摘要
已经开发出一种分析方法,可以识别 作为I型干扰素拮抗剂的分子。 使用此分析,我们 已鉴定出一种埃博拉病毒编码的I型干扰素抑制剂 反应,埃博拉病毒VP35蛋白。 该分析依赖于 流感病毒突变体流感delNS1病毒的特性 缺乏NS1 ORF,因此不产生NS1蛋白。 当细胞感染德尔NS1流感病毒时 生产I型干扰素。 因此,流感delNS1病毒 复制能力差。 然而,高效瞬时转染 编码干扰I型干扰素诱导的蛋白质的质粒 抗病毒功能,如甲型流感病毒NS1蛋白或 单纯疱疹病毒蛋白ICP34.5拯救流感生长 delNS1病毒。 当质粒表达个别埃博拉病毒蛋白时 将埃博拉病毒转染到Madin Darby犬肾细胞中 VP35蛋白增强了流感病毒delNS1的生长100倍以上。 VP35随后被证明可以阻断双链RNA 病毒介导IFN刺激反应元件报告子的诱导 基因和阻断双链RNA和病毒介导的 IFN-β启动子。 因此,埃博拉病毒VP35很可能会 抑制埃博拉病毒感染细胞中I型干扰素的诱导,可能 是埃博拉病毒毒力的重要决定因素 在里面 活泼地 .
埃博拉病毒被包裹, 属于该家族的负链RNA病毒 丝状病毒科。 这些病毒的基因组约为 19 kb,已知编码八种蛋白质,即核蛋白(NP), VP35、VP40、糖蛋白(GP)、可溶性GP、VP30、VP24和L (聚合酶)蛋白质( 1 ). 埃博拉病毒感染经常导致 扎伊尔严重出血热和埃博拉病毒流行 亚型导致死亡率超过80%( 1 , 2 ). 肺结核的病理特征和免疫反应特征 致命和非致命的人类埃博拉病毒感染已经开始 具有特征的( 三 – 5 ). 此外,埃博拉病毒的机制 病毒引起出血和休克的研究正在开始。 最近的报告表明免疫介导的病理学 ( 三 )以及由特定病毒蛋白介导的病理学。 膜结合GP被提议用于介导细胞毒性 内皮细胞( 4 ),而可溶性GP被认为可以抑制 早期中性粒细胞活化( 5 ). 然而,后一种机制是 有争议的( 6 ). 全面了解埃博拉病毒的发病机制 感染,重要的是通过以下途径进一步研究其机制 病毒与宿主相互作用的方式,包括 病毒破坏了宿主的抗病毒反应。
宿主抗病毒反应的一个重要组成部分是I型 IFN系统。 针对病毒感染合成I型干扰素; 双链RNA(dsRNA)或病毒感染激活潜伏 转录因子,包括IRF-3和NF-κB,导致 I型干扰素、干扰素α和干扰素β的转录上调, 基因。 分泌的I型干扰素通过一个共同的受体发出信号, 激活JAK/STAT信号通路。 这种信号刺激 干扰素敏感基因的转录,包括编码 抗病毒蛋白,并导致诱导抗病毒状态。 I型干扰素诱导的抗病毒蛋白包括 dsRNA-依赖性蛋白激酶R(PKR),2′,5′-寡腺苷酸合成酶 (OAS)和Mx蛋白( 7 – 10 ).
许多病毒已经进化出破坏宿主IFN反应的机制。 例如,单纯疱疹病毒(HSV-1)蛋白ICP34.5 抵消PKR介导的翻译起始磷酸化 因子eIF-2α,阻止IFN诱导的阻滞的建立 蛋白质合成( 11 ). 在负链RNA病毒中 已经确定了不同的抗干扰素机制( 12 , 13 ). 首先 甲型流感病毒NS1蛋白在 病毒感染细胞( 12 ). 随后,SV5的V蛋白被显示 针对STAT1进行蛋白酶体介导的降解,防止 来自I型和II型干扰素受体的信号( 13 , 14 ). 也, 仙台病毒C蛋白被发现可以阻断I型和II型干扰素 发出信号并阻止建立抗病毒状态 ( 15 – 17 ). 最近,麻疹病毒感染被证明可以阻止 诱导产生I型干扰素( 18 ). 此外,牛的呼吸道 已证明合胞病毒NS1和NS2蛋白具有功能 共同对抗I型干扰素反应( 51 ).
由 负链RNA病毒是甲型流感病毒NS1蛋白。 一 突变型流感病毒,流感delNS1病毒,缺乏NS1 ORF 因此,不产生NS1蛋白,在底物上生长不良 哪些I型干扰素诱导的抗病毒途径是完整的( 12 ). 这样的 底物包括10日龄的Madin Darby犬肾(MDCK)细胞 鸡胚和老鼠。 很明显 流感病毒delNS1因其不能 对抗干扰素介导的抗病毒反应。 病毒生长 类似于野生型病毒[流感A/PR/8/34(H1N1)(PR8) 病毒]在6天龄鸡胚、Vero等底物上 单元格和STAT1 −/− 鼠标,不安装 有效的I型干扰素应答( 12 , 19 ). 流感的失败 delNS1病毒在产生干扰素的底物上生长与其相关 诱导IFN的能力。 因此,这种变异病毒感染细胞 诱导大量I型干扰素,这种情况与 强效抗病毒状态(参考文献。 19 ; M.Salvatore、H.Zheng、T.Muster、, P.P.和A.G.-S.,未公布的结果)。 这种干扰素合成不 当相同的底物感染NS1时发生 蛋白产生野生型PR8病毒( 12 ). NS1的能力 防止干扰素产生和促进流感生长的蛋白质 产生干扰素的底物上的病毒可能与其 结合单链和/或dsRNA( 20 – 22 ). NS1已展示给 抑制PKR和OAS的激活( 21 ). 此外,NS1蛋白 能够阻止IRF-3的病毒激活( 23 )和NF-κB( 52 ), 促进I型干扰素合成的中心成分。
埃博拉病毒感染的内皮细胞损害了干扰素反应, 表明埃博拉病毒也可能编码干扰素拮抗剂。 之后 用dsRNA、IFN-α或IFN-γ处理,很少诱导 与对照组相比,感染细胞中发现了IFN刺激的基因 未感染细胞( 24 , 25 ). 然而,这并不反映一般情况 信号转导抑制; IL-1β诱导的信号传导没有 在埃博拉病毒感染细胞中被抑制( 24 , 25 ).
在本报告中,我们描述了一种能够识别 抑制I型干扰素诱导的抗病毒反应的蛋白质。 这个 该检测进一步用于筛查埃博拉病毒编码的干扰素 敌手。 该试验使用编码质粒的瞬时转染 I型干扰素拮抗剂促进MDCK细胞的生长 对干扰素敏感的流感delNS1病毒。 因此,流感的表达 病毒NS1蛋白或HSV-1 ICP34.5有效补充 流感病毒delNS1的生长。 使用此分析,我们筛选了 个体埃博拉病毒蛋白拯救生长的能力 MDCK细胞上的流感delNS1病毒。 一种埃博拉病毒蛋白,VP35 发现德尔NS1型流感病毒的生长与该蛋白互补。 VP35型 随后发现可以阻断dsRNA和病毒介导的 IFN-应答启动子和IFN-β启动子。 因此 VP35蛋白可能是I型干扰素的抑制剂 埃博拉病毒感染细胞的反应,可能是一个重要的 埃博拉病毒毒力的决定因素。
材料和方法
细胞和病毒。
MDCK和293细胞保存在DMEM/10%FBS中 细胞保存在DMEM/0.3%BSA(ICN)中。 流感delNS1病毒 在33°C下在7天龄的鸡胚中繁殖( 19 ). 仙台病毒Cantell株在10天龄时在37°C下繁殖 鸡胚。
质粒。
NS1表达质粒pCAGGS-PR8 NS1 SAM已被描述( 23 ). NS1表达质粒pCMV-PR8 NS1 SAM通过亚克隆产生 将NS1 ORF从pCAGGS-PR8 NS1 SAM转换为pcDNA3(Invitrogen)。 HSV-1 γ 1 34.5基因被切除 Nco公司 我 和 巴姆 HI来自质粒pBR4789(B。 芝加哥大学Roizman),其中包含HSV-1 巴姆 HI S1片段,亚克隆到pCAGGS( 26 ).
埃博拉病毒株Mayinga(扎伊尔亚型)用于克隆 (核苷酸编号指埃博拉病毒扎伊尔基因组,GenBank 加入编号 AF086833型 ). ORF和 NP、VP35和VP30基因的非翻译区通过 逆转录PCR,特定引物包含 适当的限制场所。 产品已插入 表达载体pcDNA3。 使用插入NP 巴姆 你好。 VP35(核苷酸3126–4175)通过使用 巴姆 夏威夷群岛 和 不是 I.VP30基因(核苷酸8506-9399)是 通过使用插入 生态 RI和 Xho公司 I.GP和 从质粒pGEM-mGP7和 pGEM-mGP8型( 27 )带有 巴姆 HI和 Hin公司 d三。 这个 Hin公司 dIII位点变钝,插入片段 在 巴姆 HI–高 生态 RV限制位点 pcDNA3.1(+)(Invitrogen)。 基因文库中的RNA-cDNA杂交 埃博拉病毒亚型扎伊尔,马茵加株( 28 )习惯了 扩增VP40和VP24基因。 包含ORF的PCR片段 VP40(核苷酸4410–5779)和VP24(核苷酸10290–11312) 基因被插入 生态 RV限制位置 pcDNA3.1(+)。 克隆经DNA测序证实。
流感delNS1病毒补体检测。
MDCK细胞的高效瞬时转染是通过 使用Lipofectamine 2000(LF2000)(GIBCO/BRL)。 四微克 使用Optimem I将指示的表达质粒调整为50μl 中等(GIBCO/BRL)。 每次转染,调整10μl LF2000 用Optimem I培养基培养至0.25 ml,并在5 ml聚苯乙烯中培养 snap-cap管在室温下放置5分钟。每个50μl DNA样本 加入0.25-ml LF2000/Optimem I混合物中,轻轻搅拌 在室温下孵育20分钟。 汇合处 80厘米 2 用 胰蛋白酶。 用DMEM/10%FBS将细胞培养至12 ml(无 抗生素),在桌面上以1000 rpm造粒5分钟 离心,并在吸入上清液后,重新悬浮在 DMEM/10%FBS(无抗生素),浓度为4× 10 6 细胞/ml细胞的一部分(0.25 ml) 将悬浮液加入35mm的组织培养皿中。 在 20分钟的培养期,1毫升DMEM/10%FBS(无抗生素) 添加到每个DNA/LF2000混合物和DNA/LF2000/培养基混合物中 添加到含有MDCK细胞的培养皿中。 混合后 细胞保持在37°C过夜。 16至20小时 转染后,细胞被感染 10 三 流感的斑块形成单位 delNS1病毒[感染多重性(moi)=0.001] 体积为0.1 ml。去除接种物后,细胞 保存在1.5 ml DMEM/0.3%牛白蛋白/3μg/ml胰蛋白酶中 (胰蛋白酶,1:250;Difco)。
报告人基因检测。
用磷酸钙法转染293细胞( 29 ). 每次转染1×10 6 细胞 含有0.3μg干扰素刺激反应元件(ISRE)驱动的 氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告质粒pHISG-54-CAT ( 30 )或小鼠IFN-β启动子驱动的CAT报告子pIFN-CAT( 52 ), 0.3 猴病毒40启动子荧光素酶报告质粒的μg pGL2-Control(Promega)和4μg所示表达质粒。
转染后20小时,对细胞进行模拟处理, 用40μg polyI:polyC(Amersham Pharmacia)转染 LF2000符合制造商建议,或感染 带有流感病毒delNS1或仙台病毒,每种病毒的moi为1.0 病毒。 所有方法处理的细胞都保存在DMEM/0.3% 牛白蛋白。 治疗后24小时,细胞 采集并在Reporter Lysis Buffer(Promega)中溶解。 CAT分析 按说明执行( 31 ). 荧光素酶分析使用 Promega荧光素酶分析系统,根据制造商的 指示。
Western Blot分析。
293个细胞被转染4μg所示质粒 如上所述,使用LF2000。 转染48小时后, 细胞在SDS/PAGE样品缓冲液中进行裂解,并进行Western blots 按照标准程序执行。 甲型流感病毒 用抗PR8 NS1兔多克隆抗体检测NS1蛋白 抗血清5091按1:1000稀释。 埃博拉病毒NP和VP35 用山羊多克隆抗埃博拉病毒检测蛋白质 抗血清(从Vector Laboratories购买),稀释度为1:20000。 次要抗体为抗兔或抗羊抗体 与辣根过氧化物酶结合。 使用执行检测 NEN Renaissance Western blot化学发光试剂。
Northern Blot分析。
用5μg的空载体或 利用LF2000构建VP35表达质粒。 20小时 转染后,细胞感染了流感病毒delNS1 或moi为1的仙台病毒。 24小时后,总RNA 使用TRI试剂提取(辛辛那提分子研究中心)。 使用10微克总RNA进行Northern blot分析 使用Quickhyb杂交溶液(Stratagene)。 干扰素-β或 β-肌动蛋白mRNA通过特异性杂交检测 [ 32 P] ATP标记探针。
结果
已知干扰素拮抗剂的表达对流感生长的补充作用 德尔NS1病毒。
流感病毒delNS1在产生干扰素的细胞上生长不良,如 MDCK细胞。 然而,野生型PR8病毒与流感同基因 delNS1病毒除了产生NS1蛋白外,会增长到较高水平 MDCK细胞的滴度( 12 ). 因此,确定是否 高效转染NS1表达的MDCK细胞 质粒将补充流感delNS1病毒的生长(图。 1 ). 当MDCK细胞被转染 流感病毒NS1质粒,24小时后感染 流感病毒delNS1在低分子量时,变异病毒生长到 约1×10 6 pfu/ml。然而, 转染空质粒的细胞感染产生 10 2 pfu/ml或更低(图。 1 ).
图1。
流感病毒delNS1的生长得到短暂的补充 A型流感NS1蛋白或HSV ICP34.5表达的转染 质粒。 MDCK细胞转染4μg空表达 质粒,pCAGGS-PR8 NS1 SAM( 23 ),或 pCAGGS-γ 1 34.5. 20小时后,这些细胞 感染了流感病毒delNS1(moi=0.001)。 四十八 转染后h,通过菌斑试验测定病毒滴度。 结果是两个独立实验的平均值。
然后确定另一种已知的 I型干扰素诱导的抗病毒反应HSV-1 ICP34.5将 补充流感病毒delNS1的生长。 的表达式 HSV-1编码的PKR拮抗剂ICP34.5( 11 )明显互补的增长 德尔NS1型流感病毒(图。 1 ). 这一结果表明 流感delNS1病毒生长的互补性反映了抗干扰素 功能。 它还表明这种互补分析可以使用 鉴定抑制干扰素诱导的抗病毒药物的其他蛋白质 响应。
埃博拉病毒VP35蛋白对delNS1型流感病毒生长的补充作用 蛋白质。
然后使用流感delNS1病毒互补分析 筛选埃博拉病毒编码的干扰素拮抗剂。 一个空向量 NS1表达质粒或编码单个埃博拉病毒的质粒 蛋白转染MDCK细胞。 20小时 转染后,细胞被流感病毒delNS1感染。 感染48小时后,收集上清液并 通过斑块试验测定病毒滴度(表 1 ). 唯一一种埃博拉病毒蛋白 增强的流感delNS1病毒生长是VP35蛋白(表 1 ). 时间-过程分析清楚地表明流感的增强 通过VP35生长delNS1病毒(图。 2 ).
表1。
表达蛋白
pfu/毫升
清空 矢量
10
国家标准1
1.2 × 10 6
NP公司
10
VP35型
1.9 × 10 4
第40页
<10
普通合伙人
<10
sGP公司
20
VP30(视频处理30)
<10
视频处理24
<10
图2。
埃博拉病毒补充了流感病毒delNS1的生长 VP35蛋白。 MDCK细胞转染4μg空 表达质粒(pcDNA3)、NS1表达质粒或埃博拉病毒 VP35表达质粒。 20小时后,这些细胞 感染了流感病毒delNS1(moi=0.001)。 病毒滴度 在指定时间通过菌斑试验测定。
埃博拉病毒VP35蛋白的表达阻断了 ISRE推广人。
确定VP35是否抑制dsRNA和病毒介导的 激活IFN敏感基因表达,转染细胞 带有ISRE驱动的CAT报告质粒和组成性 表达,猴病毒40启动子驱动荧光素酶报告质粒。 此外,用空载体NS1转染细胞 表达质粒,VP35表达质粒,或作为附加 对照,埃博拉病毒NP表达质粒。 一天后,细胞 模拟处理、转染dsRNA或感染 流感病毒delNS1或仙台病毒Cantell株( 已知可诱导大量干扰素的减弱菌株)。 之后 另外24小时,制备细胞裂解物并检测CAT 活性和荧光素酶活性(图。 三 一 ). 细胞转染 携带dsRNA或感染delNS1流感病毒或仙台 该病毒对干扰素敏感启动子有强烈的诱导作用。 什么时候? 存在NS1或VP35,表达自IFN应答 启动子几乎完全被阻断。 ISRE诱导水平, 归一化为荧光素酶活性水平,如图所示。 三 一 .对照荧光素酶报告质粒的表达 未被NS1或VP35的表达抑制(数据未显示)。 埃博拉病毒NP的表达,不补充 流感病毒delNS1,不抑制ISRE启动子的激活 (未显示数据)。 NS1、VP35和NP蛋白的表达 通过Western blotting(图。 三 B类 ). 这些结果表明 NS1和VP35都可以阻断I型IFN的产生和/或 对dsRNA治疗或病毒感染作出反应的信号。
图3。
埃博拉病毒VP35蛋白的表达抑制dsRNA-或 病毒介导的ISRE诱导。 ( 一 )折叠感应 空载体存在下的ISRE启动子–CAT报告基因, NS1表达质粒或VP35表达质粒。 293个细胞 用4μg指定表达质粒加0.3转染 μg报告质粒pHISG-54-CAT和pGL2-Control。 转染后20小时,对细胞进行模拟处理或 用指示的干扰素诱导剂处理。 CAT活动包括 归一化为相应的荧光素酶活性以确定褶皱 归纳。 ( B类 )Western blot显示NS1、VP35和埃博拉病毒 病毒NP表达。 用4μg 指示质粒。 48小时后,制备了细胞裂解物 并通过使用所指示的抗血清进行蛋白质印迹。
埃博拉病毒VP35蛋白的表达阻断了 INF-β启动子。
在野生型甲型流感病毒感染的细胞中,NS1蛋白阻断 诱导I型干扰素。 这一块很大程度上是由于 NS1阻止IRF-3激活的能力( 23 )和NF-κB( 52 ), 两种转录因子在刺激 合成干扰素-β。 反过来,IFN-β的合成也起着重要的作用 在I型干扰素级联启动中的作用( 32 ). 拉病毒 因此,对VP35进行了阻断 干扰素-β启动子。
空载体、NS1表达质粒或VP35表达质粒 用小鼠IFN-β启动子驱动的CAT报告子和 猴病毒40启动子驱动荧光素酶报告子。 当单元格 随后用dsRNA转染,强烈诱导 在空载体转染细胞中观察到IFN-β启动子,但 当NS1或VP35表达时,这种诱导被阻断(图。 4 一 ).
图4。
埃博拉病毒VP35蛋白抑制IFN-β的诱导 发起人。 ( 一 )小鼠诱导的抑制作用 IFN-β启动子。 用4μg 指示表达质粒加上每个报告者0.3μg 质粒pIFN-β-CAT和pGL2-对照。 20小时 转染后,细胞被模拟转染或转染 40μg聚I:聚C。 ( B类 )Northern印迹显示 VP35介导的内源性IFN-β诱导抑制。 用空载体或VP35表达转染293细胞 质粒。 20小时后,细胞被模拟感染(−)或 感染了流感病毒delNS1(delNS1)或仙台病毒(SeV) (莫伊=1)。 在10小时或 转染后20小时。 模拟转染细胞RNA制备于 与感染后20小时的样本相同。 北部斑点 检测干扰素-β或β-肌动蛋白mRNA。 请注意,总数较少 当细胞,包括模拟感染细胞 在感染后20小时溶血。
还确定了VP35是否可以阻止 内源性人干扰素β启动子。 细胞被转染 使用空载体或VP35表达质粒,24小时后, 模拟感染或感染了delNS1流感病毒或仙台 病毒。 感染后10或20小时,分离出总细胞RNA, 并进行Northern blot检测IFN-βmRNA(图。 4 B类 ). VP35的表达明显阻断了 内源性IFN-β启动子。 感染前 病毒,IFN-βmRNA未检测到。 感染后,当IFN-β 研究发现,信使核糖核酸水平被标准化为β-肌动蛋白信使核糖核酸水平 在流感病毒delNS1感染的细胞中,VP35的存在 感染后10小时IFN-β诱导减少8倍 在转染后20小时时为8.4倍。 在仙台病毒感染细胞中, VP35的存在使IFN-β诱导在10小时时减少了6.1倍 转染后20小时为5.9倍。
埃博拉病毒VP35与 埃博拉病毒NP。
VP35蛋白是埃博拉病毒RNA的重要组成部分 合成复合物和可能与病毒NP相关( 33 , 34 ). 因此,可以确定埃博拉病毒VP35是否保留了其 与埃博拉病毒共存时干扰素的拮抗特性 NP病毒。进行ISRE报告分析,其中细胞接受 空矢量、VP35单独、NP单独或VP35和 NP.转染后24小时,细胞被转染 dsRNA或感染仙台病毒。 如前所述,转染 空质粒或NP表达质粒未阻断 激活ISRE启动子,但VP35的表达确实阻断了其 激活(图。 5 ). 此外, VP35和NP的共同表达能够阻断ISRE对 与VP35单独表达的程度相同(图。 5 ). 这些数据表明 VP35,即使与埃博拉病毒NP共存,也可以作为 干扰素拮抗剂。
图5。
埃博拉病毒VP35蛋白抑制I型干扰素诱导 与埃博拉病毒NP共表达。干扰素诱导物的折叠诱导 空载体、VP35、NP或VP35存在时由ISRE驱动的报告者 再加上NP.293细胞,共转染4μg 表达质粒,包括2μg编码an的质粒 单个蛋白质和2μg第二个质粒(空载体 或第二个表达质粒)加上每个报告者0.3μg 质粒pHISG-54-CAT和pGL2-对照。 20小时 转染后,对细胞进行模拟处理或用 指示干扰素诱导剂。 入职后20小时,CAT和 进行荧光素酶分析。 CAT活动标准化为 相应的荧光素酶活性决定褶皱的诱导。
讨论
在这份报告中,埃博拉病毒VP35蛋白被鉴定为 干扰素拮抗剂基于其补充生长因子的能力 流行性感冒delNS1病毒。 VP35与 甲型流感病毒NS1蛋白,HSV-1 ICP34.5(图。 1 )、和 痘苗病毒E3L蛋白(未发表的观察结果)。 每一个 蛋白质已被证明会干扰 干扰素诱导的抗病毒反应。 甲型流感病毒NS1蛋白 阻止了I型干扰素的生产( 12 )以及 干扰素诱导的抗病毒蛋白PKR( 21 , 35 , 36 )和OAS(未发布 观察)。 至少会抑制I型干扰素的产生 部分原因是因为NS1阻断了潜在转录的激活 因子IRF-3和NF-κB( 23 , 52 )参与dsRNA- 以及病毒介导的IFN-β启动子激活。 这些抑制 功能可能由NS1结合dsRNA介导( 21 , 23 , 52 ). 痘苗病毒E3L蛋白也阻断了PKR的激活 ( 37 – 40 )和OAS( 41 ). 此外,E3L表达促进 干扰素存在下的痘苗病毒( 40 , 42 ). HSV-1 ICP34.5 通过靶向对抗I型干扰素抗病毒反应 磷酸化的eIF-2α,活化的PKR的产物。 明确地, ICP34.5结合细胞蛋白磷酸酶1α并将其重定位于 eIF-2α( 11 ). 由此产生的eIF-2α去磷酸化 抵消PKR功能( 11 ). 因此,病毒突变体未能 使ICP34.5在小鼠中减弱并表现出有限的组织向性 ( 43 , 44 ). 然而,与流感病毒delNS1一样 这些突变体在缺乏I型干扰素关键基因的小鼠中得到恢复 信号转导或在缺乏PKR的小鼠中( 45 , 46 ). 因为HSV-1 ICP34.5 拯救流感病毒delNS1的生长,VP35介导的PKR阻断 功能可能足以增强流感delNS1病毒 增长。 然而任何数量的机制都可以完成这一任务, 包括对PKR功能的直接影响,I型块 干扰素诱导的信号,如干扰素应答基因(包括PKR) 不是转录激活的,也不是干扰素合成的障碍。 我们 也证明VP35与A型流感病毒NS1蛋白一样, 防止dsRNA和病毒介导的含ISRE的激活 促进剂(图。 三 )和IFN-β启动子(图。 4 ). 在阻塞中 病毒诱导IFN、VP35的产生将阻止其建立 未感染细胞和感染埃博拉病毒的细胞都处于抗病毒状态 细胞,从而促进病毒复制。
此前,VP35已被证明在埃博拉疫情中起着重要作用 病毒RNA合成( 33 ). VP35似乎是 副粘病毒和鼠李病毒P蛋白(磷酸蛋白)( 33 ), 尽管丝状病毒VP35蛋白只有微弱的磷酸化 ( 47 ). 另外两条非分段负链的干扰素拮抗剂 SV5 V蛋白和仙台病毒C蛋白也是 编码在P基因中。 然而,这些副粘病毒蛋白不是 相当于P蛋白。 仙台病毒C蛋白由 在交替启动密码子处启动并被读取的重叠ORF 从另一个阅读框( 48 ). SV5 V蛋白有一个共同点 P蛋白的氨基末端; 然而,由于插入 非模板编码G残基的病毒聚合酶,即V蛋白 具有与P蛋白不同的羧基末端。 没有证据表明从 埃博拉病毒VP35基因。 附近没有有效长度的ORF 编码C蛋白的VP35基因的5′端。 此外, 虽然埃博拉病毒聚合酶的mRNA编辑发生在 GP基因( 27 , 49 ),没有证据表明存在RNA编辑 VP35基因内的信号,也没有证据表明 编辑过的VP35基因产物。 根据我们的研究结果,P 其他非片段化负链病毒的蛋白质也应该 检查干扰素拮抗能力。
干扰素拮抗剂的产生可能有助于 埃博拉病毒。 在人类中,似乎合适的细胞因子 反应与无症状或非致命的发展有关 埃博拉病毒感染( 50 ). 因此,影响I型病毒因子 干扰素的产生可能影响病毒病理学。 从 干扰素拮抗剂存在的其他病毒的研究 完全毒力所必需的。 例如,野生型流感 A/PR/8/34病毒在野生型小鼠中致病 (劳埃德 50 = 10 2 –10 三 pfu),但 流感病毒delNS1被严重减弱 (劳埃德 50 > 10 6 PFU)。 然而, 当IFN诱导的抗病毒反应不存在时,如 STAT1(状态1) −/− 小鼠,流感delNS1病毒是 几乎和野生型病毒一样致命( 12 ). 此外,流感 带有截短NS1蛋白的病毒显示出减少 在野生型小鼠中复制( 19 ). 同样,HSV-1突变体 产生ICP34.5在野生型小鼠中减弱,但在干扰素中不减弱 受体 −/− 老鼠或 巴基斯坦卢比 −/− 小鼠( 45 , 46 ). 到实验 评估VP35干扰素拮抗作用对埃博拉病毒的意义 病毒的毒力,最终将有必要产生病毒 保持基因组复制能力的突变体 缺乏VP35编码的IFN抑制功能。 开发 埃博拉病毒反向遗传系统 已完成( 33 ),将促进此类分析。 它也将是 有兴趣评估VP35蛋白的相对干扰素抑制效力 埃博拉病毒株显示出不同水平的 人类致病性。
这份手稿中描述的流感delNS1补体分析 为筛选蛋白质提供了一种简单的方法 干扰素拮抗功能。 使用此系统,应该可以 识别其他病毒的蛋白质,如埃博拉病毒VP35 蛋白质,作为干扰素拮抗剂。 小说的识别, 病毒编码的干扰素拮抗剂将进一步加深我们对如何 病原体逃避先天免疫反应。 此外 病毒编码的干扰素拮抗剂可能是生成干扰素的理想方式 针对各种不同病毒的稳定、减毒活疫苗 病原体。 这种方法已经在针对流感进行调查 病毒( 19 ). 病毒编码的干扰素拮抗剂也可能成为 针对重要人类病原体的新型抗病毒药物。 抑制 病毒干扰素拮抗剂的活性应导致 感染细胞中的抗病毒途径及其伴随的抑制 病毒复制。
致谢
我们感谢Louis Nguyenvu提供的出色技术援助。 这个 这项工作得到了美国国立卫生研究院的支持 通过研究资助获得C.F.B.博士后服务奖 从美国国立卫生研究院到A.-G.S和P.P.以及从 Deutsche Forschungsgemeinschaft发送给E.M.和H.-D.K。
缩写
NP公司
核蛋白
普通合伙人
糖蛋白
dsRNA
双链RNA
美洲国家组织
2′,5′-寡腺苷酸合成酶
以色列可再生能源公司
干扰素刺激反应元件
普通合伙人
糖蛋白
功率因数校正单元
成斑单元
莫伊
感染的多重性
MDCK公司
马丁·达比 犬肾细胞
巴基斯坦卢比
dsRNA-依赖性蛋白激酶R
CAT公司
氯霉素乙酰转移酶
脚注
印刷前在线发布的文章: 程序。 国家。 阿卡德。 科学。 美国 , 10.1073/pnas.220398297。
文章和出版日期见www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.220398297
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