自闭症患者前脑源性神经营养因子蛋白水解异构体平衡的改变

摘要

突触发育和可塑性的缺陷可能导致自闭症。脑源性神经营养因子（BDNF）在突触发生和突触可塑性中起着关键作用。BDNF被合成为前体物pro-BDNF，它可以被加工成截短形式或成熟BDNF。以前的研究报道自闭症患者BDNF-免疫活性蛋白增加，但这种增加的机制尚未被研究。我们通过实时逆转录Y聚合酶链反应检测了11名孤独症患者和14名对照者死后梭形回组织中BDNF mRNA，并通过Western blotting和酶联免疫吸附试验检测了BDNF蛋白。自闭症患者与对照组样本的BDNF mRNA水平没有差异，但通过酶联免疫吸附试验测定的总BDNF样免疫反应蛋白在自闭症组中高于对照组。与对照组相比，蛋白质印迹显示自闭症患者的前BDNF水平更高，而BDNF截短率更低。这些数据表明，自闭症患者BDNF-免疫活性蛋白水平的增加并不是转录驱动的。增加的原-BDNF和减少的截短BDNF与原-BDNF-截短形式的缺陷加工一致。三种BDNF亚型之间平衡的扭曲，每种亚型可能表现出不同的生物活性，可能导致连接性和突触可塑性的改变，从而导致行为的改变。因此，蛋白水解酶亚型的不平衡可能是突触可塑性改变导致自闭症的新机制。

介绍

自闭症（AD）是一种终生神经系统疾病，其特征是社交和交流以及重复兴趣或行为的异常或受损发展(1). 边缘系统和皮层的发育异常已被充分记录(2–7). 自闭症患者大脑中受影响的区域与患者的行为特征有关。例如，孤独症患者面部识别技能异常，面部感知困难(8). 面部处理是由梭形回介导的，尤其是梭形面部区域，这是一个在面部识别任务中显示活动的枕颞皮质区域(9–11). 与AD面部处理相关的梭状回低激活已在各种研究中得到复制(12–14). 因此，使用分子方法对该区域进行检查可能会获得有关AD神经生物学和神经化学异常的信息。

AD的病因尚不清楚，但流行病学和双胞胎研究表明遗传因素在其发病机制中起着重要作用(2,15). 遗传显示了一种复杂的传播模式，被认为是多个相互作用基因的结果。孤独症相关易感基因鉴定方面的最新进展已确定了多种罕见的遗传事件，这些事件增加了AD的风险。其中包括染色体重排，如母体15q11–q13重复、拷贝数变异和特定突触基因突变(16–25). 这些基因编码与突触发生和兴奋/抑制失衡相关的蛋白质。最近的拷贝数变化(17)全基因组关联研究表明，神经发生、神经突起生长和引导以及可塑性涉及更多的基因集(20,26,27). 这些发现将注意力集中在发育过程中异常的神经突起生长、突触形成和连接性，这是AD的潜在原因(24,28).

脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是一种突触分子，在神经元存活和分化、树突状棘成熟以及发育过程中的神经炎分支和连接中发挥重要作用(29–33). 它在突触可塑性和长期增强中也起着关键作用，并参与学习、记忆和注意力(34–39). 精神分裂症患者的血清或大脑BDNF水平较低(40–42)，严重抑郁症(43)和阿尔茨海默病(44–47).

脑源性神经营养因子合成为32-kDa前体，可通过furin、基质金属蛋白酶7或纤溶酶（48Y50）加工成14-kDa-成熟形式。在自闭症患者大脑中被证明异常的区域中发现前体、前BDNF和成熟形式(4,51,52). 与成熟的BDNF相比，Pro-BDNF表现出不同且相反的功能。它减少神经元分化和树突状棘，诱导培养神经元的凋亡和长期抑制，而成熟的BDNF促进棘的形成、神经元存活和长期增强(35,53–55). 干扰前BDNF处理和成熟BDNF分泌的前体蛋白多态性与记忆缺陷有关(56,57). 此外，已经发现这种多态性与精神疾病（包括精神分裂症）之间存在遗传关联(58). 这表明前BDNF和成熟BDNF的失衡可能导致神经退行性或精神疾病。Pro-BDNF也可以由钙依赖性丝氨酸蛋白酶（称为膜结合转录因子蛋白酶位点1（MBTPS-1））在不同的位点进行处理，也被称为枯草杆菌素/激酶同工酶（SKI-1）。这种裂解产生28kDa截短的BDNF亚型(59). 这种亚型没有进一步加工成成熟的14-kDa BDNF，因此，它代表了真正的最终蛋白水解产物。尽管这种亚型的生物学作用尚未阐明，但最近在精神分裂症患者的血清中发现，前BDNF和成熟BDNF增加，截短BDNF减少(60). 因此，BDNF所有亚型的相对水平在精神疾病中可能很重要。

由于BDNF在神经元发育中的重要作用，高于正常水平的BDNF可以解释AD患者出现的异常突触连接和神经递质失衡以及大脑加速生长的异常轨迹。一些研究报告称，自闭症患者BDNF-免疫活性蛋白增加。随后诊断为孤独症的儿童的新生儿脐血中BDNF蛋白与对照组相比增加了36%(61). 然而，同一组随后的一份使用Luminex分析的报告显示，各组之间的BDNF水平没有差异(62). 血清中也有BDNF免疫反应性升高的报道(63,64)，在富含血小板的血浆中(65)，以及自闭症患者的基底前脑组织(66). 然而，尚不清楚这种增加的BDNF蛋白是来自转录上调还是来自翻译或翻译后机制，因为在自闭症患者的脑组织中，BDNF mRNA水平和蛋白亚型均未检测到。只有一项研究检测了AD患者BDNF mRNA水平；据报道，与对照组相比，未服用药物的成年男性AD患者血淋巴细胞中BDNF表达升高(67). 在这项研究中，我们检查了梭状回区域的死后组织，以确定自闭症患者和对照组之间BDNF mRNA和蛋白亚型水平的差异。

材料和方法

人脑组织样本

自闭症演讲者自闭症组织项目（新泽西州普林斯顿）通过哈佛脑组织资源中心（马萨诸塞州贝尔蒙特）和马里兰大学脑组织库（马里兰州巴尔的摩）提供了11名自闭症患者和14名对照者的死后大脑样本。2份孤独症样本（1份和8份）均未获得高质量RNA。其余9份AD和所有对照样品用于mRNA分析。所有11例孤独症患者和14例对照组样本均用于ELISA；9份孤独症和9份对照样本用于Western blot分析，因为2份孤独主义和5份对照样本是在稍后获得的，无法同时进行分析。所有组织均来自大脑梭状回区。通过自闭症组织计划在线门户获取每个组织样本的临床数据(http://www.atpportal.org) (表1和2). 使用自闭症诊断访谈-修订版确认AD的诊断(68)通过与父母和/或照顾者面谈进行尸检。组织样本在使用前储存在−80°C的温度下。

试剂

亲合力纯化的兔多克隆BDNF抗体N-20和用于培养它的肽（人类BDNF成熟形式的氨基末端定位）购自Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）。小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体来自Sigma（加拿大安大略省奥克维尔）。辣根过氧化物酶结合的驴抗兔和羊抗鼠抗体是从Amersham Pharmacia Biotech（加拿大魁北克省Baie d’Urfé）获得的。人类重组BDNF是安进（加利福尼亚州千橡树）慷慨赠送的礼物。BDNF ELISA试剂盒购自Promega（威斯康星州麦迪逊）、Chemicon（加利福尼亚州特梅库拉）和R&D Systems（明尼阿波利斯）。Trizol试剂来自Invitrogen（加拿大安大略省伯灵顿）。抑肽酶来自Sigma，胃蛋白酶抑制素来自Boehringer Mannheim（加拿大魁北克省拉瓦尔），苯甲基磺酰氟来自Life Technologies（加拿大安大略省伯灵顿）。Hybond-P聚偏二氟乙烯膜购自Amersham Pharmacia Biotech。预存宽范围蛋白质分子量标记和D_C类蛋白质检测试剂盒和试剂来自Bio-Rad（加拿大安大略省米西索加）。DNA酶治疗试剂盒购自Ambion（德克萨斯州奥斯汀）。反转录（RT）试剂来自Invitrogen（Carlsbad，CA）。引物由麦克马斯特大学MOBIX合成。铂SYBR Green qPCR Supermix UDG来自Invitrogen。所有其他化学品均为试剂级。

RNA分离

RNA分离、DNA酶处理和实时RT-聚合酶链反应如前所述进行修改(69). 每个样品使用0.08至0.13 g组织分离总RNA。使用Polytron均质器（Brinkmann Instruments）或声波隔膜器（Fisher Scientific，渥太华，加拿大安大略省）将每个冷冻样品均匀化在1 mL/0.1 g湿重的冰上Trizol试剂组织中。使用均质器时，根据Trizol试剂说明纯化RNA。通过超声波方法获得的脑匀浆在RNeasy自旋柱（加拿大安大略省米西索加市齐根）上纯化，而不是乙醇沉淀。通过在260和280nm处的吸光度来测定总细胞RNA的产率和纯度。用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。RNA样品储存在负极使用前温度为80°C。

DNA酶处理与cDNA合成

根据制造商的协议（Ambion），RNA样品在RT前用DNase处理。cDNA在含有2.5μg DNA酶处理样品、10 mmol/L dATP、dCTP、dGTP和dTTP（Invitrogen）以及250 ng随机引物（Invit罗gen）的反应混合物中生成。样品在65°C下培养5分钟，然后添加1×第一股缓冲液（3 mmol/L MgCl₂、75 mmol/L KCl、50 mmol/L-Tris-HCl、pH 8.3）、0.01 mol/L二硫苏糖醇、40单位RNaseOUT和50单位上标II。反应在GeneAmp PCR系统2400热循环器（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）中进行，温度为25°C，持续10分钟，然后在42°C下持续50分钟，在70°C下热灭活15分钟。阴性对照与含有双蒸馏水的每个RT并行运行，以代替RT（非RT对照）。

BDNF实时PCR

BDNF引物、正向引物5′-AAA CAT CCG AGG ACA AGG TG-3′和反向引物5’-AGA AGA GGA GGC TCC AAA GG-3′产生249-bp片段。A-actin引物、正向引物5′-CTC TTC CAG CCT TCC TTC-3′和反向引物5’-TGT TGG CGT ACA GGT CTT-3′均扩增出110-bp片段。对Stratagene MX3000P（加利福尼亚州拉霍亚）进行实时PCR。总反应体积为20μL，其中包括来自100 ng RNA的cDNA和以下组分：300 nmol/L的BDNF正向和反向引物，10μL的SYBR Green qPCR Supermix UDG（Invitrogen），以及30 nmol/L的Stratagene ROX参考染料。对于β-肌动蛋白，使用150nmol/L的正向和反向引物。纳入含有双蒸馏水代替cDNA的阴性对照，以确保所有试剂均未受到污染。采用SYBR绿绝对定量法测定BDNF和β-肌动蛋白水平。BDNF标准物来自BDNF质粒（pGEM包含755 bp的整个BDNF编码区，NCBI登录号AY890649），β-actin标准物来自Invitrogen获得的质粒。BDNF和β-肌动蛋白的热曲线：50℃下2分钟，95℃下2 min，然后在95℃下40次循环15秒，58℃下30秒，72℃下30秒钟。琼脂糖凝胶电泳分析的PCR产物样品显示出预期大小的单一条带。40个PCR循环后的分离曲线证实了BDNF和β-肌动蛋白的单一产物。

使用MXPro MX3000P软件（Stratagene）计算拷贝数和实时PCR效率。只有实时PCR效率在90%到100%之间且标准曲线产生R的实验²>0.990用于分析。每个样品一式三份。双尾学生计算了自闭症和对照样本之间BDNF水平的差异t吨三份C平均值的试验_t吨使用SPSS（SPSS Inc.，伊利诺伊州芝加哥）得出的值。

Bdnf Elisa公司

使用BDNF E进行蛋白质分离和BDNF ELISA_最大值免疫分析系统（Promega）、人BDNF量化因子ELISA（R&D系统）和ChemiKine BDNF夹心ELISA试剂盒（Chemicon）符合制造商的协议。每个样品最初调整为相同的蛋白质浓度（Promega为0.5 mg/mL；Chemicon和研发系统为1 mg/mL）。对于Promega试剂盒，用1 mol/L HCl酸化样品，使pH值低于2.5，持续15分钟，然后用NaOH中和至pH值7.6。使用重组BDNF蛋白在每个ELISA板上运行标准曲线。每个样品测试三份。采用三倍平均数进行双尾Student t检验。

从脑组织中提取蛋白质

蛋白质提取如前所述，但略有改进(70). 使用Polytron均质器在冰上均匀化约50至100 mg组织，而不解冻，或使用声波隔膜在10 mL/g湿重组织匀浆缓冲液中在冰上超声处理（50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，10 mmol/L乙二胺四乙酸，0.5%吐温-20，2μg/mL抑肽酶，2μg/mL pepstatin和100μg/mL苯甲基磺酰氟）。将匀浆在冰上孵育15分钟，然后在16000g下在4-C下离心15分钟。将含有可溶性蛋白质的上清液校准并储存在−80°C下。蛋白质浓度使用D_C类蛋白质检测试剂盒。

西方印迹法

如前所述，进行了蛋白质印迹，但进行了少量修改(46,47). 简单地说，在还原条件下，在12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中分解每个样品的20μg蛋白质。转移到聚偏二氟乙烯膜上后，用10%脱脂奶粉在TBS-T（50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，133 mmol/L-NaCl，0.1%（v/v）Tween-20）中封闭斑点，然后用一抗N-20培养（TBS-T中1:1000稀释）4-C和辣根过氧化物酶结合驴抗兔二级抗体（TBS-T中1:5000稀释）在室温下过夜1小时。使用增强化学发光系统（Amersham Pharmacia Biotech）进行检测。根据制造商的协议（圣克鲁斯生物技术），抗体的特异性通过用5倍或10倍摩尔过剩的抗原肽阻断免疫反应进行测试。所有样本均在2到3个独立的Western blots中进行分析。

Western Blots的量化

每个Western blot都包含一条标准曲线，该曲线由每条通道中不同数量的蛋白质组成，作为对照，以确保样品装载量和x射线胶片曝光时间在BDNF亚型检测的线性范围内。使用ImageJ 1.43测量免疫反应带的强度（Wayne Rasband，美国国立卫生研究院；http://rsb.info.nih.gov/ij)减去局部背景。对于每个样本，每个BDNF亚型的相对丰度表示为该BDNF异构体与总BDNF信号的比率。总BDNF计算为前BDNF、截断BDNF和成熟BDNF的总和。对于每个亚型，每个样品的2到3个杂交比率的平均值用于统计分析。使用双尾Student t检验计算各组之间的差异。

结果

自闭症患者与对照组患者BDNF mRNA表达无差异

对照组（n=14）和自闭症组（n=9）的梭状回BDNF mRNA水平无显著差异（双尾t检验，p=0.35；图1). 每个样本的BDNFC类_t吨值被归一化为β-肌动蛋白C类_t吨值。β-肌动蛋白在过去被用作参考基因，因为其水平在阿尔茨海默病等神经疾病中不会改变(45). β-肌动蛋白的研究C类_t吨对照组和自闭症样本之间的数值没有显著差异（p=0.89，数据未显示）。

ELISA法检测自闭症患者与对照组梭状回BDNF-样免疫反应性增加

研究发现，酸处理可以改变ELISA检测到的各种组织或样品类型中的神经营养因子数量(72,73). 酸处理会破坏BDNF与其受体、TrkB或其他结合蛋白之间的相互作用，这可能无法准确测量BDNF总量。因此，我们首先测试了酸处理对均质大脑样本的影响。酸化和随后的中和使ELISA检测到的BDNF免疫反应性增加约为未酸化样品的4倍（数据未显示）。酸化（Promega）和非酸化（Chemicon，R&D Systems）方法组间BDNF水平的相对差异没有差异。自闭症患者梭状回中BDNF蛋白水平是对照组的2倍（p=0.026;图2). 所有3个试剂盒的ELISA结果相似。

用Western印迹法测定BDNF蛋白异构体平衡

兔抗BDNF多克隆免疫球蛋白G免疫印迹法检测人脑内多条免疫反应带(图3). 用过量的抗原肽阻断免疫反应证明了几个条带的特异性。33-kDa带对应于pro-BDNF的分子量。我们的印迹中的28-kDa带对应于一个先前被确定为pro-BDNF截断形式的28-kDa带(59). 14-kDa-免疫活性带被鉴定为成熟BDNF，因为它与重组人BDNF结合(48,59). 24-kDa带以前没有描述过，可能是前BDNF到成熟BDNF蛋白水解过程中的中间产物。该频带仅占总BDNF信号的很小一部分（1%–3%）；在分析中是否包括它并不影响结果。

对每种BDNF亚型与总BDNF像素值的平均比率的统计分析表明，组×亚型的交互作用非常显著（双向方差分析，p<0.001）。Western blotting显示，与对照组相比，自闭症样本中截断的BDNF/总BDNF比率显著降低（双尾t检验，p<0.01；图4)pro-BDNF增加（双尾t检验，p<0.05；图4). 与对照组相比，自闭症样本中成熟BDNF/总BDNF的比率呈现出增加的趋势（双尾t吨试验，p=0.15；图4).

死亡时或死后间隔时间不受年龄的影响

对照组和孤独症组的死亡年龄之间没有统计学上的显著差异（RNA研究的p=0.12，ELISA的p=0.25，Western blotting的p=0.64）(表1和2). 同样，对照组的平均尸检间隔（PMI）与孤独症组的平均PMI之间也没有显著差异（RNA研究的p=0.67，ELISA的p=0.85，Western的p=0.81）。虽然PMI比Ferrer等人报告的成熟BDNF蛋白保存所需的12小时长(71)，ELISA测定的PMI和BDNF蛋白水平之间没有相关性(R（右）²=0.19，p=0.36）或通过Western印迹法(R（右）²=0.0015，p=0.62）。因此，在我们的研究中，PMI对BDNF蛋白水平几乎没有影响。回归分析表明，BDNF mRNA水平与年龄无关(R（右）²=0.026，p=0.46）或PMI(R（右）²=0.065，p=0.24）。我们没有发现ELISA测定的BDNF蛋白水平与年龄之间的相关性(R（右）²=0.007，p=0.97）或通过Western blotting测定的BDNF蛋白水平与年龄之间(R（右）²p=0.001，p=0.88）。

癫痫和药物史

因为已经发现癫痫发作可以上调BDNF mRNA和蛋白(74–76)，首次获取组织时，经历癫痫发作的受试者被排除在样本人群之外。该排除标准用于控制癫痫发作对BDNF表达的影响。然而，在进行实验后，受试者4、5、6和7被发现患有共病性癫痫。排除这些受试者的分析没有改变所有3种技术测量的mRNA或蛋白质水平的组平均值或显著性。有癫痫发作史的孤独症患者与无癫痫发作史患者的mRNA和蛋白质水平比较（t检验）表明，mRNA（癫痫发作，n=4；无癫痫发作，n=5；p=0.43）、BDNF蛋白（ELISA测定）（癫痫发作次数，n=4,无癫痫发作次数（n=7；p=0.34）、前BDNF（癫痫发作数，n=4；无癫痫发作，n=5；p=0.62），或截断BDNF（发作，n=4；无发作，n=5；p=0.79）。然而，与未发作组（发作，n=4；未发作，n=5；p=0.04）和对照组（n=9；p=0.005）相比，发作组的成熟BDNF水平升高。

抗惊厥药物已被证明可以纠正癫痫引起的BDNF上调(77). 共有5名AD受试者(4–7,11)正在服用抗惊厥药物的患者。接受抗惊厥药物治疗的AD受试者与未接受抗惊厥药物治疗的AD受试者之间的比较（t检验）显示，BDNF mRNA（抗惊厥剂，n=5；无，n=4；p=0.97）、ELISA测定的BDNF蛋白（抗惊厥剂，n=5；无，n=6；p=0.40）、前BDNF（抗惊厥剂，n=4；无，n=5；p=0.62），或截断BDNF（抗惊厥药，n=4；无，n=5；p=0.79）。然而，成熟BDNF在各组之间存在显著差异。用抗惊厥药物治疗的孤独症组的BDNF/总成熟度明显高于未治疗孤独症（p=0.038）或正常对照组（p=0.008）。

讨论

在这项研究中，我们通过ELISA发现自闭症患者梭形回中BDNF-免疫活性蛋白增加，与早期报道一致。先前的研究报告称，死后基底前脑组织中BDNF蛋白含量较高(66)血液和血清中(61,63–65)孤独症样本与对照组的比较。我们的研究是首次检测梭状回中BDNF蛋白和mRNA的，梭状回是孤独症患者已知的功能异常区域。我们的研究也是第一次检验这种增长的机制。使用实时RT-PCR，我们发现自闭症患者梭状回中BDNF mRNA的水平与对照组相比没有差异，从而证明相同样本中BDNF-免疫活性蛋白的增加不是转录驱动的。重要的是，Western blotting表明，ELISA检测到的BDNF免疫反应性增加是由两组之间的前BDNF和截短BDNF亚型的相对水平的显著变化引起的，这表明自闭症患者的前BDNF蛋白水解过程可能会改变为截短BDNF。此前的研究报道了自闭症患者脑组织中其他神经营养素和细胞因子的增加(78,79)表明许多分泌肽发生了改变，这可能是导致孤独症患者突触发育和可塑性缺陷的一般机制。

翻译或稳定性不太可能解释异构体中的这些差异。翻译的增加可以解释pro-BDNF的增加，但不能解释截断BDNF的减少，除非与相应的缺陷相结合，将其转换为截断的BDNF。本研究中BDNF亚型水平与PMI之间缺乏相关性（除了我们之前发表的实验表明PMI对BDNF水平没有影响[46,47]外），这表明死亡后降解或蛋白质不稳定是一种机制。先前的研究表明，癫痫发作上调了BDNF mRNA和成熟BDNF蛋白(74–76)但是，我们发现患有和不患有共病性癫痫的受试者以及服用抗惊厥药物的受试对象与未服用此类药物的受试验者相比，前BDNF或截断BDNF水平没有显著差异。因此，在我们的研究中，如果没有BDNF mRNA的同时增加，癫痫发作不太可能导致前BDNF蛋白的增加。自闭症患者蛋白水解过程的失调与癫痫发作无关，是一种可能的替代机制。蛋白酶SKI-1将pro-BDNF转化为截断的BDNF(59)因此，它是导致这种失调的一个很好的候选者。

先前使用免疫亲和色谱法和ELISA的研究与我们的研究（包括Western分析）之间的主要区别在于，ELISA测量溶液中的抗体反应性，而在Western印迹中，蛋白质是根据大小进行分离的，从而可以观察单个蛋白质亚型。通过Western blotting，我们证明与对照组相比，自闭症受试者的前BDNF显著增加，截断BDNF明显减少。因此，测量自闭症患者BDNF增加的夹心ELISA可能检测到前BDNF，但对截断的BDNF不太敏感。与此一致，通过Western blotting测定的总BDNF（前BDNF+截断BDNF+成熟BDNF，归一化为β-actin）(表1,2)孤独症组和对照组之间没有差异（t检验，p=0.35），也没有表现出ELISA所示的2倍差异。另一方面，与对照组相比，Western blots中测得的前BDNF/β-肌动蛋白比率显示出自闭症患者增加的趋势(t吨试验，p=0.07），再次表明用于ELISA的抗体主要检测前BDNF。

AD中前BDNF增加和截短BDNF减少强烈表明所有3种BDNF亚型之间适当平衡的重要性。pro-BDNF的急剧增加可能会产生不良后果。前BDNF的生物学特性表明，这种亚型的增加可能是导致自闭症患者神经元分化和树突棘减少，突触连接和神经递质水平改变的原因(35,53–55). BDNF亚型之间平衡的扭曲可能导致连接性和突触可塑性的改变，从而导致行为改变。我们的研究结果集中于蛋白质水解成熟缺陷，这可能是突触可塑性改变导致自闭症的新机制。

事实上，一些研究支持BDNF亚型的缺陷或失衡可能导致神经精神障碍的假设。BDNF前体蛋白的多态性降低了前BDNF处理和BDNF分泌，与情节记忆缺陷相关(56,57); proBDNF和BDNF减少与轻度认知障碍和阿尔茨海默病患者的认知功能下降相关(47); 截断BDNF减少与精神分裂症的认知障碍相关(60). 动物研究表明，BDNF减少会损害长期增强、学习和记忆(80–82). 因此，增加前BDNF和减少截断BDNF可能对自闭症患者的学习、记忆和注意力产生同样严重的影响。截短的亚型的生物学作用尚不清楚，因此，这种亚型比率变化的全面影响尚待确定。

总之，与对照组相比，自闭症患者梭形回中BDNF mRNA水平没有变化。ELISA测定的自闭症患者的BDNF-免疫活性蛋白高于对照组，Western blotting鉴定出相关的分子物种为前BDNF。增加的pro-BDNF和减少的截断BDNF表明，自闭症患者在将pro-BDNFs加工成截断形式时可能存在缺陷。BDNF亚型平衡的这种扭曲可能会产生严重的神经精神后果。

工具书类

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