1.简介

凝集素是非免疫来源的非催化性碳水化合物结合蛋白，广泛分布于微生物、植物和动物中。它们结合糖复合物或细胞表面碳水化合物引起红细胞和其他细胞的凝集。凝集素类参与许多生物过程，包括细胞-细胞识别、宿主-病原体相互作用、血清糖蛋白周转和先天免疫反应（Sharon，1993). 的应用凝集素包括用于复合物的结构表征碳水化合物； 凝集素也可用作诊断工具，用于保护植物免受病原体的侵害等.几种晶体的晶体结构凝集素从不同的来源和具有不同的特异性已经被确定（洛利斯等。, 1998). 其中大多数凝集素对单糖具有特异性，其血凝活性被抑制单糖或低聚糖。此外，凝集素具有仅被复合物抑制的复合物特异性糖蛋白类而不是单糖也有报道（Guzmán-Partida等。, 2004; 上田等。, 2002; 佐藤等。, 2000; 辛格等。, 2004; 赖特等。, 1999). 最近，来自钟形Scilla campanulata（SCAfet），针对复合物糖蛋白，已可用（PDB代码1磅; 赖特等。, 2000).

无芒卷柏通常被称为鹰嘴豆，是一种在印度广泛种植和消费的豆类。以前有一份从鹰嘴豆中分离出凝集素的报告（Kolberg等。, 1983)，但没有关于该凝集素的进一步研究报道。我们已经分离纯化了这个假俭草成熟鹰嘴豆种子中具有复合糖特异性的凝集素（CAL）。用高效液相色谱凝胶过滤法测定天然蛋白的分子量为43 000 Da。通过SDS–PAGE，在存在和不存在的情况下，它被鉴定为亚单位分子量为21 500 Da的同型二聚体β-巯基乙醇。凝集素本质上是碱性的（pI9.0），是一种含有4.5%中性糖的糖蛋白。这种凝集素既不凝集人类（血型A、B和O）也不凝集兔红细胞；然而，经蛋白酶处理的两者都已成功凝集。葡萄糖、甘露糖或半乳糖等糖及其衍生物，双糖，三糖和四糖对该凝集素的凝集活性有任何影响。CAL的复杂特异性的证据来自以下观察：使用约10µg脱硅胎球蛋白可以抑制1µg凝集素的血凝活性。CAL的所有上述观察结果与Kolberg报告的结果非常相似等。(1983)用于它们分离的凝集素。

2.材料和方法

3.结果和讨论

CD实验估计该凝集素的二级结构成分为34%螺旋，28%β-薄板和38%随机线圈；豆类凝集素的螺旋成分是意料之外的。因此，CAL的结构似乎与反平行的特征不同β-豆科植物的片状结构凝集素（洛里斯等。, 1998; 钱德拉等。, 2001)而且，与其他豆类不同凝集素，CAL对单糖或糖衍生物缺乏特异性（Reeke&Becker，1988).

CAL晶体（图1)衍射分辨率为2.3º，属于菱面体空间组 R（右）3，带单位-细胞参数一=b条= 81.2,c（c）= 69.4 Å. 表1总结了数据收集和处理统计数据共有126 672个测量反射合并为7121个独特反射R（右）_合并10.3%。合并的数据集完成了93.8%，布拉格间距为2.3º。由于进一步扩大分辨率（至2º）急剧增加，因此不包括超出此分辨率的数据R（右）_合并相应地降低了信噪比。尝试在低温（100 K）下使用低温保护剂（例如20–30%）收集数据(v（v）/v（v）)PEG200、PEG400、甘油或2,4-甲基戊二醇（MPD）由于闪速冷却晶体的镶嵌性高和衍射质量差而未能成功。晶体中的分子数非对称单元使用马修斯概率计算器进行估计，分辨率作为额外输入（Kantardjieff&Rupp，2003). 其中一个单体的概率最高（1.00）非对称单元和马修斯系数V（V）_M（M）（马修斯，1968年)估计为2.2欧^三 Da公司⁻¹对应于44.2%的溶剂含量。

图1 晶体假俭草凝集素（CAL）生长于0.1M（M）磷酸钠缓冲液pH 6.5，0.2M（M）乙酸钠和14%(w个/v（v）)聚乙二醇8000采用挂滴蒸发扩散法。

CAL制剂的N末端测序证实了之前报道的肽链前25个氨基酸的序列（Kolberg等。, 1983); 一爆炸搜索（Marchler-Bauer等。, 2003)基于上述针对非冗余数据库的部分序列，以90%的身份公开了匹配（图2)主要种子白蛋白（PA-2）的N末端序列豌豆[国家生物技术信息中心（NCBI）登录号P08688；Higgins等。, 1987]. 由于没有这种植物白蛋白的三维结构可用，其完整序列已用于与蛋白质数据库（PDB）中存储的结构序列进行比较。这个爆炸现在使用PA-2序列的搜索具有28%的一致性（图2)明胶酶A的C末端结构域（PDB代码1根; 利布森等。1995年). 因此，目前可获得的CAL部分序列表明，明胶酶A的C末端结构域虽然仅与CAL密切相关，但可以通过分子置换方法用于结构溶液。遗憾的是，用这种明胶酶A结构作为模型进行的分子置换计算并没有得出解决方案。仅因为目前没有完整的CAL序列可用，才尝试了上述结构解决方案的间接尝试。

图2 对齐假俭草凝集素（CAL）N端序列与白蛋白2（PA-2）的N端序列萨蒂乌姆松以及明胶酶A的C末端结构域，其结构可在蛋白质数据库（PDB代码1根). （相同的氨基酸以红色突出显示并用星形标记，保守替换的氨基酸以蓝色显示并用冒号标记）。路线是使用ClustalW公司v.1.82（汤普森等。, 1994).

我们现在正在努力生长重原子衍生物的晶体，从而确定假俭草凝集素通过MIR阶段化。同时，正在尝试通过生物化学方法或基因测序来确定CAL的完整氨基酸序列。