甘丙肽和神经肽Y减少麻醉小鼠心脏的胆碱能传递

动物

所有实验均获得新南威尔士州动物护理和伦理委员会的批准，并符合澳大利亚国家卫生和医学研究委员会的动物使用规范。

靶向破坏神经递质GAL、甘丙肽敲除的小鼠纯合子（GAL-KO，129 SvJ背景；威尼克等1998年)以及阻断甘丙肽1R受体敲除的纯合子（GAL-1R-KO，129 SvJ背景；雅各比等2002年,2002年b)年龄在12至30周之间，由Tiina Iismaa博士（澳大利亚达林赫斯特加文医学研究所）繁殖。每个基因敲除组的对照小鼠背景相同。

实验程序

用五巴比妥钠（Nembutal，Boehringer Ingelhiem；30mg/kg⁻¹，腹腔注射）。在整个实验期间，根据需要给予补充剂量的麻醉剂（用生理盐水稀释1:10）。气管在每只小鼠颈部高位插管，并连接到一个正压啮齿动物呼吸机上（Ugo Basile 6025）。在实验期间，每只小鼠都进行人工通风。调整呼吸频率和潮气量并监测血气通过血气分析仪（Corning 278血气分析仪），用于微调通风参数(第页O（运行）₂≈80毫米汞柱，第页一氧化碳₂≈40 mmHg，pH 7.4）。在整个实验期间，对血气进行了多次检查，如有必要，还对呼吸泵的潮气量或频率进行了调整。调整后，再次检查血气。股动脉插管以连续记录动脉血压通过Statham生理压力传感器（P23XL），股静脉插管给药。监测温度通过直肠探头，保持在37±1°C。皮下针电极用于记录心电图（ECG），心电图显示在存储示波器（Gould 1401）上，以监测脉冲间隔（PI）记录的正确触发。ECG用于在使用Neurolog模块（Digitimer，英格兰：NL 200、303、601）进行处理后获得PI（心跳间隔时间）。PI和BP均记录在Grass测谎仪（79型，Grass仪器）上，并使用数据采集和分析系统（Grass仪器，Polyview）进行数字存储。切断颈部高位迷走神经前后，分别测定静息PI（心跳间隔时间）和平均动脉压（MAP）。切断神经以消除迷走神经介导的对心率的反射效应，这种反射效应是在注射肽后血压升高时发生的。

Vagal隔离

清除右迷走神经外周端的结缔组织，将其置于铂电极上，每隔30秒用方波刺激器（Grass SD9）以7.5 V、1 ms、2–4 Hz的超高电压刺激5秒。所选择的使用频率是PI增加了～50 ms（即在151 ms的静息PI下，50 ms的PI增加相当于HR减少98次/min⁻¹对于对照组小鼠（心率从397次变为299次⁻¹)；心率下降111次/分⁻¹对于静息PI为141 ms的GAL-KO小鼠（HR从425次变为314次⁻¹：请参阅图1a顶部面板）；在静息PI为130ms的GAL-1R-KO小鼠中，50ms的PI增加相当于128次/分的HR减少⁻¹（心率从461次变为333次⁻¹)在相应的对照小鼠中，心率变化为145次/min⁻¹（心率从496次变为351次，最小⁻¹：请参阅图1a底部面板）。迷走神经刺激诱发的PI（ΔPI）变化与刺激频率呈线性关系，而与静息PI无关（参见帕克等., 1984)刺激迷走神经后心率下降的幅度取决于静息心率，而不是线性相关。我们选择使用ΔPI，因为它与刺激频率呈线性关系。

交感神经隔离

在小鼠中，由于心脏神经的大小和位置，无法像在大鼠中那样识别心脏神经(史密斯-怀特等., 2002). 因此，位于颈部、迷走神经背侧和颈动脉附近的一条细神经被追踪到心脏，并在受到刺激时通过心脏加速被识别为交感神经分支。向心脏方向刺激神经，引起心率增加，可被普萘洛尔阻断，血压略有增加，与交感神经激活一致。将神经从所有组织中取出，以避免刺激扩散，并放置在铂电极上，在未受刺激时保持覆盖和湿润。用刺激参数刺激神经：25 V，1 ms，以10 Hz的频率持续2 min。较低电压10 V，6 Hz在短时间内抑制迷走神经性心动过缓，并在服用与NAd作用一致的普萘洛尔后被废除。较高刺激诱发的抑制存活β-肾上腺素受体阻滞。交感神经刺激期间，迷走神经不受刺激。

记录程序和分析

心脏交感神经刺激和GAL团注被提议用来减弱随后由迷走神经刺激引起的心脏减慢。我们将刺激迷走神经引起的PI（ΔPI）增加抑制百分比的大小解释为NPY和相关类似物的连接前活性的指示(波特等., 1989). 这是使用以下公式计算的：

ΔPi_c（c）是控制期迷走神经刺激诱发的PI增加和ΔPI_t吨是治疗期的反应。治疗期是指出现肽或交感神经刺激后PI增加的变化。ΔPi的计算方法为Polyview公司（Grass Instruments）通过迷走神经刺激后PI增加产生的曲线下区域。T型₅₀是从最大限度抑制迷走神经刺激引起的PI增加中恢复抑制反应的一半时间。记录刺激迷走神经诱发的静息PI和ΔPI，以区分对HR的直接影响和对迷走神经通路的直接影响。

我们将给药后收缩压（ΔBP）的增加解释为连接后NPY活性的测量(波特等., 1989)，并使用以下等式计算得出：ΔBP mmHg=BP_c（c）−英国石油公司_t吨，其中BP_c（c）是控制收缩压和血压_t吨是指治疗期间的收缩压。

增加NPY或Gal的静脉注射剂量后，生成每个测量参数的剂量-反应曲线。测量的参数为：刺激迷走神经诱发PI增加的最大抑制率（ΔPI%）；抑制反应的半恢复时间(T型₅₀，最小值）；血压最大增加（ΔBP，mmHg）；BP变化的持续时间（BP持续时间，min）。

数据分析

在最初的研究中，男性和女性的数据被汇总在一起，而这些研究的结果没有差异。数据表示为平均值±标准误差（s.e.m.）。所有数据均呈正态分布。组间比较以单向方式进行方差分析。如果显示出显著差异，学生的t吨-试验用于确定哪种剂量与对照反应有显著差异。在适当的情况下P（P）-使用Dunn–Sidak方法校正值。P（P）-<0.05的值被认为是显著的。

实验方案

药物按50份等分给药μ静脉滴注。用药后，静脉插管用50μ1升加热的肝素盐水。GAL和NPY的剂量范围为2.5至40μ克千克⁻¹（GAL:0.8至13毫摩尔千克⁻¹和NPY:0.5至10 nmol kg⁻¹). NPY剂量高于10 nmol kg⁻¹被认为不在生理范围内。允许延长GAL注射之间的时间间隔，以防止对GAL的快速反应(乌尔曼等., 1992).

以前，我们报道过NPY通过激活Y抑制大鼠的心脏迷走神经活动₂受体(史密斯-怀特等., 2001)；因此，Y的选择性拮抗剂₂受体(S公司)-N个²-[[1-[2-[4-[(R（右）,S公司)-5,11-二氢-6（6小时)-氧二苯并[b，e]氮杂吡啶-11-基]-1-哌嗪基]-2-氧代乙基]环戊基]乙酰基]-N个-[2-[1,2-二氢-3,5（4H（H）)-二氧-1,2-二苯基-3-H（H）-1，2,4-三唑-4-y]乙基]-精氨酸酰胺（BIIE0246；杜德等., 1999)给对照组和GAL-1R-KO小鼠服用，以阻断NPY在刺激交感神经后对ΔPI的抑制作用，因此仅显示内源性释放的GAL对ΔP1的影响。此处使用的BIIE0246剂量高于之前在大鼠体内使用的剂量(史密斯-怀特等., 2001)，以完全阻断而不仅仅是减少NPY对ΔPI的诱发抑制作用。BIIE0246的效果通过缺少Y进行测试₂-选择性给予NPY Y后介导的心脏迷走神经抑制活性₂激动剂，N-乙酰基[亮氨酸^28,31]NPY 24-36岁。由于BIIE0246的剂量很高，抑制活性的恢复不在实验的时间范围内。

药物

BIIE0246是Henri Doods博士（德国Biberach Boehringer Ingelheim Pharma）赠送的礼物。市售药物有：NPY、鼠/人（Calbiochem-Novabiochem AG Läufelfingen，瑞士）；GAL，大鼠（Peninsula Laboratories，Inc.，Belmont，CA，U.S.A.）；普萘洛尔（澳大利亚新南威尔士州Castle Hill Sigma-Aldrich私人有限公司）。所有药物均溶于0.09%盐水中。药丸剂量以摩尔千克计⁻¹基础。普萘洛尔（1 mg/kg⁻¹)在初步鉴定交感神经后给小鼠注射，以消除NAd引起的抑制活动，并防止由于心率增加对已经快速跳动的心脏产生不必要的反射效应。服用普萘洛尔并没有显著降低小鼠的静息心率。

除Y外，所有药物都很容易溶解在盐水中₂拮抗剂BIIE0246。这种合成拮抗剂首先用甲醇处理，然后用生理盐水处理。车辆对小鼠的测量参数没有影响。

对照组、GAL-KO和GAL-R-KO小鼠的静息PI和MAP

迷走神经完整的GAL-KO小鼠的静息PI与对照组小鼠相比无显著差异：（对照组：176±5 ms，341次/min⁻¹,n个=10; GAL-KO:171±10 ms，351次/分⁻¹,n个=16）。对照小鼠的MAP与GAL-KO小鼠的MAP没有差异（对照：72±6mmHg；GAL-KO:67±6mmHg）。这显示在的上面板中图1（b）.

切断迷走神经后，对照组PI降至151±8ms（397次/min）⁻¹)至141±11 ms（425次最小跳动⁻¹)GAL-KO小鼠。两组小鼠神经切断前后PI值均有显著性差异(P（P）<0.05），组间无显著差异。这可以在的上面板中看到图1（a）.

迷走神经完整的GAL-1R-KO小鼠的静息PI与对照小鼠相比没有显著差异；控制：155±5 ms（最小387次⁻¹),n个=10; GAL-1R-KO:158±5 ms（最小380次⁻¹),n个=10.对照组小鼠72±4 mmHg的MAP与GAL-1R-KO组小鼠70±3 mmHg无差异。这显示在的底部面板中图1（b）.

切断迷走神经后，对照组PI降至121±5ms（496次/min）⁻¹)至130±6 ms（462次最小跳动⁻¹)GAL-1R-KO小鼠。而两组小鼠神经切断前后的PI有显著差异(P（P）<0.01），切断迷走神经前后各组间无显著性差异。这显示在的底部面板中图1（a）.

GAL对对照、GAL-KO和GAL-1R-KO小鼠心脏迷走神经活动的影响

在对照小鼠中，静脉注射GAL（0.8–13 nmol kg⁻¹;n个=4-6）以剂量依赖的方式减弱了迷走神经刺激引起的PI增加。对照组小鼠的ΔPI范围为33±7至78±9.5%。这个T型₅₀范围为2±0.5至7±1min。GAL可增加血压，但这种作用不具有剂量依赖性。ΔBP范围为11±2至15±3 mmHg，持续时间为3±1–4.5±1 min。图2显示了一只老鼠5 nmol kg的测谎曲线⁻¹GAL剂量。图3显示了该组的剂量-反应数据。

在GAL-KO小鼠中，静脉注射GAL（0.8–13 nmol kg⁻¹;n个=5–7）剂量依赖性地减弱迷走神经刺激诱发的PI增加。对照组小鼠的ΔPI抑制率为37±7至72±6%。这个T型₅₀范围为2.5±1至4±1 min。GAL与对照组一样，增加了血压，且该效应不具有剂量依赖性。ΔBP范围为8±2～9±1.5 mmHg，持续时间为4±1.5～5±2 min。对照组小鼠静脉注射GAL引起的升压反应和对心脏迷走神经活动的抑制作用与GAL-KO组小鼠的反应无显著差异，如图3.

在GAL-1R-KO小鼠中，静脉注射一剂GAL（0.8–13 nmol kg⁻¹;n个=3-4）在该范围内的任何剂量下，迷走神经刺激诱发的PI增加均未减弱。与对照组一样，GAL增加了血压，并且这种作用不依赖于剂量。ΔBP的范围为8±2至9.5±1 mmHg，持续时间为4.5±1.5–5±1.5 min。对照小鼠注射GAL后的ΔBP与GAL-1R-KO小鼠（未显示）的ΔBP无显著差异。

NPY对对照组和GAL-KO小鼠血压和心脏迷走神经活动的影响

在对照小鼠中，静脉注射NPY（0.5–10 nmol kg⁻¹;n个=5–7）以剂量依赖性方式减弱迷走神经刺激诱发的ΔPI。对照组小鼠的ΔPI范围为13±10%至67±7%。这个T型₅₀范围为0.5至5±1分钟。静脉注射NPY后的ΔBP呈剂量依赖性。ΔBP范围为25±6至60±3 mmHg，持续时间为7±1–12±1 min。

在GAL-KO小鼠中，静脉注射NPY后迷走神经刺激引起的ΔPI衰减具有剂量依赖性。GAL-KO小鼠的ΔPI范围为11±4%至72±2%。这个T型₅₀范围为1±0.5至6±0.5 min。静脉注射NPY后的ΔBP呈剂量依赖性。ΔBP范围为22±3～60±10 mmHg，持续时间为6±0.5～10±2 min。对照组小鼠静脉注射NPY引起的升压反应和对心脏迷走神经活动的抑制作用与GAL-KO组小鼠无显著差异，如图4.

小鼠心脏交感神经刺激

刺激三只小鼠的交感神经可使PI降低约75 ms（即HR增加约260次/min⁻¹; 从～340至600）。刺激神经时血压也升高。以6 Hz、1 ms、10 V（S6）的频率刺激神经2 min，可减弱刺激迷走神经引起的ΔPI。一只老鼠的测谎仪轨迹如所示图5，面板（a）。对迷走神经活动的抑制作用持续时间很短，在普萘洛尔（1 mg kg）存在时消除⁻¹（未显示）。在较高的刺激频率10 Hz、1 ms、25 V（S10）持续2 min后，迷走神经刺激诱发的ΔPI被长时间抑制，ΔPI=92±2%，T型₅₀=7±1分钟，n个=3，如所示图5，面板（b）。在普萘洛尔（1 mg kg⁻¹)，ΔPI被抑制80±3%T型₅₀6±1分钟，n个=4，与ΔPI的控制响应显著不同，但没有T型₅₀，如所示图6，面板（a）。

剂量为Y后30分钟₂拮抗剂BIIE0246（1μ摩尔千克⁻¹)，交感神经刺激对迷走神经活动的抑制作用减弱，ΔPI，57±3%T型₅₀2.5±0.5分钟，n个=3.诱发抑制与对照反应和普萘洛尔作用下的反应均存在显著差异，尽管只有T型₅₀对于对照组显示出显著差异。一只老鼠的测谎仪轨迹如所示图6，面板（b）。组数据如所示图8.

刺激交感神经对GAL-1R-KO小鼠心脏迷走神经活动的影响₂拮抗剂BIIE0246

在刺激GAL-1R-KO小鼠的交感神经（S10）一段时间后，心脏迷走神经活动被抑制93±7%T型₅₀2.5±0.25分钟，n个=3.在普萘洛尔（1 mg kg）存在的情况下⁻¹)，心脏迷走神经活动被抑制了56±2%T型₅₀1.5±0.5分钟，n个=5.如所示图7，顶部面板。

一次剂量的Y后30分钟₂拮抗剂BIIE0246（1μ摩尔千克⁻¹)，交感神经刺激对迷走神经活动的抑制作用被消除，P（P）<0.001,n个=3.一只老鼠的测谎曲线如所示图7，底部面板。小鼠交感神经刺激效应的分组数据和总结如所示图8.