调节T细胞激活、焦虑和男性攻击由RGS2提供

rgs2型突变小鼠。

编码RGS结构域的RGS2外显子4和5被替换为PGK-新^R（右）在反义方向。G418-抗性用PCR和Southern blot筛选E14K胚胎干细胞用于同源重组。靶向ES细胞克隆为注入C57BL/6囊胚和杂合子rgs-2型^+/−通过与嵌合体交配获得的小鼠C57BL/6J小鼠。PCR引物：野生型等位基因（5′-CCGAGTTCTGAAGAAAACATTG3′；5′GGGACTCCTGCTCATGTAGCAT3′）和突变等位基因（5′-GCTAAAAGCGCATGCTCCAGAC-3′；5′-GGCCCCACATTACACGAAC-3′）。所有实验均使用C57BL/6J背景的同窝小鼠（F5代）和小鼠按照机构指南进行维护。

免疫细胞术。

对胸腺、淋巴结和脾脏的单细胞悬浮液进行染色与FITC-、藻红蛋白-或生物素缀合的Abs反应CD3ɛ、TCRαβ、CD4、CD8、CD25、CD44、CD28、CD69、CD11b（Mac-1）、，CD11c、B220、CD43、sIgM、sIg D或Gr-1。生物素化抗体使用链霉亲和素RED670进行可视化。样品分析方法流式细胞术使用FACScan（Becton Dickinson）。

T细胞和B细胞分析。

对于增殖试验，用PMA（10 ng/ml，佛波酯-肉豆蔻酸酯醋酸盐）+钙⁺²可溶性离子载体（100 ng/ml，离子霉素）抗CD3（0.1–1μg/ml，克隆145–2C11）、抗CD28（0.02–0.2μg/ml，克隆37.51）或重组小鼠IL-2（50单位/ml）一式三份，持续12、24、48、72或120小时，然后进行12小时脉冲带有[^三H] 胸腺嘧啶（1μCi/ml）。细胞因子通过ELISA测定产量。用于B细胞分析，脾B淋巴细胞被纯化（90-95%的B220⁺单元格）通过负磁分选和各种刺激激活。基础血清Ig水平（IgM、IgG1、IgG2a、IgG-2b、IgG3和IgA）为通过ELISA测定(20). 用于淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）感染，小鼠感染了LCMV（700个斑块形成单位，（s.c.）进入后脚垫。每天测量细胞浸润如前所述(21).

行为研究。

对4至5个月大的性别匹配的同窝小鼠进行检查神经运动功能(22)：触须、眼睛、，抬高/支撑/站立、肌肉张力、尾巴悬吊引起的转弯肢体/手指伸展、耳朵反射、眨眼和瞳孔对淡淡、甜味/苦味的接受/拒绝的反应，以及朝向声音的方向。昼夜活动和野外活动（即。，笼式交叉、总距离、垂直运动）装有红外传感器的笼子。勘探测试由执行将老鼠放在白色圆盘（直径183-cm）的中央或者没有对象分布在四个象限中。老鼠是视频跟踪（七次试验）。对粪便颗粒和粪便进行计数。电动机通过旋转杆任务分析协调性。对于平衡任务老鼠被尾巴抓住，可以抓住悬空的水平线带有后肢的木棒（3毫米），并记录时间让老鼠把自己拉到平衡和摔倒的次数。

在空间水迷宫中对小鼠进行了7天的研究西南象限隐伏台地(22). 第7天，最后一次调查进行试验（无平台水池中60s）。从第8天到16，随着平台向东北方向移动，重新进行了测试象限（反转，每天2次试验）。找到平台和测量总距离。在T迷宫测试中，在第1天，小鼠被放置在一个空迷宫中10分钟，只能进入迷宫中央和右臂。在迷宫周围放置了几个物体作为线索。打开第2天，每个受试者再次被放置在T型迷宫中，并获得迷宫的左臂。观察小鼠5分钟记录在新地区和第一选择的时间。下台还进行了回避试验，要求小鼠请记住，在离开安全平台之前，会导致脚部受伤冲击（1s，0.12 mA）。平台上的延迟记录在每个试验。使用塑料管的位移测试攻击性（长30厘米，长3.05厘米）。A类rgs公司2^−/−和室友控制鼠标释放到管子的两端，第一只老鼠退出被认为是“失败者”，也就是说，这只老鼠被认为是两者中攻击性较小的。对于光/暗偏好测试，笼子分为黑暗和光明两部分每只老鼠每半只测量一次。

电生理学。

电生理学研究按所述进行(23).将单个海马脑片（400μm）与人工脑脊液（2毫升/分钟；95%饱和O（运行）₂和5%CO₂30°C）。在10 kHz下对场电位进行采样，并用电路板6软件（Axon Instruments，加利福尼亚州福斯特市）。场兴奋性突触后电位（EPSP）用置于辐射层中的微量移液管（2–4 MΩ）记录CA1区域。在沙弗抵押品处进行刺激。测试刺激频率为0.1Hz。破伤风刺激包括四组100-Hz的刺激以10-s的间隔持续500ms。EPSP斜率由上升阶段的线性回归计算得出峰值响应的10–65%。EPSP斜率的基线值为从最初5分钟开始，定义为100%。通过绘制振幅来构建输入/输出关系突触前截击（输入）vs.EPSP斜率（输出）。

rgs2型基因靶向。

这个rgs2型通过替换使ES细胞中的位点失活外显子4和5对应于RGS结构域（图。1A类). 培育嵌合小鼠获得突变株的种系传播rgs2等位基因（图。1 B类和C类). 这个rgs2型突变大脑组织的Northern印迹分析表明，该结果无效（图。1D类).rgs2型^−/−老鼠是出生于预期的孟德尔频率，有生育能力正常生长。无解剖或组织学异常观察。所有造血谱系的分化，包括中性粒细胞、巨噬细胞、红细胞和血小板在rgs2^−/−老鼠。

缺陷增殖和IL-2的产生rgs2型^−/−T细胞。

因为TCR后激活的T细胞中诱导RGS2表达有丝分裂原如ConA或PMA-plus的参与或刺激钙²⁺离子载体（PMA+Iono）（参考。14而数据不是如图所示），我们确定RGS2是否在T细胞激活中起作用。rgs2型^−/−小鼠数量正常CD4亚群⁺和CD8⁺T型淋巴器官中的细胞和B细胞（图。2A类). 这个TCRαβ、CD3、CD4、CD8、CD28、CD45、CD5、，硫酸钾^b条两个脾脏上的CD44、LFA1、CD25和CD69和淋巴结外周CD4⁺和CD8（CD8）⁺T细胞在rgs2型^+/−和rgs2型^−/−老鼠（未显示）。检查外周T细胞功能，来自淋巴结的T细胞rgs2型^+/−和rgs2型^−/−室友被刺激抗CD3抗体、抗CD3加抗CD28抗体或PMA加钙²⁺-电离层。扩散在里面体外属于rgs2型^−/−T细胞是由于TCR的参与，赤字大幅减少CD28协同模拟无法克服（图。2B类). 与RGS2的标识一致活化T细胞中的早期反应基因(13–14)，增殖的刺激24h时缺陷最明显。诱导和细胞凋亡动力学在rgs2型^+/−和rgs2型^−/−T细胞（未显示）。因此，RGS2作为T细胞TCR激活的直接早期基因下游细胞。

除了增殖缺陷外，rgs2型^−/−T细胞显著产生与对照组相比，T细胞生长因子IL-2水平较低（图。2C类). IL-2不足就其本身而言不会解释增殖缺陷，因为补充IL-2没有恢复增殖正常（图。2B类). 这个高亲和力IL-2受体α链（CD25）及其活化标志物CD69、CD44、ICAM1和CTLA4在正常范围内上调正常动力学rgs2型^−/−T细胞对TCR介入或丝裂原治疗的反应（未显示）。这个T细胞增殖功能缺陷（图。2B类)和细胞因子的产生（图。2C类)也可以在中观察到rgs2型^−/−T细胞用PMA/钙²⁺电离层，一种绕过的刺激物近端TCR信号。与这一发现一致，动力学和早期TCR介导的信号事件的程度，包括钙²⁺动员，整体酪氨酸磷酸化以及MAPK和SAPK/JNK的激活在rgs2型^−/−淋巴结T细胞（未显示），表明其近端TCR信号通路完整。

关于B细胞，rgs2型^−/−老鼠显示正常数字和微分（未显示）。在体外扩散rgs2型^−/−B类细胞对抗IgM抗体治疗的反应F（ab′）₂抗IgM Ab片段、抗CD40片段，或LPS与rgs2型^+/−B类电池（图。2D类和数据未显示）。此外，基线血清Ig水平与rgs2型^−/−和rgs2型^+/−老鼠。因此，不需要RGS2用于B细胞激活。我们的结果表明，抗原受体触发了增殖和IL-2需要T细胞中RGS2的表达生产。

趋化因子是T细胞功能的关键调节因子，通过静止和活化T细胞表面表达的GPCR(24).研究还表明，RGS家族成员在细胞系可以调节趋化因子受体信号(18). 然而，没有在休息和预激活（6小时）之间观察到差异在趋化因子治疗前用抗CD3激活）rgs标准2^+/−和rgs标准2^−/−CD4细胞⁺或CD8⁺增殖或细胞中的T细胞趋化因子SDF-1α、RANTES或MIP-1α引起的迁移（未显示）。这些结果并不排除RGS2对T细胞的调节对其他趋化因子受体介导的信号的反应性。此外，rgs标准2^+/−和rgs标准2^−/−T淋巴细胞显示对GPCR激动剂溶血磷脂酸的类似反应，组胺和腺苷（未显示）。功能如下的GPCRRGS2控制下的T细胞尚待鉴定。

免疫力受损rgs2型^−/−老鼠。

确定RGS2是否在T细胞反应中起作用在里面活泼地,rgs2型^+/−和rgs2型^−/−在脚垫中注射老鼠带LCMV(21).rgs2型^+/−小鼠产生了从第6天开始，LCMV诱导的有效脚垫肿胀反应感染后（图。三). 相比之下足垫肿胀反应明显减少rgs2型^−/−小鼠，表明RGS2有效的抗病毒反应需要表达在里面活泼地因此体外扩散赤字和IL-2的产生rgs2型^−/−T细胞转化为抗病毒反应受损体内,表明RGS2表达在生理上与正常T细胞功能。这些结果提供了第一个遗传证据RGS蛋白在淋巴细胞活化中起作用。

RGS2控制男性攻击和焦虑。

在我们评估突变小鼠的过程中，我们注意到了不寻常的战斗男性之间rgs2型^+/−和rgs2型^−/−有时导致严重受伤。刺激触发长期可塑性中枢神经系统诱导海马、皮层、，尾状壳核、纹状体和杏仁核(15–16). 因为这些地区调节各种行为途径，我们调查RGS2是否在中枢神经系统功能中起作用。我们首先确定RGS2是否小鼠的缺乏导致运动功能的改变。两者都有rgs2型^−/−和rgs2型^+/−同窝小鼠表现正常电机响应（测试列于材料和方法).突变小鼠的昼夜活动正常（图。4A类)，这是探索性的在两次独立的野外和勘探试验期间的行为（不是如图所示）。rgs2型^−/−老鼠也表现出旋转杆的适当性能（图。4B类)和平衡测试（未显示），确认神经系统的完整性负责运动协调和平衡的途径。空间和条件学习，由隐藏平台、水迷宫、，和被动回避测试，在rgs2型^−/−和rgs2型^+/−同窝的人。长期个体Schaffer侧支CA1通路的增强海马切片在rgs2型^−/−和rgs2型^+/−鼠标（图。4C类). 这些数据表明RGS2缺陷对电机没有明显影响反应、昼夜节律活动、探索行为、运动协调，或空间学习和记忆。

社会支配和领土侵略是很有特色的雄性小鼠的行为(25). 有趣的是，rgs2型^−/−雄性小鼠表现出显著的与他们相比减少了攻击行为rgs2型^+/−室友，而攻击行为rgs2型^−/−女性的小鼠是正常的（图。5A类).因为攻击与焦虑有关(25)，我们受到rgs2型^−/−雄性小鼠到光明/黑暗偏好测试。rgs2型^−/−小鼠表现出与相比，更喜欢黑暗rgs2型^+/−控制室友（图。5B类)表明焦虑加剧。与此一致行为表型，rgs2型^−/−老鼠是发现粪便颗粒脱落量明显高于rgs2型^+/−在光/暗偏好测试（2.3±0.6 vs.0.8±0.3颗粒）和勘探试验（3.5±0.6 vs.1.3±0.6颗粒）。此外，rgs2^−/−老鼠表现出对声音惊吓的反应增强。这些数据显示RGS2控制神经回路的攻击性和焦虑。

RGS2在突触发育和基底电活动中的作用海马CA1神经元。

恐惧和焦虑通常涉及杏仁核和某些成分海马对杏仁核的输入会影响恐惧(26).海马CA1区神经元向杏仁核投射海马体的切除会影响恐惧行为(27).此外，还提出RGS2可以调节活动G蛋白偶联代谢型谷氨酸受体1与海马体长期突触可塑性有关(28).详细检查rgs2型^−/−老鼠结果显示海马体中神经元的数量（图。6 A–D)，在另一个大脑中细胞核、脑干、小脑和皮层（未显示）受RGS2缺陷的影响。有趣的是，树突大脑皮层神经元的形态和分支具有可比性rgs2型^+/−和rgs2型^−/−小鼠，海马CA1神经元rgs2型^−/−小鼠表现出显著的与相比，顶棘和基底棘密度降低那些rgs2型^+/−控制室友（图。6E类). 脊椎的数量与突触数量相关和神经元可塑性(29). 重要的是脊椎数rgs2型^−/−CA1神经元与显著减少的电气输入/输出相关这些单元格中的关系（图。7 A类和B类). 这些数据表明，RGS2在海马CA1突触发育与基础电活动神经元。

攻击行为和恐惧反应的改变很重要高度流行的精神疾病的表现，如抑郁或成瘾行为。因为这些疾病承担着巨大的社会经济负担，这对确定可能参与启动和/或这些行为“特征”演变为临床表现“疾病。”多个G蛋白偶联受体可以调节这些行为以及调节这些行为的药物受体已被开发用于缓解焦虑症和侵略。我们的研究提供了遗传证据G蛋白信号转导的分子调节因子RGS2导致受损海马突触发育，减少男性攻击性行为，增加恐惧。因此，RGS-家族成员，如RGS2可能与人类的遗传倾向有关神经精神障碍，可能成为新一代神经药物。rgs2型^−/−老鼠也是一种有用的动物阐明恐惧和男性攻击的分子机制的模型。

G蛋白偶联受体调节发育、细胞激活和行为。本研究表明RGS2是RGS家族的一员，在T细胞中起重要作用增殖和IL-2生成。T细胞激活缺陷观察体外转化为抗病毒功能受损响应体内表明RGS2在生理上与正常T细胞功能和建立有效的抗病毒免疫反应。此外，缺乏RGS2的小鼠表现出明显减少攻击性行为和增加焦虑在没有任何可测量的认知和运动缺陷的情况下。此外，形态和电生理分析表明RGS2的表达是突触产生所必需的海马CA1神经元的可塑性。因此，RGS2至关重要调节T细胞活化、神经元功能和情绪恐惧，和侵略体内.