MPTP（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶）诱导的多巴胺神经变性是目前最好的帕金森病灵长类动物模型。 1 和 2 用于当前审查）。 在成年猴中，MPTP给药会导致黑质多巴胺神经元的深度丢失，并导致与特发性PD相似的运动损伤。然而，MPTP模型有两个明显的局限性。 首先，MPTP诱导的毒性是一种快速、单一的事件，导致急性神经退化和神经症状。 其次，受MPTP影响的多巴胺神经元不会发展为进行性α-突触核蛋白病（尤其是路易体和路易神经炎），这是特发性PD的特征。因此，显然需要一种新的PD灵长类模型，其中与α-突触素（α-syn）相关的发病机制 毒性和黑纹状体变性可以在接近人类的物种中进行研究。
以前的研究表明，α-syn蛋白是神经细胞内蛋白聚集体（路易体和路易神经炎）的主要成分，是该病的病理特征( 三 , 4 )。 此外，α-syn基因的点突变已被证明会导致常见的PD( 5 , 6 )提示α-syn的异常加工和/或功能可能触发神经变性过程。 虽然α-syn在整个神经系统的神经元中表达，但PD的神经退行性变具有显著的选择性，在SN的多巴胺能神经元中最为突出。最近的研究表明，这种选择性脆弱性可能是由于α-syn-与胞内多巴胺相互作用、氧化应激、， 和多巴胺依赖性自由基损伤( 7 – 10 )。 这种相互作用可能解释了为什么多巴胺能神经元在对其他类型的细胞无毒的表达水平上受到α-syn的影响( 10 – 13 ).
这些 在体外 数据增加了通过在黑质纹状体多巴胺神经元中过度表达α-syn蛋白来产生PD转基因模型的可能性。 这种方法在以下方面取得了可喜的结果 果蝇属 ( 14 )。 然而，迄今为止，通过使用标准转基因技术在小鼠身上进行的尝试令人失望。 在迄今为止产生的转基因小鼠株中，WT或突变的人类α-syn已在神经元特异性启动子下表达； 尽管α-syn积聚、α-syn-阳性包涵体和神经元损伤的迹象已经广泛存在，但在这些小鼠中没有发现明显的黑质病理或细胞丢失( 15 – 21 )。 然而，最近，通过病毒载体进行的直接基因转移已经成为标准转基因方法的一种有趣的替代方法。 重组腺相关病毒（rAAV）和慢病毒载体尤其适用于此目的，因为它们在中枢神经系统中高效地转导非分裂神经元，并且整合和稳定表达，无任何炎症或免疫反应迹象( 22 , 23 )。 这些载体系统可以针对中枢神经系统的特定亚区，与标准转基因技术相比，它们提供了一种转基因方法，可以应用于成年动物和小鼠以外的其他物种，例如大鼠和灵长类。
rAAV载体因其对黑质多巴胺神经元异常高的亲和力而在PD的背景下引起特别关注。 在之前的研究中( 24 )，我们已经证明，rAAV载体系统可以用于成年大鼠黑质纹状体神经元中WT或突变的α-syn的过度表达，并且这种过度表达伴随着显著的α-sonnucleinopathy的发展，包括α-syn-阳性细胞质内含物和营养不良神经突的出现， 30%-80%的黑质多巴胺神经元逐渐丧失，PD-like行为改善。
在本研究中，我们应用该rAAV-α-syn载体构建物在一种小型非人类灵长类动物（普通绒猴）的黑质纹状体多巴胺神经元中表达人类α-syn。 我们报告称，rAAV载体在转导灵长类SN致密部神经元方面同样有效，并表明WT或突变人类α-syn的过度表达足以在灵长类黑质纹状体系统中诱导PD样神经病理学，伴随多巴胺神经元细胞丢失和运动损伤迹象。
实验协议 rAAV载体。 rAAV CBA-α-syn、rAAV-CBA-mu-α-syns和rAAV-CBA-GFP载体是通过使用rAAV质粒和包含腺病毒通常提供的必要基因产物的辅助质粒的双重转染方法生成的( 25 )，并按所述进行纯化( 26 )。 最终滴度为8.2×10 11 , 1.4 × 10 12 和1.5×10 11 感染中心分析确定的三种媒介的感染单位/ml( 27 )。 载体表达来自混合启动子的转基因，该混合启动子包括来自巨细胞病毒启动子的增强子元件，然后是鸡β-肌动蛋白启动子，该启动子包含兔β-珠蛋白内含子，称为CBA( 28 ).
动物与外科。 所有程序均根据1986年《英国动物（科学程序）法案》在项目许可证下进行。 八只成年普通狨猴( 贾克斯（Callithrix jacchus）， 使用了四只雄性和四只雌性。 所有婴儿均为实验室饲养，年龄在65-72个月，实验开始时体重为340-380克。 这些猴子被成对饲养，两只猴子都接受了相同类型的rAAV载体注射。 两只猴子注射了编码WT人类α-syn的rAAV载体，两只猴子注射A53T突变的人类α-sny，四只猴子注射了一个编码GFP的控制载体。 在一只注射rAAV-wt-α-syn的动物中，注射失败； 这只动物没有被纳入进一步的分析。
手术时，用阿法沙龙-阿尔巴酮（Saffan；Schering–Plough；0.5 ml，12 mg/ml，i.m.）麻醉绒猴。 如有必要，在手术期间补充服用0.3毫升Saffan。 在右侧SN的两个部位（前（A）5.5、侧（l）−2.5和腹（V）6.6）分别进行3μl rAAV的单侧注射； 和A 4.0、L−2.5和V 6.6[坐标来自Stephan的立体定向图谱 等。 ( 29 )]. 通过使用每次注射后在原位再放置4分钟的29 gaug注射针，以0.25μl/min的速率进行注射。 手术后，给猴子服用止痛药（Finadyne，Schering–Plough；0.1 mg/kg，皮下注射），并在保温箱中保温，直到足够好，通常在当天晚些时候回到家中的笼子。
行为。 通过苯丙胺诱导的旋转和头部位置偏差测试监测运动行为随时间的变化( 30 , 31 )。 在后一项测试中，在三个1分钟的时间内，每秒对头部相对于体轴的方向（注射侧同侧或对侧或正前方）进行评分。 时间差（ipsi–contra）用于测量头部位置偏差。 在术前、每三周和注射AAV后16周进行测试。
组织学。 在载体注射后3-16周，对猴子进行灌注以进行组织学分析。 在预先服用0.05 ml氯胺酮（维塔拉；Shering–Plough；100 mg/ml，i.m.）并在0.8 ml戊巴比妥钠（200 mg/ml，i.p.）的深度麻醉下，用300 ml PBS经心灌注猴子，然后用1000 ml 4%多聚甲醛在PBS中灌注。将大脑置于4%多聚醛溶液中24小时， 然后将其转移到PBS中的30%蔗糖溶液中。使用酪氨酸羟化酶（TH；rabbit IgG，1:250，Pel-Freez Biologicals）、GFP（rabbit IgG，1:20000，Abcam，Cambridge，U.K.）、囊泡单胺转运体-2（VMAT-2； 兔IgG，1:2000，Chemicon），Hu（小鼠IgG（1:1000，由纽约州伊萨卡市康奈尔大学S.A.Goldman提供），以及人类α-syn（小鼠-IgG，1:16000，由费城宾夕法尼亚大学V.M.Lee提供）。 用一级抗体孵育后，用适当的与生物素结合的二级抗体和亲和素-生物素过氧化物酶复合物（ABC Elite，Vector Laboratories）进行孵育，用3,3′-二氨基联苯胺进行可视化，安装在镀铬-铝玻璃载玻片和盖玻片上。 对于GFP和TH的共定位，先用抗TH一级抗体孵育，然后用与Cy3（红色）偶联的驴抗兔抗体孵养，然后用共焦显微镜通过绿色通道中的天然荧光观察GFP。 另外一系列切片进行甲酚紫染色。
根据光学分馏器原理，在单独的一系列切片中估计SN中TH阳性和VMAT-2阳性神经元的总数( 32 )，使用奥林巴斯CAST系统（丹麦奥林巴斯A/S，Albertslund，Denmark）。 计数程序中包括涵盖序列号整个范围的每八个部分。 SN的边界定义如下：腹侧被盖细胞群和致密部区域之间的内侧边界正好位于第三神经根的外侧。 在最尾侧水平，致密部被定义为内侧丘系腹侧和红后区的致密TH细胞群。 细胞计数中包括重瓣部（因此也包括大脑脚背侧）的TH阳性细胞。 这一定义通常导致对每只猴子进行七到八个截面的测量。 由于估算，误差系数<0.10被接受。
结果 动物在SN的两个位置（2×3μl）单侧注射高滴度rAAV-α-syn和rAAV-GFP载体，并在3周时灌注( n个 =2（GFP组），16周( n个 =3来自α-syn基团和 n个 GFP组=2）。 在注射rAAV-GFP的动物中，发现90-95%的TH阳性细胞在整个SN的所有吻吻端水平表达GFP，这表明黑质多巴胺神经元在绒猴大脑中非常有效地转导（图。 1 A类 和 B类 )。 SN中的大多数转导细胞局限于致密部，但在腹侧被盖区（VTA）也发现了一些表达GFP的细胞。 此外，GFP表达细胞出现在SN网状部、TH阳性细胞腹侧和中脑被盖背侧（图。 1 A类 )。 在注射rAAV-GFP后3周处死的两只动物中，转基因表达仅限于SN致密部内的细胞体和近端轴突，以及延伸至网状部的树突。 16周时，转基因在SN中保持高水平表达。此外，沿整个黑质纹状体通路和整个纹状体的轴突终末（包括伏隔核和嗅结节）也可以看到顺行运输的GFP蛋白（图。 1 C类 和 D类 )。 使用任何标记物（TH、VMAT-2、Hu和甲酚紫；数据未显示），在GFP转导的细胞或其过程中均未检测到损伤或变性迹象。
图1。
显微照片显示注射了控制载体的猴子中GFP转基因的表达。 ( A类 和 B类 )GFP在致密SN部的绝大多数神经元中表达，一些细胞在中脑被盖背侧和网状SN部腹侧表达( A类 )。 转基因GFP蛋白沿着黑质纹状体投射系统的轴突运输到尾状核、壳核和外侧嗅结节，而内侧嗅结节和伏隔核的投射没有相同程度的标记( C类 ; 非插入控制侧位于左侧）。 纹状体中GFP表达纤维的密度如图所示 D类 .比例尺 A类 =0.5毫米； B类 和 D类 =50； C类 =1毫米。
相比之下，在注射了两种α-syn载体中任一种的动物中，黑质纹状体多巴胺神经元有明显的变性迹象。 根据体视学测定，注射SN中TH阳性细胞的总数在三只注射动物中减少了32–61%（从对侧未治疗侧的平均47106个细胞减少到注射侧的平均26797个；参见图。 2 A类 和 B类 )。 在囊泡单胺转运体VMAT-2染色的切片中也观察到同样大小的细胞丢失（41–62%；从对照侧的43034个细胞到注射侧的23214个细胞），这与α-合成酶表达细胞中TH蛋白选择性下调的可能性相矛盾（图。 2 C类 – E类 )。 在泛神经标记物Hu或甲酚紫染色的切片中，致密部SN内神经元数量的减少进一步支持了多巴胺能细胞的丢失（图。 2 F类 – 我 )。 细胞死亡在SN的中央部分最为显著，但在所有口腔粘膜层面都可见。 在VTA中也观察到TH-和VMAT-2阳性细胞的丢失，尽管其数量低于SN。在任何经rAAV-GFP治疗的对照猴中均未观察到此类细胞丢失（图。 2 A类 ).
图2。
显示TH染色的显微照片( A类 和 B类 )，VMAT-2染色( C类 – E类 )，甲酚紫-染色( F类 和 G公司 )和Hu-stated( H（H） 和 我 )SN水平的切片。在rAAV-GFP治疗的动物中，TH( A类 )和VMAT（比较 C类 和 D类 )染色显示黑质多巴胺能细胞数量和分布正常。 相比之下，在rAAV-α-综合注射的动物中，TH均出现明显的细胞丢失( B类 )和VMAT-2染色（比较 C类 和 E类 )。 比例尺英寸 A类 和 B类 =0.5毫米； C类 =300μm（适用于 C类 – E类 ); F类 =300μm（适用于 F类 – 我 )。 脑梗； SNc，黑质致密部； SNr，黑质网状部； VTA，腹侧被盖区。
对用WT或突变的α-syn转导的SN进行仔细检查，发现致密部神经元有变性和持续病理的迹象，包括α-syn-阳性细胞质内含物和颗粒沉积物（图。 三 F类 )、α-syn-和TH-阳性肿胀、营养不良和支离性神经突（图。 三 C类 , G公司 、和 H（H） )和萎缩、固缩的胞周，具有致密的α-syn免疫反应性（图。 三 B类 和 C类 )。 此外，伸入网状部的树突严重受损（参见图。 三 A类 , B类 、和 J型 )α-syn-和TH-阳性包涵体以及肿胀的轴突可以沿着黑质纹状体通路大量追踪（图。 三 D类 和 E类 )。 然而，许多存活的黑色素细胞仍表达α-syn，外观正常完整（图。 三 B类 )。 在这些细胞中，α-syn免疫反应具有均匀、弥散的细胞质分布，表明它们已逃脱了α-syn-诱导的毒性影响。
图3。
rAAV-α-综合注射动物的黑色素变性。 TH均可见SN的病理特征( A类 , B类 、和 J型 )和α-syn免疫反应( C类 – 我 )。 TH免疫反应显示，致密部SN广泛的细胞变性也导致显著的树突异常和网状部SN树突的丢失( B类 和 J型 )。 致密部SN中受影响但存活的细胞缩小( C类 )细胞质和近端神经突内含有大量内含物( F类 )以及致密部内的轴突( G公司 和 H（H） )沿着黑质纹状体束( 我 )。 在大脑脓疱中观察到许多病理性纤维，其中含有突出的包涵体（参见。 D类 和 E类 )。 比例尺英寸 A类 和 B类 =0.1毫米； C类 , 我 、和 J型 =50微米； D类 和 E类 =0.2毫米； F类 , G公司 、和 H（H） =25微米。
在同时注射rAAV-α-的猴子中，纹状体轴突终末的退行性变化可以用TH观察到（图。 4 C类 )和VMAT-2抗体（图。 4 D类 )。 在注射rAAV-GFP控制载体的动物中未发现任何这些变化（图。 4 A类 和 B类 )。 TH-和VMAT-2阳性纤维的大量丢失（约40-50%）发生在尾状核和壳核，而腹侧纹状体和边缘区的神经支配相对较少，包括伏隔核和嗅结节（图。 4 C类 ; 参见图。 4 E类 和 F类 )。 纹状体中剩余的稀疏TH阳性神经支配中观察到肿胀的轴突和病理性包涵体（图。 4 F类 和 G公司 )，也在内囊内（未显示）。
图4。
TH显示纹状体轴突纤维神经支配的显微照片( A类 , B类 、和 E类 – G公司 )和VMAT-2( B类 和 D类 )免疫组织化学。 然而，GFP蛋白的表达并没有改变纹状体TH-和VMAT-2阳性纤维神经支配的密度( A类 和 B类 )与对侧完整侧相比，α-syn的表达导致转导半球尾状核和壳核内的纤维明显丢失( C类 和 D类 )。 α-同步处理的动物中剩余的TH-阳性纤维稀少（比较 E类 和 F类 )并含有夹杂物( G公司 )。 比例尺英寸 A类 – D类 =1毫米； E类 和 F类 =0.1毫米； G公司 =25微米。
在行为测试中，苯丙胺诱导的旋转在任何时间点都没有显示出任何一致的变化（数据未显示）。 在头部位置测试中，rAAV-α-syn组和rAAV-GFP组注射前平均得分（±SEM）分别为+0.5±5.4和+9.4±2.1秒。 注射后3周，即AAV感染细胞中转基因表达完全发育时( 33 – 36 )rAAV-α-syn组的动物在远离注射半球的方向上表现出明显的偏差（−33.0±5.7 s，而rAAV-GFP组为+7.5±2.1 s）。 注射后6周时，这种对侧偏倚被逆转为同侧偏斜（+17.7±1.7 s），正如纹状体多巴胺神经缺失的动物所预期的那样。 这种偏倚一直持续到转导后16周实验结束，在三只rAAV-α-syn动物中的两只中尤为明显（分别为+40.5、+22.3、-14秒），而注射rAAV-GFP的动物则没有表现出这样的偏倚（分别为+5.5和-7.3秒）。
讨论 黑质多巴胺神经元中α-syn过度表达引起的细胞变化再现了人类PD的一些主要神经病理学特征，包括α-syn-阳性细胞质内含物和α-syn-阳性肿胀和营养不良的神经突，与TH阳性轴突和树突的退行性变化有关。 在大鼠中，这种α-同核蛋白病是一个缓慢发展的过程，在转导后约3周开始，2个月完全发育。此时，30–80%的黑质多巴胺神经元和25–90%的纹状体多巴胺神经支配消失。 在rAAV-α-共治疗的猴子中，观察到SN中TH-和VMAT-2阳性神经元的类似丢失（30-60%），以及贯穿尾状核和壳核的TH-和VM AT-2阳性神经支配减少40-50%。 与特发性PD相似，VTA中的TH阳性神经元和边缘前脑区域的相关神经支配相对较少。 这些猴子表现出一种运动障碍，即头部位置偏差，这与观察到的黑质多巴胺神经元细胞丢失的程度相一致。 这种偏倚在转导后的3到6周内发展缓慢，并且在三只动物中的两只一直持续到实验结束（16周时）。
黑质多巴胺神经元似乎对α-syn过度表达特别敏感。 然而，有趣的是，在大鼠和猴子中，尽管转导的α-syn蛋白保持表达，但部分转导的多巴胺神经元长期存活，没有任何明显的损伤迹象，而其他表现出细胞和神经炎病理学的迹象，提示正在进行的神经退行性过程。 α-syn毒性与氧化应激水平密切相关，多巴胺神经元可能由于α-syn-与细胞内多巴胺和多巴胺依赖性氧化机制的相互作用而特别敏感，这一观察结果可以解释这种易损性的变化( 7 , 10 , 11 , 37 , 38 )。 值得注意的是，在目前的技术下，转基因表达水平将因感染细胞而异，因为靠近注射部位的神经元可能会收到更多的重组病毒副本。 然而，很可能不仅α-syn表达水平，而且氧化应激水平（可能因细胞而异）也将决定对转导细胞的影响。 上一个 在体外 研究（参见参考文献。 11 , 38 、和 39 )已经表明，人类α-syn的A53T和A30P突变体可能比WT型更具毒性，并使转导细胞更容易受到氧化应激 体内 实验( 14 , 17 , 19 , 20 , 24 , 40 )，WT和A53T突变体α-syn均具有高度毒性。 然而，在缺乏剂量反应数据的情况下，我们无法确定这两种形式的效力是否不同。
PD的神经变性可能取决于α-syn（和泛素蛋白酶体途径）、氧化应激和线粒体损伤之间的相互作用。 目前的PD动物模型成功复制了后两种机制：氧化损伤介导的6-羟基多巴胺诱导毒性，以及线粒体复合物I慢性抑制介导的MPTP和鱼藤酮诱导毒性( 1 , 41 )。 通过rAAV载体在黑质多巴胺神经元中定向过度表达α-syn，提供了一种新的黑质纹状体α-synucleinopathy和α-syn-induced nigrostrial neuropdegration模型，这将是对现有模型的有益补充。 这种α-同核蛋白病模型的优点是，它是慢性的和进行性的，就像人类帕金森病一样，并且它发展出神经病理学特征，特别是α-同阳性包涵体和营养不良性神经炎，这些特征与特发性帕金森病相似（尽管不完全相同）。此外， 大鼠的神经变性和行为损伤在转导后6-8周的相对较短时间内发生( 24 )，这对于实验研究是有利的。 与标准的转基因小鼠技术相比，载体介导的转基因具有特别的吸引力，因为转基因蛋白可以在生命周期的任何时候传递给成年动物； 它可以针对特定的神经元亚群； 它可以根据需要单次或双侧应用； 它也可以用于灵长类动物。 病毒载体，尤其是新一代高滴度rAAV载体，为脑内细胞特异性靶向转基因提供了新的有效工具。 如图所示，在灵长类动物中使用这种方法的可行性为产生神经退行性疾病的转基因灵长类模型以及 体内 致病机制的研究。 由于rAAV载体可以反复给药于同一细胞，因此它们也将成为表达基因和细胞内因子的工具，这些基因和细胞因子可能会阻止或干扰关键的致病过程（例如在rAAV-α-共治疗动物中形成有毒纤维或蛋白聚集体） 以及为治疗目的探索新的分子靶点。
鸣谢 我们感谢Ulla Jarl提供的专家技术援助，Lyn Cummings提供的行为观察，剑桥大学实验心理学系使用灵长类动物设施，鲍威尔基因治疗中心载体核心实验室生产载体，以及Virginia M.Lee博士和Steven A。 高盛分别慷慨提供α-synuclein和Hu抗体。 本研究得到了瑞典医学研究委员会（04X-3874和99-XG-13285）、Wellcome信托基金会（给L.E.A.）和国立卫生研究院（PO1 NS36302，给N.M.）的资助。
缩写
MPTP公司 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶
PD公司 帕金森氏病
序号 黑质
α-syn α-突触核蛋白
rAAV型 重组腺相关病毒
真实航向 酪氨酸羟化酶
VMAT-2型 囊泡单胺转运蛋白-2
VTA公司 腹侧被盖区
脚注 这篇论文是直接提交给PNAS办公室的（第二轨道）。
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