人前列腺癌细胞株中N-Cadherin的表达

细胞培养

LNCaP和DU145人前列腺癌细胞系来自美国型培养物收集中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）。Muraki等人之前描述并建立了JCA1细胞的分离。30PC-3细胞系最初取自美国类型培养收集，细胞培养的长期传代导致选择具有不同生长、粘附和形态表型（PC-3N）的细胞群体。所有细胞系均保存在含有10%热灭活胎牛血清（FBS；Intergen，Purchase，NY）和青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中，37°C，5%CO₂恒定湿度下的大气。

从手术标本中培养人前列腺基质成纤维细胞（PSF）。通过将前列腺组织切割成1-mm来分离成纤维细胞三将其放置在100mm培养皿中并使其附着过夜。当细胞从外植体移出时，组织保存在含有10%FBS的DMEM中。用胰蛋白酶/EDTA传代两代后，只有前列腺成纤维细胞保留在培养基中，这表现为没有细胞角蛋白阳性细胞。在这些研究中使用之前，这些细胞又被保存了两代。

抗体

根据小鼠N-钙粘蛋白COOH末端（残基883-906）的推导氨基酸序列制备了多克隆抗血清（抗泛钙粘蛋白）31使用肽CDYDYLNDWGPRFKKLADMYGGGDD（多肽快递，科罗拉多州柯林斯堡）。如Marcantonio和Hynes所述，该肽与钥匙扣帽贝血蓝蛋白偶联32给新西兰白兔注射弗氏不完全佐剂。在加强注射抗原后采集血清。

实验中使用的小鼠单克隆抗体如下：α-连环蛋白克隆5（肯塔基州列克星敦转导实验室）、E-钙粘蛋白克隆HECD-1（加利福尼亚州旧金山Zymed实验室）、N-钙粘蛋白（A-CAM克隆GC-4；密苏里州圣路易斯西格玛化学公司）、p120^ctn公司克隆98（转导实验室）。抗斑球蛋白PG5.1的单克隆小鼠抗体33由Franke和Schmelz博士（德国海德堡德国癌症研究中心细胞与肿瘤生物学研究所）慷慨提供。Nagle等人先前描述了兔细胞角蛋白18A抗体。34实验中使用的二级抗体如下：Cy3-共轭亲和山羊抗鼠IgG（H+L）和荧光素（FITC）共轭亲和驴抗兔IgG，购自Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.（宾夕法尼亚州西格罗夫）。抗鼠IgG+HRP结合物购自Promega（威斯康星州麦迪逊），抗兔IgG-过氧化物酶结合物购于Boehringer Mannheim（印第安纳波利斯）。

SDS-PAGE和Western Blot

制备细胞裂解物并通过7%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离35电泳转移到硝化纤维。用含有1mmol/L苯基甲基磺酰氟（PMSF）的无钙和无镁磷酸盐缓冲盐水（CMF-PBS）洗涤单层细胞。细胞在CMF-PBS中刮取，转移到微型离心管中，然后离心。用2×SDS样品缓冲液（0.25 mol/L Tris-HCl，pH 6.8，10%SDS，25%甘油）对颗粒进行溶解，每车道装载30μg细胞蛋白。以牛血清白蛋白（BSA）为标准物，采用比新新酸（BCA）分析程序（皮尔斯化学公司，伊利诺伊州罗克福德）测量蛋白质浓度。用一级抗体检测抗原，然后用过氧化物酶结合的抗鼠IgG或抗兔IgG检测。通过暴露在X-OMAT AR胶片（柯达，罗切斯特，纽约）上的化学发光（NEN，波士顿，马萨诸塞州）识别蛋白质带。使用Metamorph 3.0版（宾夕法尼亚州韦斯特切斯特市Universal Imaging Corp.）采集Western印迹图像，使用One-D Scan 1.0版（弗吉尼亚州费尔法克斯市Scanalytics公司CSP Inc.）进行定量密度测定。

为了检测N-钙粘蛋白的非离子洗涤剂溶解度，PC-3N细胞生长到90%的汇合状态。用CMF-PBS和细胞骨架稳定缓冲液（CSK缓冲液；0.5%Triton X-100，10mmol/L PIPES，pH 6.8，50mmol/L NaCl，3mmol/L MgCl）洗涤细胞3×₂，0.3 mol/L蔗糖）在4°C的摇床上添加5分钟。刮取细胞并离心，通过丙酮沉淀收集洗涤剂可溶性蛋白质组分。沉淀物以10000 rpm的转速离心20分钟，然后在2×SDS样品缓冲液中重新悬浮。通过将热的2×SDS样品缓冲液添加到留在平板上的细胞成分中并进行注射器注射，收集不溶性部分。

为了进行免疫沉淀，根据Reyolds等人15在含有10 mmol/L Tris、pH7.4、150 mmol/L-NaCl、1 mmol/L-PMSF、1 mmol/L EDTA、0.1 mmol/L-钒酸钠、10μg/ml抑肽酶和10μg/ml亮氨酸肽（Sigma）的缓冲液中加入0.5%诺奈特P-40（NP-40）。从裂解物中免疫沉淀蛋白质，用SDS-PAGE分离，并转移到硝化纤维素中，如上所述检测抗原。

RNA提取和Northern Blot分析

通过酸性硫氰酸胍-酚氯仿萃取法从培养细胞中制备总RNA。36在含有1.85%甲醛的1%琼脂糖凝胶中通过电泳分离20微克的每个RNA样品，并将其转移到Hybond N+尼龙膜（Amersham Life Science，Arlington Heights，IL）上。N-cadherin mRNA通过Northern blot分析用300-bp经济效益从全长N-钙粘蛋白中分离的I cDNA片段（GenBank AccessionX54315型)由John Hempery博士（北卡罗来纳州三角研究园Becton Dickinson研究中心）提供。37使用1.7-kb检测E-cadherin mRNASma公司小鼠E-cadherin的I片段（GenBank AccessionX06115型).12血小板球蛋白的检测（GenBank登录M23410型)是从Werner Franke博士那里获得的人类cDNA。38探针用标记的α随机计时-³²PdCTP（阿默沙姆）。在42°C下，在含有0.05 mol/L NaH的6×SSC缓冲液中预混合膜18小时₂人事军官₄5×Denhardt’s（50×=%Ficoll，1%聚乙烯吡咯烷酮，1%牛血清白蛋白），1%十二烷基硫酸钠，50%甲酰胺和10μg/ml鲑鱼精子DNA。39将变性探针添加到斑点中并杂交过夜。在65°C下，使用以下条件将斑点依次洗涤30分钟：2×SSC/0.1%SDS、0.3×SSC/0.5%SDS和0.1×SSC/1.0%SDS。然后将印迹暴露于X-OMAT AR胶片（柯达）。将加载的归一化与1.2kb的杂交进行了比较精神分裂症人类GAPDH的I片段（GenBank AccessionJ04038号).

逆转录聚合酶链反应（RT/PCR）与DNA测序

对PC-3N细胞总RNA逆转录产生的cDNA进行PCR，使用简并引物扩增多种钙粘蛋白亚型。40在含有随机六聚体引物、10mmol/l DTT、0.5mmol/l dNTPs、10U RNasin和200U Maloney小鼠白血病病毒逆转录酶（Gibco BRL）的40μl反应混合物中，从1μg DNase I处理的总RNA中扩增PC-3N cDNA，并在42°C下保持60分钟。然后用80μl H稀释cDNA产物₂O、 并使用5′寡核苷酸引物AATGAATTCGTNTTYGAYTAYGARGG和3′引物AAtgAATTCRTCNGCNGCNAGYTTYTTRAA将2.5μl的PC-3N cDNA产物用于25μl PCR反应。反应产物随后通过4%琼脂糖凝胶电泳分离（3%Nusieve GTG琼脂糖和1%Seakem ME琼脂糖，FMC BioProducts，Rockland，ME），提取约150 bp的cDNA片段，用生态R1，并连接到pBluescript（Stratagene，La Jolla，CA）。连接产物转化为XL-1蓝色大肠杆菌（Stratagene），31个cDNA插入序列通过双脱氧链终止（Sequenase 2.0，United States Biochemical，Cleveland，OH）测定。

SCID小鼠模型

BALB-c/B-17/IcrACCscid小鼠（亚利桑那州癌症中心SCID菌落）按照美国公共卫生服务局关于动物护理和维护的指南，在特定的无病原体环境中进行维护。5周龄雄性SCID小鼠腹腔接种5×105DU-145或PC-3N细胞重新悬浮在0.25 ml DMEM无血清培养基中。根据McCandless等人的研究，接种后42天，处死小鼠，固定并处理膈肌组织。41异种移植物固定组织切片，厚度为5μm。切片脱蜡并用苏木精和伊红染色。

组织制备与免疫细胞化学

人类冷冻前列腺组织来自亚利桑那大学病理组织库。标本在手术或尸检时获得，snap冷冻在异戊烷中，用氟利昂冷却，并保存在−80°C下。将6μm厚的冰冻切片置于聚赖氨酸涂层载玻片上，并在−20°C的丙酮中固定10分钟。然后用2%牛血清白蛋白和2%山羊血清在CMF-PBS中封闭切片1小时，然后用兔多克隆抗细胞角蛋白18抗体和鼠抗N-钙粘蛋白孵育1小时。清洗后，应用Cy3-结合的抗鼠IgG和FITC-结合的驴抗兔IgG 1小时。载玻片上装有2%没食子酸正丙酯/90%甘油，pH 8.0。通过配备有He、Ne和Ar激光器（Zeiss）的激光扫描共聚焦显微镜LSM410观察人类前列腺组织。

对于免疫荧光，细胞生长在玻璃盖玻片上汇合。细胞在CMF-PBS中的4%（w/v）多聚甲醛中固定5分钟，并在4°C的CSK缓冲液中渗透5分钟。盖玻片与2%牛血清白蛋白和2%山羊血清在CMF-PBS中孵育，并在25°C下暴露于抗体1小时。清洗后，应用Cy3-共轭二级抗鼠IgG 1小时。为了检测PC-3N和PSF共培养物中的N-钙粘蛋白，PSF细胞在玻璃盖玻片上生长到50%的汇合处过夜。用40μg/ml的DiO（乙醇中的3,3′-二十八烷氧基碳菁高氯酸盐（Molecular Probes，Eugene，OR））标记PC-3N细胞1小时，并用CMF-PBS广泛清洗⁴)用PSF培养物播种24小时。然后固定细胞，用CSK缓冲液渗透，并如上所述染色N-钙粘蛋白。

细胞聚集分析

按照乌鲁什哈拉和武一的描述进行了细胞聚集实验。42单层培养物在2mmol/L钙的存在下用0.01%胰蛋白酶（Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ）处理2分钟。在含有10 mmol/L HEPES、pH 7.4和1%BSA且不含钙和镁的Hanks平衡盐溶液（HBSS）中通过离心轻轻清洗胰蛋白酶化细胞。用巴斯德吸管研磨10次，彻底分离细胞。5 × 105然后将细胞转移到24孔培养皿中，最后体积为0.5 ml HEPES缓冲HBSS，其中含有1%BSA和100μg/ml DNase I，添加或不添加2mmol/L CaCl₂.这些板之前涂有聚血红素（Sigma）。通过添加钙开始细胞-细胞粘附，并在37°C下以80 rpm的速度旋转平板1小时，然后用等体积的8%多聚甲醛将细胞固定在pH 7.4的CMF-PBS中。对于混合聚集实验，用40μg/ml DiO在37°C下标记PC-3N细胞1小时。在存在或不存在CaCl的情况下进行细胞聚集₂和/或N-钙粘蛋白特异性阻断单克隆抗体（A-CAM；克隆GC4）在37°C下以80 rpm的转速持续1小时。然后按照上述方法固定细胞。为了进行分析，取下50μl固定骨料，放在载玻片上，并用盖玻片覆盖。使用20倍物镜（蔡司）在外荧光光学下用FITC滤波器组和相位对比度拍摄骨料。

前列腺癌细胞系的侵袭特性

人前列腺癌细胞系LNCaP、DU145、PC-3、JCA1和亚系PC-3N显示出不同的细胞形态在体外.27-30DU145和LNCaP细胞表现为上皮表型，而PC-3、PC-3N和JCA1细胞在不同程度上表现为组织化程度较低、细长的纺锤状间充质表型。PC-3N细胞是亲代PC-3细胞系的变体29在广泛的继代培养后显示出更像成纤维细胞的表型。PC-3以前已经被证明包含两个不同的亚群。43一个群体表达E-钙粘蛋白并表现出上皮表型，另一个群体缺乏E-钙粘蛋白表达并具有更分散的纺锤形表型，类似于PC-3N。由于人类前列腺癌细胞系PC-3N和DU145具有明显不同的生长特性，我们试图通过SCID小鼠腹腔接种的人类异种模型来表征其侵袭性。41苏木精和伊红染色的横切面显示，5周后，PC-3N和DU145细胞随机附着在横膈膜的间皮表面。PC-3N细胞在膈膜表面生长为小实体瘤。PC-3N细胞也侵入膈肌横纹肌。在膈肌内的多个部位检测到侵袭PC-3N细胞的小簇（图1A）▶PC-3N人癌的侵袭集落直径始终只有几毫米。DU145在隔膜表面生长为大的、血管化程度高的肿瘤，但没有侵犯隔膜肌（图1B）▶.

N-Cadherin在PC-3、PC-3N和JCA1前列腺细胞系中的表达

由于PC-3N前列腺癌细胞在SCID小鼠膈肌中的生长和侵袭特征表明细胞间粘附较弱，因此我们对PC-3N和其他四种前列腺癌细胞系的E-cadherin/catenin表达进行了表征。通过免疫印迹等效数量的细胞蛋白评估E-钙粘蛋白和α-、β-和γ-连环蛋白的表达水平。数据如图2所示▶，总结见表1▶为了检测钙粘蛋白，我们使用针对经典钙粘蛋白家族保守细胞质区域的泛素多克隆抗体对前列腺细胞总裂解物进行免疫印迹44（图2A）▶针对该区域制备的抗体已被证明与钙粘蛋白家族的几个成员具有免疫反应性。免疫印迹分析表明E-cadherin（MW=125 kd）存在于LNCaP、DU145和PC-3中，但在PC-3N和JCA1细胞系中不存在（图2、A和C）▶此外，在PC-3、PC-3N和JCA1腺癌细胞系中检测到较高分子量的钙粘蛋白（138 kd）。PC-3细胞显示混合钙粘蛋白表型的表达，其中包含E-钙粘蛋白和较大的钙粘蛋白。LNCaP和DU145中未检测到这种未知钙粘蛋白（图2A）▶.

因为在前列腺癌的恶性进展过程中，连环蛋白，尤其是α-连环蛋白的丢失，已被证明减少了E-cadherin介导的细胞间相互作用，26,45我们对α-连环蛋白、β-连环素、γ-连环肽/血小板球蛋白（免疫印迹未显示）和p120进行了表征^ctn公司通过等量蛋白质的免疫印迹测定前列腺癌细胞系的表达水平。结果汇总在表1中▶由于DU145表达的所有连环蛋白和E-钙粘蛋白水平大致相等，因此密度测定值归一化为DU145。LNCaP和DU145均表达所有连环蛋白，与更分化的表型一致。然而，连环蛋白在JCA1和PC-3N细胞中的表达水平显示出显著差异。JCA1缺乏可检测的β-连环蛋白，α-连环素和斑球蛋白水平低于DU145。另一方面，PC-3N细胞显示血小板球蛋白减少，与Morton等人一致，26α-catenin也不存在。

由于其他连环蛋白的表达在所研究的一半前列腺癌细胞系中异常，p120的表达^ctn公司免疫印迹法检测亚型。p120^{计算机网络}使用的单克隆抗体识别p120和p100亚型中的一个共同表位。所有细胞系中都存在这两种亚型（图2B）▶然而，与DU145相比，PC-3N和JCA1中p100的表达较低（表1）▶这表明p120和p100的表达依赖于前列腺细胞系中钙粘蛋白的类型。在只表达E-cadherin（DU145，LNCaP）的前列腺癌细胞系中，p100是主要的亚型，大约比p120高两倍。相反，p120是PC-3N和JCA1中的主要亚型，它们缺乏E-钙粘蛋白，并表达不同的钙粘蛋白。在显示混合钙粘蛋白群体的PC-3细胞中，p120和p100亚型的表达相同（表1）▶.

为了鉴定PC-3N、PC-3和JCA1癌细胞中未知的钙粘蛋白，我们使用基于钙粘蛋白胞质结构域的保守氨基酸序列的简并寡核苷酸引物，通过RT-PCR扩增钙粘蛋白cDNA。40从PC-3N cDNA中扩增出约150 bp的单个cDNA带，进行凝胶纯化、亚克隆和测序。42%的独立克隆的核苷酸序列与人类N-钙粘蛋白的序列一致性为100%。37其余克隆均未显示与E-钙粘蛋白或任何其他钙粘蛋白的同源性。这些结果表明，用抗泛钙粘蛋白多克隆抗体在PC-3N细胞中检测到的钙粘蛋白（分子量=138 kd）是N-钙粘蛋白。

第120页^ctn公司PC-3N细胞中的等位基因与N-钙粘蛋白结合

我们评估了N-钙粘蛋白是否分布在汇合PC-3N细胞的Triton X-100不溶部分，这可能反映了与细胞骨架相关的N-钙粘素（图2D）▶密度分析显示约25%的N-钙粘蛋白存在于PC-3N细胞的洗涤剂不溶部分中（图2D▶，通道2和3），表明N-钙粘蛋白可能与细胞骨架蛋白相关。我们免疫沉淀p120^{计算机网络}从PC-3N的洗涤剂裂解物中，将免疫沉淀转移到硝化纤维素中，并用多克隆pan-cadherin抗体进行印迹。p120中检测到138 kd的钙粘蛋白^ctn公司免疫沉淀，表明存在N-钙粘蛋白（图2D▶，车道4）。在非免疫对照组中未检测到钙粘蛋白带。

为了进一步确定p100与p120亚型的比值是否与特定的钙粘附素亚型相关，我们用E-钙粘附素或N-钙粘附素特异性单克隆抗体免疫沉淀PC-3、DU145和PC-3N细胞，并对p120进行免疫印迹^ctn公司（图2E）▶在仅表达E-钙粘蛋白的DU145细胞中，p100是主要的同种型。在只表达N-钙粘蛋白的PC-3N细胞中，p120是主要的亚型。然而，在同时表达E-和N-钙粘蛋白的PC-3细胞中，用E-钙粘蛋白或N-钙粘素抗体免疫沉淀的裂解物中p100与p120的结合没有差异。这表明尽管p120和p100亚型都结合N-钙粘蛋白和E-钙粘蛋白，但p120比例的改变^ctn公司PC-3N和DU145中的亚型是由于亚型表达的差异，而不是由于结合亲和力的差异。

N-钙粘蛋白在PC-3N细胞中的免疫定位

在PC-3N细胞融合培养中，N-钙粘蛋白定位于细胞间粘附接触的部位（图3A）▶纺锤形PC-3N细胞与其相邻细胞形成松散而广泛的细胞接触。大多数N-钙粘蛋白免疫反应位于细胞投射中（图3A和B▶，箭头）。此外，连环蛋白p120^ctn公司免疫标记与N-钙粘蛋白相似（图3B）▶第120页^ctn公司定位于与N-钙粘蛋白类似的区域，在细胞投射中具有特异性免疫定位。如预期的那样，在PC-3N中未观察到E-钙粘蛋白免疫反应（图3C）▶.N-钙粘蛋白也定位于JCA1和PC-3亚群的细胞-细胞连接处（数据未显示）。此外，E-cadherin定位于DU145的细胞连接处，显示上皮形态（图3D）▶E-cadherin在LNCaP细胞中的表达也类似，在DU145或LNCaP细胞中均未检测到N-cadherin免疫反应（数据未显示）。

N-Cadherin mRNA在PC-3、PC-3N、JCA1和前列腺基质成纤维细胞中表达

通过Northern印迹分析确定前列腺癌细胞系中稳态N-cadherin mRNA水平的差异表达（图4）▶类似于N-钙粘蛋白蛋白数据，在PC-3、PC-3N和JCA1细胞中检测到N-钙粘蛋白mRNA转录物（4.2kb），但在DU145和LNCaP细胞中未检测到，即使在长期（1周）暴露后也是如此。相反，E-cadherin mRNA在LNCaP和DU145细胞中表达，但在PC-3N和JCA1细胞中不表达。在PC-3细胞中检测到E-和N-cadherin mRNA。因此，与蛋白表达一致，PC-3N和JCA1都缺乏E-cadherin的表达，但也表达N-cadherin。在培养的前列腺基质成纤维细胞中也检测到了N-cadherinmRNA，但没有检测到E-cadherinm RNA（图4）▶.

此外，β-catenin和plakoglobin mRNA的稳态mRNA表达水平与前列腺细胞系中的蛋白表达不一致。所有前列腺细胞系均表达可检测到的斑球蛋白mRNA水平（图4）▶然而，尽管JCA1中的斑球蛋白水平低于DU145（表1）▶，斑球蛋白mRNA在JCA1中似乎高出三倍与DU145。此外，所有前列腺癌细胞系均表达同等水平的β-catenin mRNA，尽管蛋白水平不同（图4）▶.

N-钙粘蛋白在前列腺基质成纤维细胞中的免疫定位和现场

N-钙粘蛋白的免疫定位显示，PC-3N细胞和前列腺基质成纤维细胞（PSFs）均表达N-钙粘素，并在细胞-细胞边界形成N-钙粘质粘附连接接触（箭头，图5▶). 图5A▶表明PSF细胞-细胞连接处的N-cadherin表达维持在体外所有细胞的N-钙粘蛋白和α-平滑肌肌动蛋白均呈阳性，这证实了培养物中只存在PSF46,47（图5B）▶此外，我们在正常人前列腺组织的冰冻切片中免疫定位了N-钙粘蛋白。前列腺组织切片中的N-钙粘蛋白的免疫反应性在基质细胞和穿透腺体的神经束中强烈检测到，但在正常前列腺上皮腺体中未检测到N-钙粘素，如角蛋白18抗体的共同免疫定位所示（图5C）▶.

PC-3N前列腺癌细胞和前列腺基质成纤维细胞共同培养，以确定N-钙粘蛋白是否定位于细胞间接触部位。基质成纤维细胞培养过夜，然后添加荧光染料DiO-标记的PC-3N细胞，并再培养24小时。N-钙粘蛋白的免疫定位显示，在PC-3N细胞和基质成纤维细胞之间的细胞间接触处有N-钙粘素免疫反应位点（箭头，图5D▶). 在单独与二级抗体孵育的样品中未检测到免疫染色（数据未显示）。

N-钙粘蛋白介导PC-3N细胞和PSFs的细胞聚集

检测前列腺癌细胞和前列腺基质成纤维细胞之间的相互作用是否由N-cadherin介导，这是一种细胞-细胞聚集分析42已执行。在有钙存在的情况下，通过胰蛋白酶将PC-3N细胞分离为单个细胞悬浮液后，用DiO标记的PC-3N电池与未标记的PC-3电池混合，并允许在有钙的情况下聚集（图6）▶PC-3N细胞的钙依赖性聚集具有时间依赖性，并在缺乏钙的情况下被阻断²⁺将功能阻断抗体添加到N-钙粘蛋白中可抑制PC-3N癌细胞的钙依赖性聚集（数据未显示）。

PC-3N前列腺癌细胞与基质成纤维细胞之间的同型相互作用也由N-钙粘蛋白介导。等量的前列腺基质成纤维纤维细胞与DiO标记的PC-3N细胞混合。钙存在时，观察到大细胞-细胞聚集物、PC-3N细胞和PSF细胞。钙依赖性细胞-细胞聚集体由所有可能的细胞相互作用组成：PC-3N/PC-3N、PC-3N/PSF和PSF/PSF。在存在N-钙粘蛋白功能性阻断抗体的情况下，这种钙依赖性细胞-细胞聚集基本上被消除。在DU145/PSF细胞和DU145/PC-3N细胞之间未观察到聚集（数据未显示）。这些发现表明，N-钙粘蛋白的同型相互作用介导PC-3N前列腺癌细胞系和前列腺基质成纤维细胞之间的相互作用。