR。 未来 工作重点将放在Rheb如何刺激mTOR。 我们的模型预测TSC2 通过Rheb规范翻译 ( 图5 ). 这表明Rheb 积极调节细胞生长,在 TSC的发展。 因此,抑制Rheb可能是一个潜在的靶点 用于治疗TSC和癌症。
材料和方法
抗体和质粒
抗磷S6K(T389)、抗mTOR和抗磷mTOR(S2448) 抗体来自Cell Signaling Inc.,抗Myc抗体来自 圣克鲁斯生物技术。 抗-HA和抗Flag从Covance购买 和Sigma。 TSC1和TSC2结构如前所述 ( Inoki等人,2002年 ). 这个 J.Blenis慷慨提供了HA标记的S6K1(αII)构造 (哈佛大学,剑桥,马萨诸塞州)和标记的mTOR和激酶不活跃 mTOR(mTORKD)来自S.Schreiber(马萨诸塞州剑桥哈佛大学)。 拉布5 是G.Li(俄克拉荷马大学健康科学中心,俄克拉荷马州)的礼物 俄勒冈州城市)。 所有其他DNA结构,包括Ras、Rheb、Rap1、Rac、Cdc42、, RhoA、4E-BP1、Akt和ERK2为实验室库存。 所有的突变结构 通过PCR诱变产生TSC2和Rheb,并通过DNA验证 排序。
细胞培养、转染和免疫沉淀
HEK293细胞接种于Dulbecco改良的Eagle’s 含有10%胎牛血清(FBS)的培养基(DMEM)。 转染是 根据 制造商说明。 细胞在裂解缓冲液(10 mM Tris-HCl)中进行裂解 pH 7.5,100 mM NaCl,1%NP-40,1%Triton X-100,50 mM NaF,2 mM EDTA,1 mM PMSF、10μg/mL亮氨酸肽、10μg/mL抑肽酶)和免疫沉淀 带有所示抗体和蛋白G-Sepharose珠。 免疫复合物 进行SDS-PAGE分析。
体外GTPase检测
GST-Rheb、GST-Ras、GST-Rac和GST-Rap在细菌中表达 菌株BL21,并使用谷胱甘肽-脑葡萄糖4B珠(Sigma)作为 描述。 小GTP酶被加载 32 之前的P-γ-GTP GAP分析。 这里,10μg小GTPase蛋白结合在谷胱甘肽珠上 用50μCi的 32 装载缓冲器中的P-γ-GTP (20 mM Tris,pH 8,5 mM EDTA,1 mM DTT,0.1 mg/mL BSA),体积为20 μL。 通过添加MgCl停止加载反应 2 到10 然后洗脱小GTPase蛋白。
将HA-TSC2转染到HEK293细胞中,并通过抗HA免疫沉淀 抗体。 用洗涤缓冲液(20 mM)洗涤免疫复合物三次 pH 7.4、800 mM NaCl、2 mM EDTA、1%NP-40)条件下的三次试验,以及GAP试验的两次试验 清洗缓冲液(pH值为8时为20 mM Tris,100 mM NaCl,5 mM MgCl 2 ,1毫米 DTT)。 最终GAP分析包括0.5μg 32 P-γ-GTP 负载小GTPase和1×10的免疫沉淀TSC2 7 转染HEK293细胞。 在40μL GAP中进行反应 分析缓冲液(20 mM Tris,pH 8,10 mM MgCl 2 和4 mM DTT),在 室温下保持20分钟。用300μL木炭停止反应 缓冲液(5%木炭、20 mM磷酸、0.6M HCl),然后旋转10 min,并以13000 rpm旋转10 min。然后将100μL上清液 被拿走了,而且 32 P释放通过闪烁测定 计数。
Rheb的体内标记
用无磷DMEM清洗细胞一次,然后用0.5 mCi/mL 32 对正磷酸盐(ICN)4小时。用 标记裂解缓冲液(1%Triton X-100,50 mM HEPES,pH 7.4,100 mM NaCl,5 mM氯化镁 2 ,1毫克/毫升BSA,1毫升DTT,1毫升PMSF,10微克/毫升亮氨酸肽, 10μg/mL抑肽酶)。 经Myc-tagged的Rheb被免疫沉淀。 受Rheb约束 用洗脱缓冲液洗脱核苷酸(2 mM EDTA,0.2%SDS,1 mM GDP,1 mM GTP)在68°C下放置20分钟。然后将洗脱的核苷酸 使用0.75 M PEI纤维素板(Baker-flex)的薄层色谱法 千赫 2 人事军官 4 (pH值3.4)。
致谢
我们感谢朱天庆的技术援助。 我们还要感谢李伟全 Huira Chong负责质粒构建,Haris G.Vikis和Jennifer负责质粒构建 奥兰特批判性阅读手稿。 这项工作得到了 美国国立卫生研究院和沃尔瑟癌症研究所的资助。
这篇文章的出版费用部分由以下款项支付 页面费用。 因此,必须在此标记此物品 根据《美国法典》第18卷第1734节,“广告”仅限于 表明这一事实。
文章在印刷前在线发布。文章和发布日期为 在 http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.101/1110003。
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来自Genes&Development的文章由 冷泉港实验室出版社