摘要
蛋白激酶Cα(PKCα)的C2结构域控制着该激酶在细胞质钙转运过程中从细胞质向质膜的转运 2+ 信号。 本研究使用荧光融合蛋白的细胞内共成像和体外FRET膜结合分析来进一步研究这种易位的性质。 我们发现Ca 2+ -激活的PKCα及其分离的C2结构域在体内仅定位于质膜,并且质膜脂质磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP 2 ),显著提高钙 2+ -在体外触发C2结构域与细胞膜的结合。 类似地,一种取代PKCαCa的杂交构建体 2+ -绑定循环(CBL)和PIP 2 结合位点(β-链3–4)到不同C2结构域显示天然钙 2+ -触发靶向质膜并识别PIP 2 相反,含有CBL但缺乏PIP的杂种 2 主要转移到 反式 -高尔基网络(TGN),无法识别PIP 2 类似地,在PIP中具有突变的PKCαC2结构域 2 站点目标主要是TGN,无法识别PIP 2 总的来说,这些发现表明CBL对钙至关重要 2+ -触发膜结合,但不足以实现特定的质膜靶向。 相反,靶向特异性是由β链3–4上的基本残基提供的,它与质膜PIP结合 2 .
材料和方法
材料
离子霉素来自Calbiochem(加州拉霍亚)。 DiD和FM4-64来自分子探针(尤金,俄勒冈州)。
融合蛋白结构
先前描述了编码人PKCα和PKCαC2结构域(韩国仁川英哈大学J.-W.Soh馈赠)的融合到氰荧光蛋白(CFP)(pCFP-PKCα与pCFP-PKCα_2)的质粒的构建( 埃文斯 等。, 2004 ). 通过定点突变(Stratagene,La Jolla,CA)产生突变质粒(pCFP-PKCαC2/K209A/K211A和pCFP-PKCα/K209/K211A)。 编码人细胞溶质磷脂酶A的质粒 2 (cPLA 2 )C2域(加入 M72393型 )含有来自PKCαC2(pCFP-cPLA)的CBL 1、2和3 2 /PKC_CBLs)或PKCαC2 CBL和β3-4链(pCFP-cPLA 2 /PKC_CBLs+β3–4)由pCFP cPLA扩增获得的重叠PCR片段组装而成 2 C2与cPLA 2 C2fwd和cPLA 2 C2rev引物和包含PKCαC2 CBL序列和β3–4链序列的引物。 通过PCR组装片段并克隆到 欣 dIII型/ 萨尔 ECFP的I位点(C3)。 cPLA的氨基酸序列 2 /含cPLA的PKC_CBLs杂交 2 C2序列(S17-V30、D43-H62、P69-D93、T101-M148)因插入PKCαC2回路序列(I184-S192、I215-N220、W247-D254)而中断。 cPLA的氨基酸序列 2 /含PKC_CBLs+β3–4杂合物的cPLA 2 C2序列(S17-V30、P69-D93、T101-M148)因插入PKCαC2环和β3-4链序列(I184-N220、W247-D254)而中断。 由于不同的拓扑结构,PKCαC2β3–4链与cPLA同源 2 C2β2–3股。
含有与CFP或YFP(黄色荧光蛋白)融合的GAP43 N末端20残基的质粒(分别为mGAP43-CFP和-YFP)购自BD Biosciences Clontech(加利福尼亚州帕洛阿尔托)。 TGN38-CFP和TGN38-YFP质粒是K.Simons(德国德累斯顿马普研究所)赠送的礼物。 EGFP-PLCδ 1 PH域质粒是M.Katan(英国伦敦癌症研究中心细胞和分子生物学)赠送的礼物。
本研究中使用的pYFP质粒是从BD Biosciences Clontech购买的pEYFP中构建的,通过定点突变(Stratagene)引入Q70M突变以提高其质量( 格里斯贝克 等。, 2001 ). 交换 Nhe公司 我/ Bsr公司 编码荧光蛋白的GI片段产生不同颜色的荧光蛋白质粒。
对于体外脂质结合研究,PKCαC2,cPLA 2 /PKC_CBLs和cPLA 2 /使用PKCαC2-GSTfwd和PKCαC2-GSTrev引物扩增PKC_CBLs+β3–4序列,用于PKCαCO2和cPLA 2 C2-GSTfwd和cPLA 2 C2-GSTfwd,用于杂种,并克隆到 Eag公司 我/ 生态 谷胱甘肽的RI位点 S公司 -转移酶(GST)融合载体。 表达的蛋白质 大肠杆菌 菌株BL12D在谷胱甘肽亲和柱上分离,然后用凝血酶裂解和洗脱。 通过SDS-PAGE测定蛋白质纯度( 莱姆利,1970年 )用酪氨酸差异光谱法测定蛋白质浓度( 科普兰,1994年 ). 所有结构均经DNA测序证实。
细胞培养
将从美国型培养物收集中心(弗吉尼亚州马纳萨斯)获得的Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞以1×10的密度涂布在35-mm玻璃底培养皿(马萨诸塞州阿什兰MatTek)上 4 细胞/厘米 2 在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.292 mg/ml谷氨酰胺的DMEM中培养 2 37°C时。 第二天,使用FuGENE-6(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)或Lipofectamine 2000(Invitrogen)在含有0.2%BSA、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.292 mg/ml谷氨酰胺的DMEM中,按照制造商的方案,用1–2.5μg每种相关质粒转染细胞。
荧光蛋白显微镜
将共转染的MDCK细胞用另外用25mM HEPES缓冲的Hanks平衡盐溶液洗涤,pH 7.4(HH-BSS)孵育。 使用配备60×1.25 NA油浸物镜的奥林巴斯倒置显微镜(纽约梅尔维尔)、Sutter滤光片轮中的CFP和YFP发射滤光片(Chroma Technology,Brattleboro,VT)、CFP/YFP二色镜和TILL Imago CCD相机(德国格拉夫芬TILL Photonics公司)对细胞进行成像。 使用多色IV单色仪(TILL Photonics)分别为CFP和YFP提供430 nm和510 nm的激发光。 图中的图像 三 和 4 使用配备60×1.4 NA油浸物镜的尼康倒置显微镜(纽约州梅尔维尔)、CFP/YFP/RFP二向色镜和相应的单波段激发和发射滤波器(色度技术)以及CoolSNAP ES相机(光度学,亚利桑那州图森市)进行采集。 激发灯由水银灯提供。 在所有实验中,在采集第一组和第二组CFP/YFP图像集之间,用10μM离子霉素刺激细胞。 图像集之间的间隔为5-10秒。使用TILLvisION软件进行图像采集和分析。 最终图像是使用Adobe Photoshop(Adobe,San Jose,CA)和ImageJ(NIH, http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). 使用ImageJ制作了曲面图和视频。
图3。
PKCαC2域与PLCδ共定位 1 易位后不同焦平面的PH结构域和mGAP43。 共存(A)YFP-PKCαC2(左)和CFP-PLCδ的细胞图像 1 在每个细胞的顶端(顶部)、内侧(中部)和基底(底部)平面用离子霉素处理后PH(右)。 同一个细胞在给定的焦平面上成像。 插图,所示单元格区域的放大视图。 CFP-PLCδ的细胞内分布 1 离子霉素治疗前后PH值无明显变化。 (B) 用离子霉素处理后,在每个细胞的顶端(顶部)、内侧(中部)和基底(底部)平面共表达YFP-PKCαC2(左)和mGAP43-CFP(右)的三个细胞的图像。 插图,所示单元格区域的放大视图。 同一个细胞在给定的焦平面上成像。 mGAP43-CFP的核周靶向高尔基体由星号表示(右图)。 所有结果均代表至少五个实验。
图4。
mGAP43和PLCδ的彩色化 1 具有DiD的PH域。 (A) 表达mGAP43-YFP的细胞顶面(左)用亲脂膜染料DiD染色(右)。 细胞在37°C下与25μM DiD孵育5分钟,用冰镇HHBSS冲洗,并在冰上保存直至成像,以防止染料污染内膜。 焦点位于心尖表面。 插图,白框区域。 mGAP43(左)和DiD(右)插图中区域的曲面图(底部)。 比例尺反映了荧光强度随着周围暗淡膜的强度设置为1而增加的倍数。 (B) 表达mGAP-YFP的细胞基底表面(左),DiD染色(右)。 mGAP43(左)和DiD(右)插图中区域的曲面图(底部)。 比例尺反映荧光强度的增加。 (C) 表达CFP-PLCδ的细胞的顶(顶)面和底(底)面 1 PH(左)用亲脂膜染料FM4-64染色(右)。 将细胞与5μg/ml FM4-64在冰冷的HHBSS中孵育5分钟,冲洗,并保持在冰上直到成像,以防止染料染色内膜。
脂质结合研究
使用的脂质是1-棕榈酰-2-油酰基- 锡 -甘油-3-磷酸胆碱(磷脂酰胆碱,PC),1-棕榈酰-2-油酰基- 锡 -甘油-3-磷酸丝氨酸(磷脂酰丝氨酸,PS)和L-α-磷脂酰肌醇-4,5,-二磷酸(PIP 2 )来自Avanti Polar Lipids(阿拉巴马州雪花石膏公司)。 使用的氟是 N个 -[5-二甲氨基-萘-1-磺酰基]-1,2-二十六烷基- 锡 -分子探针中的甘油-3-磷酸乙醇胺(dansyl-PE,dPE)。 将脂质溶解在氯仿/甲醇/水(1/2/0.8)中,得到71.25:23.75:5PC:PS:dPE或66.75:22.25:6:5PC:PS:PIP的比率 2 :dPE,在45°C的真空下干燥,直到去除所有溶剂,然后用缓冲液A(25 mM)水合 N个 -(2-羟乙基)哌嗪- N个 pH 7.4的′-2-乙基磺酸(HEPES),含KOH、140 mM KCl和15 mM NaCl以及1 mM MgCl 2 )通过快速涡流。 通过使用Misonix XL2020探针声波仪(Misonix,Farmingdale,NY)对水合脂质进行超声波处理以澄清,制备了声波小单层囊泡(SUV)。 超声处理后,通过离心分离去除不溶性物质。
为了测量与脂质结合的蛋白质,在Photon Technology International QM-2000–6SE荧光光谱仪(新泽西州劳伦斯维尔)上进行了平衡荧光实验,实验温度为25°C,缓冲液a基本上如所述( 纳列夫斯基 等。, 1997 ). 对于所有的平衡荧光实验,激发狭缝宽度和发射狭缝宽度分别为2和8 nm。 在蛋白质中的供体固有色氨酸和由PC/PS/dPE或PC:PS:PIP组成的SUV之间测量FRET 2 :dPE,含有受体dansyl-PE.CaCl 2 在缓冲液A中的野生型或杂交C2结构域(1μM)和SUV(总脂质浓度100μM)的混合物中滴定,通过使用λ 前任 =284 nm和λ 相对长度单位 分别=520 nm。 从蛋白质数据中减去dPE直接激发产生的荧光。 图中给出了三个实验的平均值±SD。 曲线通过使用KaleidaGraph软件(Synergy software,Reading,PA)的Hill方程表示数据的最佳拟合。
结构模型
蛋白质数据库( 伯曼 等。, 2000 )中实验确定的C2域模型的标识符 图1 是1RLW(cPLA 2α 指挥与控制; 佩里西奇 等。, 1998 )和1DSY(PKCαC2; 维达格尔 等。, 1999 ). 混合C2域模型如所示 图1A 通过将PKCαC2的相应CBL和β3–4区域放置在cPLA的结构核心上而构建 2 C2.cPLA的结构 2 使用程序CE(组合扩展; 辛迪亚洛夫和伯恩,1998年 ). 一旦在结构上对齐,PKCαC2 PDB文件的适当部分就取代了cPLA的区域 2α C2 PDB文件,由 图1B 混合C2域模型在Modeller(Accelrys,San Diego,CA)项目中能量最小化( 萨利和布伦德尔,1993年 )修复各种结构段之间的任何不匹配。 由于通过各种构建体的多序列比对判断,杂交C2模型的钙配位方案与PKCαC2的钙配位方案最接近,因此假设杂交C2模型以与PKCαC2相同的方式结合两种钙离子。
结果
天然PKCα及其C2结构域的细胞内靶向性
监测PKCα对钙的细胞内靶向作用 2+ 动员后,我们将PKCα融合到CFP,在MDCK细胞中表达融合蛋白,并在胞浆Ca增加时成像其细胞定位 2 钙处理细胞产生的浓度 2+ 离子载体离子霉素。 在未经刺激的细胞中,CFP-PKCα和从PKCα中分离的C2结构域融合到黄色荧光蛋白(YFP-PKCαC2)在胞浆中广泛分布( 图2,A和B ). 由于其分子量较小,在细胞核中也观察到YFP-PKCαC2,还有许多与荧光蛋白融合的小结构域( 巴拉和瓦尔奈,2002年 ). 作为对细胞质钙增加的反应 2+ 浓度,CFP-PKCα从胞浆转位到细胞外周和质膜顶面上的小点,与YFP-PKCαC2共定位( 图2,A和B 和补充图2视频)。 因为CFP-PKCα和YFP-PKCαC2的荧光信号完全共定位( 图2C )因此,C2域不仅提供Ca 2+ 对PKCα的调节,但也需要所有必要的靶向信息。
图2。
PKCα和分离的PKCαC2结构域靶向MDCK细胞质膜上的相同点。 MDCK细胞共表达(A)CFP-PKCα和(B)YFP-PKCαC2的CFP和YFP图像对(左面板)和(右面板)胞浆Ca刺激后140 s 2+ 用10μM离子霉素处理细胞发出信号。 焦点位于细胞的顶端表面。 白色方框区域的插图、放大图和合并显示在C中。比例尺,10μm。 图像代表了在五个或更多独立实验中观察到的多个细胞。
为了研究斑点的性质,我们首先使用两种不同的质膜标记物磷脂酶Cδ来测试斑点位于质膜上的假设 1 PH域与YFP融合(YFP-PLCδ 1 PH),广泛用作PIP标记 2 在质膜中富集( 斯塔弗 等。, 1998 ; 瓦尔奈和巴拉,1998年 )以及生长相关蛋白43(GAP43)的20-残基双棕榈糖基靶向区域融合到YFP(mGAP43-YFP),已知其特异靶向血浆和高尔基体膜( 阿尼 等。, 1998 ). CFP-PKCαC2和YFP-PLCδ共存的细胞 1 用离子霉素处理PH以诱导钙 2+ 动员,并在细胞顶部表面成像每个结构的荧光。 为了完整性,还收集了细胞基底和内侧平面的图像。 CFP-PKCαC2和YFP-PLCδ的荧光信号 1 PH完全重叠( 图3A ). CFP-PKCαC2和YFP-PLCδ 1 PH荧光出现在细胞顶端表面的亮点状和基底表面的亮斑块中。 中间切片的图像显示细胞外围有荧光,与共焦显微镜报告的图像类似( 酒井 等。, 1997 ; Oancea和Meyer,1998年 ; 斯塔弗 等。, 1998 ). 在表达CFP-PKCαC2和mGAP43-YFP并用离子霉素处理的细胞中,荧光信号的重叠是相同的,除了mGAP43-YFP与高尔基体相关,并且再次观察到明亮的顶端点状物和基底斑( 图3B ). 如预期,YFP-PLCδ的质膜荧光 1 PH和mGAP43-YFP在未刺激的细胞中重叠(补充图S1)。
原则上,观察到的点状物和斑块可能代表含有高局部PIP密度的脂质和蛋白质的大簇 2 在质膜的细胞质表面,如脂筏簇( 劳克斯 等。, 2000 ; 劳赫尔 等。, 2000 ; 高大 等。, 2000 ; 棕色 等。, 2001 ; 杀虫喷雾剂 等。, 2003 ; 黄 等。, 2004 ; Golub和Caroni,2005年 ). 或者,点状物和斑块可以代表膜表面积局部密度高引起的几何特征( 2002年科拉鲁索和春天 ; van Rheenen和Jalink,2002年 ). 为了解决这些可能性,我们首先使用亲脂性膜染料DiD和FM4-64对表达mGAP43-YFP的细胞进行均匀的膜染色( 劳赫尔 等。, 2000 ; van Rheenen和Jalink,2002年 ; Golub和Caroni,2005年 ). 表达低水平mGAP43-YFP的细胞在37°C下用DiD处理5分钟,然后冷却到4°C,以减缓染料向细胞内膜的移动。 选择表达低水平mGAP43-YFP的细胞进行分析,因为表达高水平mGAP3-YFP细胞的胞浆中荧光比例相当大。 如中所示 图4A mGAP43-YFP在心尖表面的点状模式与DiD染色重叠(顶面板)。 插入区域的表面图是假彩色的,以显示背景膜上mGAP43-YFP和DiD强度的折叠变化( 图4A ,底部面板)。 mGAP43-YFP和DiD点均比周围的心尖膜亮约1.6倍,亮度区域完全重叠( 图4A ,底部面板)。 DiD染色的根尖点的亮度和分布与在MDCK细胞中的类似研究中所描述的相似( 2002年科拉鲁索和春天 ). 对表达mGAP43-YFP并用DiD染色的细胞基底表面的分析得出了类似的结果,只是基底mGAP43-YFP和DiD斑块都被发现比周围膜亮三到四倍( 图4B ). 在mGAP43-YFP表达细胞上使用FM4-64进行的类似实验产生了类似的结果(未公布的数据)。 这些结果表明,明亮的顶端点状物和基底斑块是由质膜的局部折叠而非脂质和蛋白质异质性区域(脂筏)引起的。
进一步研究明亮的点状物和斑块是否代表高局部密度的质膜或PIP 2 -含有脂筏,我们对PIP进行了成像 2 -特定CFP-PLCδ 1 PH结构域和质膜标记FM4-64。 CFP-PLCδ 1 在4°C下用FM4-64处理PH表达细胞5分钟。 由此产生的CFP-PLCδ亮尖点和基底斑 1 观察到PH与FM4-64共定位( 图4C ,顶部面板)。 由于CFP-PLCδ的比例较大 1 胞质溶胶中与膜无关的PH,FM4-64和CFP-PLC之间亮度差异的分析δ 1 PH斑点和斑块被排除; 然而,CFP-PLCδ的荧光增加了一倍 1 PH值始终低于FM4-64。 这些结果再次表明,观察到的mGAP43和PLCδ的局部累积 1 PH域是由膜密度的局部增加引起的。
总之,我们对亲脂探针和蛋白质结构域的细胞定位进行的比较表明,mGAP43、PLCδ 1 PH和PKCαC2在我们的光学分辨率极限(~250 nm)内均匀分布在整个质膜上。 在顶端和基底细胞表面观察到的明亮点状和斑块分别代表了由复杂几何特征而非膜平面内的异质性(如脂筏)引起的高质膜密度的局部区域。 这些发现并不排除存在异质性或小于我们分辨率极限的筏的可能性,并补充诸如GAP43、PLCδ等蛋白质 1 和PKCα。
总的来说,目前的细胞定位结果证实了Ca 2+ 如以前的研究所报道的那样,活化导致全长PKCα及其分离的C2结构域从细胞质转移到质膜的内叶,而不是其他细胞内膜( 酒井 等。, 1997 ; Oancea和Meyer,1998年 ; 斯塔弗 等。, 1998 ). 为了了解特异性质膜靶向是如何实现的,我们接下来在体外系统中研究了分离的PKCαC2蛋白的磷脂偏好性。
天然PKCαC2结构域与膜结合PIP的体外结合 2
以前的研究表明PS和PIP 2 作为PKCαC2结构域与人工膜对接的调节因子( 科尔巴兰·加西亚 等。, 2003 ; 斯塔赫林 等。, 2003 ; Marin-Vicente公司 等。, 2005 ). 如上所述,PLC的膜结合目标δ 1 PH域,PIP 2 在质膜的内叶中特别富集( 罗斯,2004 )而PS是所有细胞膜的组成部分( van Meer,1998年 ). 许多独立的荧光研究观察到PLCδ的专属靶向性 1 PH域到质膜,表明其他细胞膜不含可检测水平的PIP 2 ( 罗斯,2004 ). 因此,PKCαC2结构域和质膜PIP之间的特异性相互作用 2 可以解释所观察到的血浆膜靶向特异性。 为了验证这一假设,我们使用了一种已建立的蛋白-膜FRET分析来量化PIP的影响 2 关于Ca 2+ -磷脂囊泡的体外依赖性结合( 纳列夫斯基 等。, 1997 ). 具体而言,在PKCαC2域的四个固有色氨酸供体和含有3:1 PC:PS和5 mol%丹酰-PE的磷脂囊泡之间监测FRET,后者作为FRET受体。 囊泡也含有或缺乏6 mol%的PIP 2 PIP的存在 2 显著改变Ca 2+ -C2结构域对接囊泡的依赖性,使[Ca减少18倍 2+ ] 1/2 相对于缺乏PIP的囊泡,C2域对接(对应18倍亲和力增加) 2 ( 图5A ). 相比之下,PIP 2 对钙没有影响 2+ -胞浆磷脂酶A C2结构域的依赖性膜对接 2 α(cPLA 2 αC2; 图5B ). 这些发现共同表明PIP 2 显著提高钙 2+ -钙介导PKCαC2结构域向膜表面的募集 2+ 发出信号并建议PIP 2 结合驱动质膜靶向。
图5。
项目实施计划 2 增加PKCαC2结构域对磷脂囊泡的结合亲和力。 (A)PKCαC2结构域和(B)cPLA的蛋白膜FRET分析 2 αC2结构域与磷脂囊泡结合,磷脂囊泡含有3:1 PC:PS和5 mol%丹酰-PE,无论是否含有6 mol%PIP 2 样品含有1μM C2结构域、100μM总脂质、1 mM MgCl 2 ,140 mM KCl,15 mM NaCl,25 mM HEPES,pH 7.4,25°C。 数据点表示三个独立实验的平均±SD。 使用希尔方程(实线)进行的最佳拟合分析得出[Ca 2+ ] 1/2 值为2.9±0.05μM(+PIP 2 )和51±1.5μM(–PIP 2 )对于PKCαC2和15±0.28μM(+PIP 2 )和13±0.29μM(–PIP 2 )对于cPLA 2 αC2.希尔系数在1.5到1.9之间,因为每个C2结构域被多个Ca激活 2+ 离子( 科胡特 等。, 2002 ).
含PKCαC2-Ca的杂交C2结构域的细胞内靶向和脂质结合 2+ -绑定循环
我们的下一个目标是确定特定质膜靶向下C2结构域的结构元素。 一种可能性是CBL控制靶向特异性。 例如,我们早期的工作表明,来自cPLA的相关C2域的CBL 2 足以促进C2结构域的天然细胞内靶向性,该结构域在体内与高尔基体和内质网膜对接( 埃文斯 等。, 2004 ). 此外,其他研究表明,位于PKCαC2结构域CBL中的残基在将分离的C2结构域靶向质膜方面很重要( 科内萨·扎莫拉 等。, 2001 ; 斯塔赫林 等。, 2003 ; 马林·维森特 等。, 2005 )和PKCαC2对接的生物物理研究表明,CBL直接接触膜表面( 科胡特 等。, 2003 ; 图1A ).
评估PKCαC2 CBL在靶向和PIP中的作用 2 识别后,我们将PKCαC2 CBL融合到cPLA上 2 αC2结构域支架产生杂交结构域(cPLA 2 /PKC_CBLs; 图1,A和B ). 因为cPLA的晶体结构 2 已知αC2和PKCαC2( 佩里西奇 等。, 1998 ; 维达格尔 等。, 1999 ),可以对齐同源结构以产生杂种( 图1B ). 直接比较cPLA之间的目标 2 /PKC-_CBLs杂交融合到CFP(CFP-cPLA 2 /PKC_CBLs)和YFP-PKCαC2显示Ca 2+ -杂种从细胞质到近核位置的依赖性易位,其中一些与质膜结合仍可以检测到( 图6A 和补充图6视频)。 通过成像CFP-PKCαC2_CBLs和TGN38-YFP,TGN的标记物( 图姆 等。, 1999 ),我们建立TGN膜作为近核结合的靶点( 图4B ). 相比之下,含有PKCαC2 CBL 1或CBL 1和3的类似杂种融合到cPLA 2 αC2结构域支架对Ca的反应未能向任何膜移位 2+ 动员(未公布的数据)。 这些发现表明,分离的PKCαC2结构域CBL可以直接调控Ca 2+ -依赖性靶向一组有限的阴离子细胞膜,但不足以使PKCαC2样靶向质膜。 总的来说,这些发现表明,PKCαC2结构域的天然质膜靶向特异性所需的另一个结构元件必须位于CBL之外。
图6。
PKCαC2β链3和4是质膜靶向和Ca所必需的 2+ -依赖于PIP的绑定 2 -含有磷脂小泡。 CFP和YFP共存细胞图像对(A)CFP-cPLA 2 /PKC_CBLs和YFP-PKCαC2,(B)CFP-cPLA 2 /PKC_CBLs和TGN38-YFP,或(C)CFP-cPLA 2 /刺激细胞质钙后1–2.5分钟PKC_CBLs+β3–4和YFP-PKCαC2 2+ 用离子霉素处理信号。 白色方框区域的插图、放大图和合并显示在每个面板的右侧。 比例尺,10μm。 结果代表了至少五个实验。 (D)cPLA的蛋白质-膜FRET分析 2 /PKC_CBLs和(E)cPLA 2 /PKC_CBLs+β3–4蛋白与磷脂囊泡结合(m)或不与(l)6%PIP结合 2 (请参见 图5 图例了解详细信息)。 使用希尔方程(实线)进行的最佳拟合分析得出[Ca 2+ ] 1/2 647±11 mM(+PIP 2 )和620±5.5μM(–PIP 2 )用于中国人民解放军 2 /PKC_CBLs和值91.6±1.1 mM(+PIP 2 )和459±12 mM(–PIP 2 )对于PKCαC2_CBLs+β3–4。
还检测了具有三个PKCαC2 CBL的杂交C2结构域识别PIP的能力 2 体外蛋白膜FRET分析。 即使没有PIP 2 ,杂种需要较高的钙 2+ 比野生型PKCαC2结构域驱动膜对接的水平(比较图 5A级 和 第6天 ),很可能是因为钙的次优取向 2+ 与之前建议的其他C2域杂种的配位残基相同( 格伯 等。, 2001 ). 值得注意的是,PIP 2 对钙没有影响 2+ -这种混合C2结构域对膜对接的依赖性,表明单用CBL不足以进行PIP 2 识别并提示涉及PKCαC2结构域的另一个区域。
含PKCαC2-Ca的杂交C2结构域的细胞内靶向性和脂质结合 2+ -结合环和β3–4发夹
由β链3和4形成的β发夹中的赖氨酸残基形成的基本区域被假定为与PS或PIP协调 2 在膜中( 奥乔亚 等。, 2002 ; 科尔巴兰·加西亚 等。, 2003 ; 罗德里格斯-阿尔法罗 等。, 2004 ; Marin-Vicente公司 等。, 2005 )电子顺磁共振研究表明,β3–4发夹位于膜表面附近( 科胡特 等。, 2003 ). 为了研究β3-4发夹对特异性质膜靶向的作用,我们构建了另一个包含PKCαC2 CBL和β3-4发夹与cPLA融合的杂交C2结构域 2 C2脚手架并连接至CFP(CFP-cPLA 2 /PKC_CBLs+β3–4; 图1A ). 对钙的反应 2+ 增加CFP-cPLA 2 /PKC_CBLs+β3–4从细胞溶质中移动,并与YFP-PKCαC2在心尖点完全共定位( 图6C 和补充图6C视频)。 对CFP-cPLA的移位进行成像 2 /PKC-_CBLs+β3–4和YFP-cPLA 2 /同一细胞中的PKC_CBLs杂交结构域清楚地揭示了β3–4发夹对质膜特异性靶向的重要作用(补充图S2和补充图S2video)。 这些结果表明,PKCαC2结构域的β3–4发夹驱动了天然结构域的质膜靶向特异性。
直接测试β3–4发夹在PIP中的作用 2 识别,我们评估了cPLA的体外结合 2 /PKC_CBLs+β3–4杂交蛋白与带有或不带有PIP的囊泡 2 在蛋白质-膜FRET测定中。 与cPLA相比 2 /PKC_CBLs杂交蛋白,其中PIP 2 对Ca没有影响 2+ -依赖膜结合( 图6D )、PIP 2 显著改变Ca 2+ -cPLA的依赖性结合 2 /PKC_CBLs+β3–4蛋白转化为磷脂小泡,使[Ca减少五倍 2+ ] 1/2 与缺乏PIP的囊泡结合 2 ( 图6E ). 总之,这里提供的数据支持Ca的观点 2+ PKCα向PIP的依赖性易位 2 -富集的质膜由PKCαC2结构域的两个膜相互作用区域控制:CBL区域,该区域特异性结合Ca 2+ 并驱动仅具有有限特异性的膜结合,以及β3–4发夹,这是完全膜特异性和PIP所必需的 2 认可。
突变体PKCαC2结构域的细胞内靶向性和脂质结合
接下来,我们将注意力转向位于β3–4发夹中的四个赖氨酸残基( 图1B ). 早期的研究表明,PKCαC2的β3链中的赖氨酸197和199以及β4链中的赖氨酸209和211在Ca中很重要 2+ -独立,PIP 2 -与囊泡、PS和PIP的依赖性结合 2 -体外PKCα活性的依赖性调节和膜滞留( 奥乔亚 等。, 2002 ; 科尔巴兰·加西亚 等。, 2003 ; 罗德里格斯-阿尔法罗 等。, 2004 ; Marin-Vicente公司 等。, 2005 ). 假设这些赖氨酸残基在PIP中很重要 2 识别预测,这些位置的突变将削弱体内膜靶向特异性和体外脂质结合亲和力。 为了验证这一假设,创建了两个突变体,每个突变体在关键赖氨酸位置包含一对替换:K197A/K199A和K209A/K211A。
先前的研究表明,K209A/K211A双突变对PIP的影响显著大于K197A/K199A 2 -依赖性PKCα激酶体外活性和体内膜结合( 罗德里格斯-阿尔法罗 等。, 2004 ); 因此,选择K209A/K211A进行体内荧光成像研究。 首先,将含有K209A/K211A的突变体PKCαC2域融合到YFP(YFP-PKCαC2/K209A/K211A)。 由此产生的突变主要针对近膜,其中一些与质膜的结合仍然可以检测到,以响应钙 2+ 动员。 观察到的靶向模式与在同一细胞中表达的CFP-PKCαC2明显不同,后者只针对质膜斑点和斑块( 图7A 以及补充图7A视频)。 YFP-PKCαC2/K209A/K211A与TGN38-CFP的联合成像证实了易位的主要靶点是TGN(补充图S3A),正如之前在cPLA中观察到的那样 2 /缺乏PKCαβ3–4区域的PKC_CBLs杂交体( 图6B ). 这些结果表明,β3–4发夹中必需赖氨酸的丢失使PIP失活 2 结合位点。 在这种情况下,靶向仅由CBL控制,并且表现出降低的特异性。 YFP-PKCαC2/K209A/K211A与CFP-cPLA的直接共定位证实了这一点 2 /PKC_CBLs公司( 图7B 和补充图7B视频)。
图7。
PKCαC2结构域β链3和4中的赖氨酸残基是质膜靶向和Ca所必需的 2+ -依赖于PIP的绑定 2 -含有磷脂小泡。 共表达细胞的CFP和YFP图像对(A)YFP-PKCαC2/K209A/K211A和CFP-PKCαC2,(B)YFP-PKCαC2/K209/K211A与CFP-cPLA 2 /PKC_CBLs或(C)YFP-PKCα和CFP-PKCα/K209A/K211A刺激细胞质Ca后55秒 2+ 通过添加离子霉素发出信号。 白色方框区域的插图、放大图和合并显示在每个面板的右侧。 比例尺,10μm。 结果代表了至少五个实验。 (D)PKCαC2/K197A/K199A蛋白质和(E)PKCβC2/K209A/K211A蛋白质与磷脂囊泡结合的蛋白质-膜FRET分析,含(•)或不含(○)6%PIP 2 (请参见 图5 图例了解详细信息)。 使用希尔方程(实线)进行的最佳拟合分析得出[Ca 2+ ] 1/2 值为51±1.3 mM(+PIP 2 )和94±4.1 mM(–PIP 2 )对于PKCαC2/K197A/K199A和89±1.7 mM(+PIP 2 )和122±3.2 mM(–PIP 2 )用于PKCαC2/K209A/K211A。 用于比较的虚线是野生型PKCαC2结合的希尔曲线 图5A .
为了确保观察到的分离C2结构域的靶向结果表明全长PKCα,我们还评估了含有K209A/K211A双突变融合到CFP(CFP-PKCα/K209A/K211A)的全长PKCβ的靶向性。 全长突变体CFP-PKCα/K209A/K211A靶向近核区和质膜对钙的响应 2+ 对于野生型全长YFP-PKCα,这种增加与所观察到的唯一的质膜靶向性差异很大( 图7C 和补充图7C视频)。 正如预期的那样,全长突变体CFP-PKCα/K209A/K211A的靶向与相应的突变体C2结构域YFP-PKCαC2/K209/K211A一致(图S3B和补充图S3B视频)。 然而,与C2结构域突变体相比,全长突变体对质膜的靶向性更强,这表明当C2结构域缺陷时,全长蛋白的其他膜相互作用区域,最有可能是C1结构域和/或假底物区域,也在靶向性中发挥作用。 然而,我们的结果清楚地表明,对于分离的C2结构域,赖氨酸残基209和211的突变降低了全长酶的靶向特异性。
该假设还预测,β3–4发夹中必需赖氨酸的突变将降低PIP的作用 2 关于Ca 2+ -体外依赖性囊泡结合。 PIP的观察结果证实了这一预测 2 对Ca几乎没有影响 2+ -蛋白膜FRET分析中PKCαC2/K197A/K199A和PKCαC2/K209A/K211A双突变C2结构域的依赖性膜结合( 图7、D和E ). 正如先前激酶活性研究所建议的那样( 罗德里格斯-阿尔法罗 等。, 2004 )K209A/K211A双突变对PIP的影响大于K197A/K199A 2 -依赖性膜结合。 总之,这些数据强调了β3–4发夹中的基本残基对于体内观察到的特异性质膜靶向和PIP的重要性 2 体外观察到PKCαC2结构域的结合。
讨论
在本研究中,我们检测了PKCαC2结构域的两个膜相互作用区域对1)Ca的贡献 2+ -依赖性,体内质膜靶向和2)钙 2+ -依赖,PIP 2 体外结合。 通过将PKCαC2结构域的膜相互作用区域功能性移植到不同C2结构域体内,我们能够清楚地证明CBL对一般膜亲和力的重要性,以及β3–4发夹对质膜特异性和PIP的重要性 2 认可。
PKCα和分离的PKCαC2结构域对点滴和补丁的靶向性
我们最初的PKCα易位研究显示,明显的局部靶向是根尖点和基底斑块。 因为许多报告也观察到带有GFP标记的PLCδ的根尖点和基底斑 1 PH域并将其解释为PIP的局部聚集 2 (如上所述),我们进一步探讨了这些地区的起源。 使用两种化学性质不同的染料对质膜进行均匀染色,我们发现点状和斑块是膜表面积增加的区域(褶皱和微绒毛),这与其他两份报告一致( 2002年科拉鲁索和春天 ; van Rheenen和Jalink,2002年 )并且不是PIP的站点 2 和/或脂筏富集。 然而,我们的观察结果可能是特定于细胞类型的,因为其他使用类似膜染料的小组得出结论,PLCδ 1 质膜局部区域的PH域和mGAP43积聚不是由局部增加的膜面积引起的,而是由筏引起的( 黄 等。, 2004 ; Golub和Caroni,2005年 ). 最近,PKCα被证明与Ca中不溶于洗涤剂的组分有关 2+ -筏式约束的依赖方式( 鲁奇 等。, 2005 ). 然而,细胞中的脂筏与来源于细胞的洗涤剂不溶性组分之间的相关性仍然受到质疑( 范·莱恩 等。, 2005 ). 虽然使用传统筏标记观察到的质膜斑点和斑块明显不是筏,但我们不能排除存在膜不均匀性,如筏,其可能太小,无法通过光学显微镜进行分辨。
CBL在靶向细胞膜中的作用
钙 2+ 长期以来,由PKCαC2结构域的三个CBL定义的囊袋中的结合被认为是PKCα和分离的PKCαC22结构域向细胞质膜移位以及体外脂质双层结合的关键( 梅德科娃和乔,1998年 ; 科尔巴兰·加西亚 等。, 1999 ; 维达格尔 等。, 1999 ; 科内萨·扎莫拉 等。, 2001 ; Stahelin和Cho,2001年 ; 科胡特 等。, 2002 , 2003 ; Murray和Honig,2002年 ). 在体外,也可能在体内,这种易位涉及钙的结合 2+ -将蛋白质负载到膜表面的阴离子PS头基( 维达格尔 等。, 1999 ; ( 埃文斯 等。, 2004 ). 这里的结果进一步证明,融合到另一个C2结构域的PKCαC2 CBL对Ca足够 2+ -依赖性易位到阴离子细胞膜和磷脂小泡。 然而,尽管先前的研究已经得出结论,CBL负责唯一的质膜靶向( 斯塔赫林 等。, 2003 ; Marin-Vicente公司 等。, 2005 )本研究结果表明,PKCαC2 CBL单独介导的细胞内靶向性与天然C2结构域的质膜靶向性不同,且特异性较低。 因此,在没有β3–4发夹的情况下,CBL主要针对TGN,与质膜的轻微结合仍然可以检测到。 因此,单用CBL不足以实现特定的质膜靶向。 这与另一个C2域,即cPLA的靶向机制形成了巨大对比 2 α、 移植的CBL足以赋予cPLA的天然膜靶向特异性 2 混合结构域上的α(高尔基和内质网膜)( 埃文斯 等。, 2004 ).
虽然PKCαC2 CBL本身不足以赋予杂交C2结构域质膜特异性,但应该强调的是,该杂交结构域确实表现出Ca 2+ -依赖性膜结合,并在体内转移到有限的膜靶点。 因此,这种杂交结构域的CBL保留其功能性Ca 2+ -活性结构及其与阴离子膜的结合。 杂交结构域的TGN和质膜靶点都含有高水平的PS,因为TGN细胞质小叶是质膜细胞质小片的前体。 对于观察到的杂交结构域靶向这些膜的最简单解释是,移植的CBL保留其与膜结合的PS头组的天然相互作用,从而确保主要转移到具有高PS密度的细胞膜。 然而,很明显,这种减弱的特异性不足以确保向质膜的排他性移位。
β3–4发夹中碱性区在靶向细胞膜中的作用
生物物理研究表明,PKCαC2结构域的β链3和4形成的β发夹靠近质膜,因为该结构域相对于质膜的方向几乎平行( 科胡特 等。, 2003 )与早期预测类似( 维达格尔 等。, 1999 ). PKCαC2与Ca络合的进一步结构研究 2+ 可溶性PS在β3–4发夹中显示了一个由四个赖氨酸残基组成的基本区域,该区域具有强大的正电荷( 奥乔亚 等。, 2002 ). 在晶体结构中观察到K209和K211与可溶性PS之间的特定相互作用( 奥乔亚 等。, 2002 ). 此外,K209和K211也参与了PIP的研究 2 绑定( 科尔巴兰·加西亚 等。, 2003 ),而PS-和PIP 2 -碱性区赖氨酸的突变降低了依赖性酶的激活( 科尔巴兰·加西亚 等。, 2003 ; 罗德里格斯-阿尔法罗 等。, 2004 ). 这些研究指出,β3–4发夹的基本区域是区别于CBL的第二个功能性脂质结合位点。本文提供的成像实验直接证明,β3-4发夹及其与PIP的相互作用 2 对于靶向质膜是至关重要的。 因此,在cPLA中添加PKCαβ3–4发夹 2 /PKC_CBLs杂交产生天然PKCαC2样靶向PIP 2 -富含质膜的内叶。 此外,蛋白-膜FRET研究最终证明,β3–4发夹对识别PIP至关重要 2 通过混合域。 第二个膜相互作用位点在质膜靶向和PIP中的重要性 2 我们的实验进一步证实了这一认识,碱性区K209和K211的两个赖氨酸残基的突变促进了靶向主要是TGN而不是质膜。 值得注意的是,PKCαC2结构域的β3–4发夹中的基本区域突变产生了与杂交C2结构域相同的易位模式,该结构域具有PKCαC2-CBLs,但缺乏β3–4.发夹。 此外,我们的体外FRET研究表明PIP 2 β3或β4链中赖氨酸的突变对结合有很大影响。 总的来说,结果清楚地表明,β3–4发夹中的基本区域是正确靶向质膜和识别PIP所必需的第二个位点 2 .
CBL和基本区域具有重合检测功能
在这里,我们提供了证据表明,PKCαC2结构域的两个膜相互作用位点,即CBL和β3–4发夹的基本区域,都与钙有关 2+ -介导靶向PS和PIP 2 分别在质膜的细胞质表面。 目前的研究结果表明,钙 2+ 与CBL的结合对于体内外驱动膜结合是必要的,但不足以实现特定的质膜靶向。 相比之下,β3–4发夹的基本区域与PIP的相互作用 2 虽然不足以在缺乏钙的情况下驱动易位 2+ 通过与PIP的交互作用,需要绑定到CBL,以实现特定目标 2 -富含质膜。 钙 2+ 需要与CBL结合,为阴离子膜对接提供静电驱动力( 纳列夫斯基 等。, 1997 ; 埃文斯 等。, 2004 )也可能需要重新排列β3–4发夹,以产生适合PIP的构象 2 结合。
这两个功能区的存在是为了生成Ca 2+ -激活,PS/PIP 2 符合性检测对PKCαC2结构域起作用,进而对整个酶起作用。 钙 2+ -触发对PS和PIP的瞄准 2 通过将膜对接到磷脂酶C介导的PIP水解产生的高密度二酰甘油的质膜区域,质膜内可能发挥重要的生理作用 2 与PKCα的C1结构域结合,是其充分酶活性所必需的。 例如,有人建议PIP 2 和某些蛋白质,其中一些是已知的PKCα效应蛋白,在脂筏中富集,这些脂筏太小或间隔太近,荧光显微镜无法检测到( 霍普和派克,1996年 ; 劳克斯 等。, 2000 ; 内野 等。, 2004 ). 如果此类PIP 2 -富集的筏存在,它们可以作为信号复合物的组织中心,其中PKCα与其底物蛋白非常接近。 此外,PIP的调制 2 时空分布在PKCα调控中起重要作用。 需要以更高的空间分辨率进行进一步的体内研究或对分离的筏进行生化研究来研究这些可能性。
致谢
我们感谢J.-W.Soh提供的人类PKCα,M.Katan EGFP-PLCδ 1 PH结构域,以及用于TGN38-CFP和TGN38-YFP的K.Simons。 这项工作得到了美国国立卫生研究院GM063235(J.J.F.)、GM066147(D.M.)、HL061378和HL034303(C.C.L.)的支持。
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