Steady State Kinetics for Enzymes with Multiple Binding Sites Upstream of the Catalytic Site

Osorio, Manuel I.; Petrache, Mircea; Salinas, Dino G.; Valenzuela-Ibaceta, Felipe; González-Nilo, Fernando; Tiznado, William; Pérez-Donoso, José M.; Bravo, Denisse; Yáñez, Osvaldo

doi:10.3390/sym15122176

开放式访问第条

催化位点上游多结合位点酶的稳态动力学

通过

曼努埃尔·奥索里奥

^1,2,*

,

米尔恰·彼得拉奇

^三

,

迪诺·G·萨利纳斯

²,

费利佩·瓦伦苏埃拉·伊巴斯塔

⁴,

费尔南多·冈萨雷斯-尼洛

⁴,

威廉·蒂兹纳多

⁵

,

何塞·M·佩雷斯-多诺佐

⁴

,

丹尼斯·布拉沃

¹和

奥斯瓦尔多·亚涅斯

^6,*

¹

智利圣地亚哥安德烈斯·贝洛大学牙医学院，邮编8370133

²

智利圣地亚哥迭戈波塔莱斯大学医学院，邮编8370007

^三

智利天主教大学Matematicas学院，阿夫达。智利圣地亚哥Vicuña Mackenna 4860号，邮编6904441

⁴

智利圣地亚哥安德烈斯·贝洛大学维达学院生物信息学和综合生物学中心，邮编8370186

⁵

计算和理论化学小组，智利圣地亚哥，邮编：8370251

⁶

智利圣地亚哥，拉斯维加斯大学，Nücleo de InvestigacionóN en Data Science，Facultad de Ingeniería y Negocios

^*

应向其发送信件的作者。

对称 2023,15(12), 2176;https://doi.org/10.3390/sym15122176

收到的提交文件：2023年10月13日/修订日期：2023年11月8日/接受日期：2023年11月13日/发布日期：2023年12月8日

（本文属于特刊生物学和生命科学中的数学建模)

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版本注释

摘要

:

Michaelis–Menten机制描述了底物与酶的结合，是在分子尺度上对该过程的简化。更详细的模型应包括在过渡到催化位点之前底物与催化前结合位点（PCBS）的结合。我们的工作表明，在稳态条件下，加入PCBS会生成Michaelis–Menten型表达式，其中动力学参数KM和Vmax采用比不含PCBS的模型更复杂的表达式。控制反应动力学的方程可视为相对于基本化学系统状态空间上的时间平移作用的广义对称性。对它们的结构和定义参数的研究可以被解释为寻找与这些时间演化行为相关的不变量。的表达式

{K（K）}_{M（M）}

随着PCBS数量的增加而减少，而

{V（V）}_{米 一 x个}

当第一个PCBS合并到模型中时达到最小值。为了评估系统动态行为的趋势，基于不同PCBS数量和六个动力学常数条件的方案进行了数值模拟。通过这些模拟，在底物/PCBS复合物形成的动力学常数相等的情况下，可以观察到

{K（K）}_{M（M）}

和

{V（V）}_{米 一 x个}

比迈克利斯-门登模型得到的结果要低。对于带有PCBS的模型

{V（V）}_{米 一 x个}

在一个PCBS上达到最小值，并且该值为所有评估的系统保持不变。自

{K（K）}_{M（M）}

随着PCBS数量的减少，符合此模型的酶的催化效率增加。所有这些观察结果都与获得的一般方程一致。本研究允许我们在PCBS的基础上解释

{K（K）}_{M（M）}

和

{V（V）}_{米 一 x个}

比率，在参与第一个酶/底物相互作用的位点，远离催化位点的突变对酶参数的影响。此外，它还包含了一种新的酶活性调节机制，这对于寻找新的活性调节位点或设计具有修改酶参数的突变体可能是基础。

关键词：

稳态酶动力学;多重催化结合位点;数值模拟

图形摘要

1.简介

酶是一种大分子，是氨基酸的聚合物，可以将化学反应加速几个数量级，使其以能够维持生命的速度发生[1]. 这一过程发生在酶的一个称为催化位点的小区域，催化位点通常位于凹槽或缝隙中，可以控制溶剂的进入[2]. 为了进入催化位置，必须从溶剂中转移底物，根据与第一次接触的距离，其路径可以跨越20º[三]. 正如在模拟1,2,3-三氯丙烷底物与卤代烷脱卤酶A和卤代烷脱卤酶A31的结合时所观察到的那样，底物从溶液到催化位点的路径为20°[4]. 在这一途径中，如酶/配体复合物形成的模拟所示，在第一阶段，底物与酶表面相互作用，降低其流动性和水合层中的水分子数量[5]. 蛋白质表面的底物可能有不同的初始结合位点，这决定了它的运动轨迹。在磷酸阴离子与磷酸结合蛋白催化位点的结合路径中观察到了这种行为[6]. 对于这种特殊情况，建议催化位点附近的区域显示带电残余物，这些残余物分布使得底物被导向催化位点。同样，分子动力学模拟已经确定了头孢菌素酰化酶以前的结合位点，头孢菌素酰基化酶是一种可用于合成合成抗生素头孢菌素的酶[7]. 在抑制剂苯甲脒与胰蛋白酶结合的分子动力学模拟过程中观察到类似的过程，确定了结合概率增加的位点[8]. 考虑稳态动力学得到的数学模型侧重于不同抑制剂或具有协同作用的系统的多基质模型，但催化前位点（PCBS）的方法尚未解决[9,10]. 考虑到稳态动力学，所获得的数学模型侧重于不同抑制剂或具有协同性的系统的多底物模型，但预催化位点（PCBS）的方法尚未得到解决。考虑到稳态动力学，所获得的数学模型侧重于不同抑制剂或具有协同作用的系统的多底物模型，但尚未讨论催化前位点（PCBS）的方法。用于具有多域协同作用的酶（如血红蛋白）的模型采用Hill方程，该方程具有S形，但使用相同的PCBS方案[11]. 为了描述酶抑制，使用了相同的方案，没有添加代表抑制剂结合的可逆步骤的PCBS。如果酶处理多个底物，则可以使用与上述相同的MM方案获得多个动力学方案的模型。对于抑制和多底物模型，稳态动力学生成一个矩形双曲线图，与没有抑制剂的单底物情况没有区别，动力学参数包括与抑制剂和不同底物相关的因素。然而，上述所有模型都使用了1913年制定的迈克利斯-芒滕计划，对该计划做出了重大贡献，包括布里格斯和霍尔丹1925年的计划，以及施内尔和梅尼2003年的计划；2019年的论文详细描述了这些贡献[12]. 有趣的是，有几篇数学论文使用图论和范畴理论讨论了反应网络（参见示例[13])并针对反应动力学的一般理论方面[14]. 然而，在之前的参考文献中，动力学常数的影响和酶动力学应用的研究仍停留在比目前工作更为理论/定性的水平。因此，目前尚不清楚PCBS的存在如何影响酶的催化能力，也不知道这种现象是否与任何酶功能有关。为了解决这个问题，我们从没有PCBS或Michaelis–Menten（MM）的简单通用方案转移到有PCBS的方案，并评估了PCBS数量增加对动力学参数的影响。通常使用的动力学方案(图1a）从中考虑稳态，MM方程(

v（v） = \frac{{V（V）}_{最大值} \cdot [S公司]}{{K（K）}_{米} + [S公司]}

)包括底物（s）、酶（e）、产物（p）和酶/底物复合物（es）的浓度（使用了浓度的简化表示法）。从这个模型中，我们得到了酶对底物或米氏常数的亲和力的表达式(

{K（K）}_{M（M）} = \frac{{k个}_{2} + {k个}_{- 1}}{{k个}_{1}}

)以及给定酶浓度下的最大可能活性(

{V（V）}_{米 一 x个} = {k个}_{2} * {E类}_{T型 o个 t吨 一 我}

). 根据这些动力学参数，可以计算催化效率

C类 一 t吨 一 我 年 t吨 我 c（c） e（电子） （f） （f） 我 c（c） 我 e（电子） n个 c（c） 年 = \frac{{V（V）}_{最大值}}{{K（K）}_{M（M）}}

，是酶对特定底物选择性的指标。因此，作为

{V（V）}_{米} 一 x个

增加和

{K（K）}_{M（M）}

对于给定的底物，酶的催化效率降低时，相对于该底物，其催化效率增加，导致对该底物的选择性增加。由于这是一个评估酶活性的相关指标，因此这是一种广泛使用的评估酶活性指标。评估PCBS数量与参数之间的关系

{K（K）}_{M（M）}

和

{V（V）}_{米 一 x个}

，我们使用了一个动力学模型，其中包括i-PCBS在催化位置收敛(图1b）在稳态条件下，导出了Michaelis–Menten型酶活性的数学表达式。这种依赖性通过数值模拟进行评估，使用Python编写的程序，该程序使用动力学库[15,16,17]。

2.材料和方法

我们详细推导了与反应网络相对应的数学框架(1磅)英寸第3.1节，主要的简化假设是系统处于平衡状态，这在底物浓度远大于酶浓度的假设下是合理的。为了用各种PCBS模拟动力学系统，我们使用了Python软件包Kinetics[16]之前已成功用于与各种底物、抑制剂和代谢途径的反应，以进行通量控制分析。在我们的研究中，我们使用此软件包的“一般反应”工具来获得具有不同数量PCBS的系统的动力学参数。所有模拟中均使用0.0002 mM的酶浓度，并从模拟的前10次迭代中获得初始速度。获得了底物浓度为0.1、0.2、0.5、5、10、100 mM时的动力学参数。所有使用的单位均为参考值。然而，如果比率保持不变，它们可以按实验使用的单位进行缩放；因此，所有浓度值都将被视为mM。具有相等结合动力学常数的等效PCBS

{k个}_{j个}^{我}

(j个可以取值1和2）以及相等的离解常数

{k个}_{- j个}^{我}

(j个可以取值1和2）。对动力学常数的不同条件进行了评估，但离解常数的值始终低于络合物形成动力学常数

{k个}_{- 1}^{我} = {k个}_{- 2}^{我} = 0.01

，并模拟无PCBS的条件作为对照。对于评估的所有条件，模拟生成参数

{V（V）}_{米 一 x个}

和

{K（K）}_{M（M）}

，通过使用所用常数进行计算得出。对于表1，条件（a）

{k个}_{1}^{我} = {k个}_{2}^{我} > {k个}_{c（c） 一 t吨}

（值分别为10、10和2）。对于表2，条件（b）

{k个}_{c（c） 一 t吨} > {k个}_{1}^{我} = {k个}_{2}^{我}

（值分别为10、2和2）表3，（c）

{k个}_{c（c） 一 t吨} > {k个}_{1}^{我} > {k个}_{2}^{我}

（值分别为10、6和2）。对于图2，除了表中评估的条件外，还测试了三个额外的条件：（d）

{k个}_{c（c） 一 t吨} > {k个}_{2}^{我} > {k个}_{1}^{我}

，（e）

{k个}_{1}^{我} > {k个}_{2}^{我} > {k个}_{c（c） 一 t吨}

和（f）

{k个}_{2}^{我} > {k个}_{1}^{我} > {k个}_{c（c） 一 t吨}

。可以通过访问访问用于模拟每个条件的Python程序[16]。

3.结果

3.1. 具有几种PCBS的酶的稳态动力学

来自方案(1磅)改变了物种标记法，以区分游离酶和底物（e+s）与酶-底物复合物（es）。因此，综合体c（c）由与i-sth PCBS结合的配体形成

{c（c）}^{我}

，与催化位点结合的配体形成的络合物称为

{c（c）}^{*}

。符号的这一变化未纳入(1磅)以显示与MM模型的相似性。根据中的示意图图1b，根据速率定律，每个物种浓度的变化可以表示为：

\frac{d日 秒}{d日 t吨} = \sum_{我} {k个}_{- 1}^{我} {c（c）}^{我} - \sum_{我} {k个}_{1}^{我} e（电子） \cdot 秒,

(1)

\frac{d日 {c（c）}^{我}}{d日 t吨} = {k个}_{1}^{我} e（电子） \cdot 秒 - {k个}_{- 1}^{我} {c（c）}^{我} - {k个}_{2}^{我} {c（c）}^{我} + {k个}_{2}^{我} {c（c）}^{*},

(2)

\frac{d日 {c（c）}^{*}}{d日 t吨} = \sum_{我} {k个}_{2}^{我} {c（c）}^{我} - \sum_{我} {k个}_{2}^{我} {c（c）}^{*} - {k个}_{三} {c（c）}^{*},

(3)

\frac{d日 第页}{d日 t吨} = {k个}_{三} {\cdot c（c）}^{*} .

(4)

假设底物浓度远大于酶浓度(

秒 ≫ e（电子）

)，我们可以使用反应的稳态区近似。在这种情况下，我们可以假设速度恒定，我们得到每个PCBS处酶-底物复合物的浓度(

{c（c）}^{我}

)在催化位置(

{c（c）}^{*}

)不要改变。这表示如下：

\frac{d日 {c（c）}^{我}}{d日 t吨} ≅ 0, \frac{d日 {c（c）}^{*}}{d日 t吨} ≅ 0 .

(5)

此外，我们有以下方程式表示酶的质量平衡：

e（电子） + \sum_{我} {c（c）}^{我} + {c（c）}^{*} = {E类}_{T型},

(6)

哪里

{E类}_{T型}

是酶的总摩尔浓度。在将每个方程表示为函数后，通过求解方程（2）、（3）和（6）的系统，可以得到以下Michaelis–Menten型方程

{c（c）}^{*}

在方程式中替换它(4).

\frac{d日 第页}{d日 t吨} = \frac{{k个}_{三} \frac{问}{\sum_{我} 问_{我} + 问} {E类}_{T型} 秒}{\frac{1}{\sum_{我} 问_{我} + 问} + 秒}

(7)

其中Q和

问_{我}

是：

问 = \frac{\sum_{我} \frac{{k个}_{1}^{我} {k个}_{2}^{我}}{{k个}_{- 1}^{我} + {k个}_{2}^{我}}}{\sum_{我} \frac{{k个}_{- 2}^{我} {k个}_{1}^{我}}{{k个}_{1}^{我} + {k个}_{2}^{我}} + {k个}_{三}}

(8)

问_{我} = \frac{{k个}_{1}^{我}}{{k个}_{- 1}^{我} + {k个}_{2}^{我}} + (\frac{{k个}_{- 2}^{我}}{{k个}_{- 1}^{我} + {k个}_{2}^{我}}) (\frac{\sum_{我} \frac{{k个}_{1}^{我} {k个}_{2}^{我}}{{k个}_{- 1}^{我} + {k个}_{2}^{我}}}{\sum_{我} \frac{{k个}_{- 2}^{我} {k个}_{1}^{我}}{{k个}_{1}^{我} + {k个}_{2}^{我}} + {k个}_{三}})

(9)

根据这些考虑，总共我个人电脑基站(图1b），酶动力学参数

{K（K）}_{M（M）}

（11）和

{V（V）}_{米 一 x个}

（10）采用比不含PCBS的动力学方案更复杂的形式(图1a） ●●●●。这与获得的方程式类似(附录A.2)用于两个PCBS。

{V（V）}_{米 一 x个} = {k个}_{三} \frac{问}{\sum_{我} 问_{我} + 问} {E类}_{T型}

(10)

{K（K）}_{M（M）} = \frac{1}{\sum_{我} 问_{我} + 问}

(11)

如果我们考虑动力学常数

{k个}_{j个}^{我} > 0

待确定的因素问和

问_{我}

随着PCBS的数量增加。根据(10)和(11)，两者

{V（V）}_{米 一 x个}

和

{K（K）}_{M（M）}

随着PCBS的数量逐渐减少，达到由动力学常数值确定的最小值。然而

{K（K）}_{M（M）}

比

{V（V）}_{米 一 x个}

因为后者通过问分子处的因子(10). 值得注意的是，对于此模型底物特异性，由比率决定

{V（V）}_{米 一 x个} / {K（K）}_{M（M）} = {k个}_{三} {E类}_{T型} 问

（使用(10)和(11))Q随PCBS数量增加而增加。因为它与问然后我们再次发现，对于含有多个PCBS的酶，实验测定的动力学参数将低于没有PCBS的简单模型预测的动力学参数。

对于具有

我 = 三

PCBS，酶的动力学参数由以下表达式确定：

{v（v）}_{米 一 x个} = {k个}_{三} \frac{问}{问 + 问_{1} + 问_{2} + 问_{三}} {E类}_{T型}

(12)

{K（K）}_{M（M）} = \frac{1}{问 + 问_{1} + 问_{2} + 问_{三}}

(13)

哪里：

问 = \frac{\frac{{k个}_{1}^{1} {k个}_{2}^{1}}{{k个}_{- 1}^{1} + {k个}_{2}^{1}} + \frac{{k个}_{1}^{2} {k个}_{2}^{2}}{{k个}_{- 1}^{2} + {k个}_{2}^{1}} + \frac{{k个}_{1}^{三} {k个}_{2}^{三}}{{k个}_{- 1}^{三} + {k个}_{2}^{三}}}{{k个}_{三} + \frac{{k个}_{- 2}^{1} {k个}_{- 1}^{1}}{{k个}_{- 1}^{1} + {k个}_{2}^{1}} + \frac{{k个}_{- 2}^{2} {k个}_{- 1}^{2}}{{k个}_{- 1}^{2} + {k个}_{2}^{2}} + \frac{{k个}_{- 2}^{三} {k个}_{- 1}^{三}}{{k个}_{- 1}^{三} + {k个}_{2}^{三}}}

(14)

和：

问_{1} = \frac{{k个}_{1}^{1}}{{k个}_{- 1}^{1} + {k个}_{2}^{1}} + \frac{{k个}_{- 2}^{1}}{{k个}_{- 1}^{1} + {k个}_{2}^{1}} 问

(15)

问_{2} = \frac{{k个}_{1}^{2}}{{k个}_{- 1}^{2} + {k个}_{2}^{2}} + \frac{{k个}_{- 2}^{2}}{{k个}_{- 1}^{2} + {k个}_{2}^{2}} 问

(16)

问_{三} = \frac{{k个}_{1}^{三}}{{k个}_{- 1}^{三} + {k个}_{2}^{三}} + \frac{{k个}_{- 2}^{三}}{{k个}_{- 1}^{三} + {k个}_{2}^{三}} 问

(17)

由于方程组的复杂性，采用数值模拟来评估PCBS数量与动力学参数之间的关系。

3.2. 基于PCBS的数值系统仿真

为了模拟具有各种PCBS的动力学系统，我们使用了Python软件包，该软件包用于模拟与各种底物、抑制剂和代谢途径的反应，以进行通量控制分析[15]. 在我们的研究中，我们使用该软件包的“通用反应”工具来获得不同PCBS数量的系统的动力学参数[16]如果具有相等结合动力学常数的等效PCBS

{k个}_{1}^{我}

和相等的离解常数

{k个}_{2}^{我}

已考虑。对于表1，我们认为相等的PCBS比催化位点更接近(

{k个}_{1}^{我} = {k个}_{2}^{我} > {k个}_{c（c） 一 t吨}^{我} ≫ {k个}_{- 1}^{我} = {k个}_{- 2}^{我}

)基底；另一方面，对于表2，我们认为PCBS的亲和力低于催化位点(

{k个}_{c（c） 一 t吨}^{我} > {k个}_{1}^{我} = {k个}_{2}^{我} » {k个}_{- 1}^{我} = {k个}_{- 2}^{我}

). 正如我们在比较蓝色和绿色曲线时所观察到的(图2)，对于

{k个}_{c（c） 一 t吨}

低于

{k个}_{1}

和

{k个}_{2}

（蓝线），与具有

{k个}_{c（c） 一 t吨}

高于

{k个}_{1}

和

{k个}_{2}

（绿线），其未达到所研究PCBS数量的饱和。关于动力学常数

{k个}_{1}

和

{k个}_{2}

，表示相等

{k个}_{c（c） 一 t吨}

(

{k个}_{c（c） 一 t吨} = 10

)，曲线b、c和d（橙色、绿色和红色线），仅系统具有

{k个}_{1} > {k个}_{2}

显示了催化效率的增加，主要是PCBSs=5，与其他条件（橙色和红色线）的曲线重叠。另一方面，对于较低的

{k个}_{c（c） 一 t吨}

(

{k个}_{c（c） 一 t吨}

=1）比

{k个}_{1}

和

{k个}_{2}

（紫色和棕色线条），

{k个}_{1} > {k个}_{2}

或

{k个}_{2} > {k个}_{1}

生成类似的曲线，在图中重叠，这表明对于这些动力学常数值，所研究的条件(

{k个}_{1} > {k个}_{2}

或

{k个}_{2} > {k个}_{1}

)不相关。

3.3. 催化效率对PCBS数的依赖性

采用数值模拟方法获得了含有和不含PCBS的一般酶催化反应的产物浓度。的值

{V（V）}_{米 一 x个}

,

{K（K）}_{M（M）}

在不同的动力学常数下得到了催化效率。如所示表1,表2和表3，在测试条件下，

{V（V）}_{米 一 x个}

随着PCBS数量的增加，迅速降低到最小值。对于

{K（K）}_{M（M）}

，观察到了相同的趋势，但相对于

{V（V）}_{米 一 x个}

.由于催化效率是

{K（K）}_{c（c） 一 t吨}

和

{K（K）}_{M（M）}

，该参数是底物选择性和酶比较的决定因素。我们的结果表明，对于所有研究的系统，该参数随着PCBS的数量增加而增加(图2). 根据研究条件观察

{k个}_{1}, {k个}_{2} \geq {k个}_{c（c） 一 t吨}

提高催化效率。如果

{k个}_{c（c） 一 t吨} \geq {k个}_{1}, {k个}_{2}

（b、c和d），效率的最大提高是通过

{k个}_{1} > {k个}_{2}

（c）；此外，如果

{k个}_{1} > {k个}_{2}

，系统显示相同的行为（b和d）。

4.讨论

酶是氨基酸聚合物，在温和的环境条件下可将化学反应加速数个数量级。MM的表达式很好地模拟了这种能力，其方程式来自一个简单的方案，该方案考虑了两个阶段：第一阶段是与催化位点结合，第二阶段是催化(图1a） ●●●●。为了求解这些动力学方程，我们在一个静止的状态下工作，初始速度使第二阶段是不可逆的。从这个表达式中，参数

{K（K）}_{M（M）}

和

{V（V）}_{米 一 x个}

从而可以表征酶的特性。然而，MM方程通过不考虑从初始结合位点到催化位点的底物路径简化了第一阶段。根据不同系统的分子模拟研究，底物可以通过几种可能的PCBS的不同途径进入催化位点。PCBS的数量或它们的亲和力可以决定酶的活性，这可以解释，例如，远离催化位点的一些突变对酶活性的影响。一些研究人员已经采用了这种方法，并认为远离催化位点的残基可能对设计具有改进性质的酶有意义[17]. 考虑到这种理论方法，根据图1b、获得了具有不同数量PCBS的单底物酶在MM型稳态条件下的表达。该模型建立了一个数字我PCBS通往催化位置的路线的可逆步骤，由其动力学常数决定。在求解方程（1）–（4）后，得到了MM方程的一个不可区分的表达式，其中动力学参数

{K（K）}_{M（M）}

和

{V（V）}_{米 一 x个}

由动力学常数的比值决定问和

问_{我}

（8）和（9）。考虑到这些表达式的复杂性，动力学参数邻域限制为

{k个}_{1}^{我} = {k个}_{2}^{我}

已被探索(附录A). 在这些限制条件下，催化效率随着PCBS的数量而增加。如果行为适用于更大的邻域，在模型可访问的参数范围内，则整个表达式的行为也可以相同。对于我PCBSs，动力学参数随因素而降低问和

问_{我}

在（8）和（9）中，随着PCBS数量的增加。根据得到的方程，实验

{K（K）}_{M（M）}

和

{V（V）}_{米 一 x个}

具有多个PCBS的单底物酶的参数与表观参数相对应。这方面虽然真实，但无法从实验数据中看出，因为模型产生了相同的矩形双曲线形状。分析以下两者之间的比率时

{k个}_{c（c） 一 t吨}

和

{K（K）}_{M（M）}

（催化效率）作为PCBS数量的函数，观察到它随PCBS数量增加而增加；PCBS的数量越多，催化效率越高。酶反应步骤缺乏实验测定的动力学常数，这使我们无法证实我们的一些预测。然而

{K（K）}_{M（M）}

和

{V（V）}_{米 一 x个}

已知远离催化位点不同区域的突变体参数，这些参数不影响三维结构[18]. 已经观察到酶的溶剂接触区的突变

β

-内酰胺酶，一种降解酶

β

-内酰胺类抗生素，不影响其活性，与生物体对抗生素的敏感性有关[19]. 然而，催化位点附近的一些突变可以通过使生物体对抗生素更敏感来影响活性。这种效应对于一些远离催化位点的突变体来说是明显的

β

-糖苷酶

{k个}_{c（c） 一 t吨}

和

{K（K）}_{M（M）}

参数[20]. 一般来说，对于这种酶，距离催化位点较远的10个突变修饰

{K（K）}_{M（M）}

和

{k个}_{c（c） 一 t吨}

从而降低催化效率。根据我们的模型，PCB中的突变会降低或降低这些位点对底物的亲和力，从而降低催化效率。为了探索参数空间的一些邻域，对动力学步骤进行了数值模拟，使我们能够使用pCBS动力学程序获得每个模拟步骤的系统状态和动力学参数[16]. 作为对每个条件的控制，使用MM方案计算系统中的动力学参数(图1a），获得与计算值相同的模拟值。考虑到决定底物/PCBS复合物形成的常数之间的不同关系，评估了六个动力学常数条件(

{k个}_{1}^{我}

)、决定基板从PCB到催化位置的通道的常数，以及直接决定产品形成的常数(

{k个}_{c（c） 一 t吨}

或

{K（K）}_{三}

). 对于所有系统，可以观察到KM和

{V（V）}_{米 一 x个}

随着PCBS数量的增加而减少(表1,表2和表3)，催化效率提高。对于某些条件，例如

{k个}_{c（c） 一 t吨}

低于

{k个}_{1}^{我}

和

{k个}_{2}^{我}

，催化效率的提高是相关的，这可以解释与催化位点没有直接联系的突变的影响，并可以决定催化效率。

5.结论

从所进行的研究中，获得了含有多个PCBS的动力学方案的MM-型表达式，其中动力学参数复杂地依赖于动力学常数。通过包括几个PBCS问和

问_{我}

获得了MM模型中不存在的，并且使KM和

{V（V）}_{米 一 x个}

随着PCBS数量的增加而减少。催化效率由结构因素决定，这些结构因素定义了底物到达催化位置必须遵循的（非随机）路径。这通过观察到催化效率随着PCBS的数量线性增加而明显，直到四个PCBS。由于问和

问_{我}

动力学过程可以确定，尽管常数的比率不同，但所研究的某些条件是等效的。根据该模型，进行体外研究或模拟以评估预测并引入与体外模型一致的动力学常数将是一件有趣的事情。

6.专利

本节不是强制性的，但如果本手稿中报告的工作产生了专利，则可以添加本节。

作者贡献

概念化、M.I.O.和D.G.S。；方法、M.P.和O.Y。；软件，O.Y。；验证、F.V.-I.、D.B.和J.M.P.-D。；形式分析，M.I.O.和W.T。；调查、O.Y.和M.I.O。；资源，书面原稿编制，M.I.O。；写作审查和编辑，J.M.P.-D.和F.G.-N.所有作者都阅读并同意手稿的出版版本。

基金

这项研究由基金会拨款3201013资助。

机构审查委员会声明

不适用。

知情同意书

不适用。

数据可用性声明

为本文生成的程序位于https://github.com/HumanOsv/pCBS_Kinetics网站（2023年10月13日访问）。

致谢

我们感谢生物信息学和综合生物学中心以及CenIA（Centro Nacional de Intelligencia Artificial）。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

缩写

本手稿中使用了以下缩写：

MM（毫米）	Michaelis–Menten公司
PCBS公司	催化前结合位点

附录A

附录A.1。带有两个PCBS的模型

本节包含底物酶结合的两个替代位点的酶机制动力学模型。考虑到具有两个PCBS的酶的数值模拟结果，我们假设底物秒交替结合到酶（e）的两个特定位点中的任何一个，形成两种酶中介体(

e（电子） 秒^{1}

和

e（电子） 秒^{2}

); 每个人都能转变成最后一个中间人(

e（电子） 秒^{*}

)通过元素动力学步骤形成产物（P）。关于拟议机制(图1b），我们推导了由以下公式给出的初始酶活性的动力学方程

{V（V）}_{0}

，定义为产品形成的初始速度

因此，反应速率由下式给出

{v（v）}_{0} = \frac{d日 [第页]}{d日 t吨} 对于 t吨 = 0

（A1）

这样就没有初始产物和总酶的浓度

({E类}_{T型})

远低于底物浓度

{[E类]}_{T型} ≪ S公司

由于总酶的保存，

[e（电子）] + [e（电子） 秒^{1}] + [e（电子） 秒^{2}] + [e（电子） 秒^{*}] = {E类}_{T型},

（A2）

与大多数酶动力学模型类似，将质量作用定律应用于所提出机制中的每个基本步骤（方程（A3）-（A6））：

{V（V）}_{0} = [E类 {S公司}^{*}] {K（K）}_{三}

（A3）

\frac{d日 [e（电子） 秒^{1}]}{d日 t吨} = [E类] [S公司] {k个}_{1}^{1} + [E类 {S公司}^{*}] {k个}_{- 2}^{1} - [E类 S公司] ({k个}_{- 1}^{1} + {k个}_{2}^{1})

（A4）

\frac{d日 [e（电子） 秒^{2}]}{d日 t吨} = [e（电子）] [秒] {k个}_{1}^{2} + [e（电子） 秒^{*}] {k个}_{- 2}^{2} - [e（电子） 秒^{1}] ({k个}_{- 1}^{2} + {k个}_{2}^{2})

（A5）

\frac{d日 [e（电子） 秒^{*}]}{d日 t吨} = [e（电子） 秒^{1}] {k个}_{2}^{2} + [E类 {S公司}^{2}] {k个}_{2}^{2} - [E类 {S公司}^{*}] ({k个}_{- 2}^{1} + {k个}_{- 2}^{2} + {k个}_{三})

（A6）

其中上标表示PCBS的数量，其中两个用于此开发。下标表示每个路径中包含的步骤数：在所示模型中催化位点之前两个(图1b） ●●●●。因此，常数“

{k个}_{2}^{1}

“是第一个PCBS从初始结合位点到催化位点的第二步的动力学常数。

此外，如结果所示，假设酶中间体的浓度为稳态条件：

\frac{d日 [e（电子） 秒^{1}]}{d日 t吨} = \frac{d日 [e（电子） 秒^{2}]}{d日 t吨} = \frac{d日 [e（电子） 秒^{*}]}{d日 t吨} \approx 0

（A7）

通过求解方程（A2）–（A7），得到酶的以下初始速度方程，对应于矩形双曲线图：

{v（v）}_{0} = \frac{{[E类]}_{T型} {k个}_{猫} [S公司]}{{K（K）}_{M（M）} + [秒]}

（A8）

{k个}_{猫} \equiv \frac{{k个}_{1}^{1} {k个}_{2}^{1} {k个}_{三} ({k个}_{- 1}^{2} + {k个}_{2}^{2}) + {k个}_{1}^{2} {k个}_{2}^{2} {k个}_{三} ({k个}_{- 1}^{1} + {k个}_{2}^{1})}{B类}

（A9）

{K（K）}_{M（M）} \equiv \frac{A类}{B类}

（A10）

A类 \equiv {k个}_{- 1}^{1} {k个}_{- 1}^{2} ({k个}_{- 2}^{1} + {k个}_{- 2}^{2} + {k个}_{三}) + {k个}_{- 1}^{2} {k个}_{2}^{1} ({k个}_{- 2}^{2} + {k个}_{三}) + {k个}_{- 1}^{1} {k个}_{2}^{2} ({k个}_{- 2}^{1} + {k个}_{三}) + {k个}_{2}^{1} {k个}_{2}^{2} {k个}_{三}

（A11）

A类 \equiv {k个}_{- 1}^{1} {k个}_{- 1}^{2} ({k个}_{- 2}^{1} + {k个}_{- 2}^{2} + {k个}_{三}) + {k个}_{- 1}^{2} {k个}_{2}^{1} ({k个}_{- 2}^{2} + {k个}_{三}) + {k个}_{- 1}^{1} {k个}_{2}^{2} ({k个}_{- 2}^{1} + {k个}_{三}) + {k个}_{2}^{1} {k个}_{2}^{2} {k个}_{三}

（A12）

B类 \equiv ({B类}_{1} + {B类}_{2})

（A13）

{B类}_{1} \equiv ({k个}_{- 1}^{1} {k个}_{1}^{2} + {k个}_{1}^{1} {k个}_{- 1}^{2}) ({k个}_{- 2}^{1} + {k个}_{- 2}^{2} + {k个}_{三}) + {k个}_{1}^{1} {k个}_{2}^{2} ({k个}_{- 2}^{1} + {k个}_{三})

（A14）

{B类}_{2} \equiv {k个}_{1}^{2} {k个}_{2}^{1} ({k个}_{- 2}^{2} + {k个}_{三}) + {k个}_{1}^{1} {k个}_{2}^{1} ({k个}_{- 1}^{2} + {k个}_{- 2}^{2} + {k个}_{2}^{2}) + {k个}_{1}^{2} {k个}_{2}^{2} ({k个}_{- 1}^{1} + {k个}_{- 2}^{1} + {k个}_{2}^{1})

（A15）

方程式（A8）与描述众所周知的迈克利斯-芒滕机制动力学的方程式无法区分，只是动力学参数的定义更为复杂

{k个}_{c（c） 一 t吨}

{K（K）}_{M（M）}

在方程式（A9）和（A10）中。

附录A.2。具有n个PCBS的约束模型 ${k个}_{1}^{1} = {k个}_{1}^{2}$ 和 ${k个}_{- 2}^{1} = {k个}_{2}^{2}$

本节介绍了具有n个替代等效底物酶结合位点的扩展酶机制的动力学模型。

在以下情况下

{k个}_{1}^{1} = {k个}_{1}^{2}

和

{k个}_{- 2}^{1} = {k个}_{2}^{2}

，中的动力学机制图1a可以扩展到以下机构图1b、带有n个酶底物复合物

{e（电子） 秒}^{(我)}

(

我 = 1, 2, n个

)和不依赖于我在这种情况下，假设

{[E类]}_{T型} ≪ S公司

酶中介体的稳态条件，

{V（V）}_{0}

（方程式（A1））计算如下：

{V（V）}_{0} = [E类 {S公司}^{*}] {K（K）}_{三}

（A16）

\frac{d日 [e（电子） 秒^{我}]}{d日 t吨} = [e（电子）] [秒] {k个}_{1}^{我} + [e（电子） 秒^{*}] {k个}_{- 2}^{我} - [e（电子） 秒] ({k个}_{- 1}^{我} + {k个}_{2}^{我})

（A17）

\frac{d日 [锿^{*}]}{d日 t吨} = {k个}_{2} \sum_{我 = 1}^{n个} [锿^{我}] - [锿^{*}] (n个 {k个}_{- 2}^{我} + {k个}_{三})

（A18）

\frac{d日 [{e（电子） 秒}^{我}]}{d日 t吨} = d日 [e（电子） 秒^{*}] d日 t吨 \approx 0

（A19）

在稳态条件下：

\frac{d日 [{e（电子） 秒}^{(我)}]}{d日 t吨} = \frac{d日 [e（电子） 秒^{*}]}{d日 t吨} \approx 0

（A20）

保存总酶：

{[E类]}_{T型} = e（电子） + e（电子） 秒^{*} + \sum_{我 = 1}^{n个} e（电子） 秒^{我}

（A21）

定义

[e（电子） 秒]

作为：

[e（电子） 秒] \equiv \sum_{我 = 1}^{n个} [e（电子） 秒^{我}]

（A22）

根据方程式（A16）–（A22），得出以下方程组：

\frac{d日 [e（电子） 秒]}{d日 t吨} = [e（电子）] [秒] n个 {k个}_{1} + [{e（电子） 秒}^{*}] n个 {k个}_{- 2} - [E类 S公司] ({k个}_{- 1} + {k个}_{2})

（A23）

\frac{d日 [e（电子） 秒]}{d日 t吨} = \frac{d日 [e（电子） 秒^{*}]}{d日 t吨} \approx 0

（A24）

\frac{d日 [e（电子） 秒^{*}]}{d日 t吨} = {k个}_{2} [e（电子） 秒] - [e（电子） 秒] \cdot n个 \cdot {k个}_{- 2} + {k个}_{三}

（A25）

{[E类]}_{T型} = e（电子） + e（电子） 秒^{*} + e（电子） 秒

（A26）

{[E类]}_{T型} = e（电子） + e（电子） 秒^{*} + e（电子） 秒

（A27）

来自（A1）和（A23）–（A26），

{V（V）}_{0}

如（A8）所示，通过以下动力学参数获得：

{k个}_{猫} = \frac{{k个}_{三}}{1 + \frac{n个 {k个}_{- 2} + {k个}_{三}}{{k个}_{2}}}

（A28）

{K（K）}_{M（M）} = \frac{{n个 k个}_{- 2} {k个}_{- 1} + {k个}_{三} ({k个}_{- 1} + {k个}_{2})}{{n个 k个}_{1} ({n个 k个}_{- 2} + {k个}_{2} + {k个}_{三})}

（A29）

注意，（A23）-（A27）的方程组与从中的动力学机制推导出的方程组相同图1a.因此图1b具有相同的动力学。此外，对于

n个 = 2

在（A28）和（A29）中，获得的动力学参数与在附录A对于

{{k个}_{- 1}^{1} = k个}_{1}^{2}

和

{{k个}_{- 2}^{1} = k个}_{2}^{2}

英寸（A9）和（A10）。

最后，假设

{k个}_{2} ≫ {n个 k个}_{- 2} + {k个}_{1} + {k个}_{三}

在（A28）和（A29）中，我们有

{k个}_{猫} \approx {k个}_{三}

（A30）

和

{K（K）}_{M（M）} \approx \frac{{k个}_{三}}{{n个 k个}_{1}}

（A31）

附录A.3。使用的算法

图A1。用于各种PCBS酶模拟的算法示意图。这个用Python编写的程序是通用的，可以用来表示基于微分方程的不同反应方案，使用质量作用定律递归地确定每个物种的浓度。

工具书类

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图1。动力学方案：(一)显示了不考虑PCBS和(b条)显示了包含PCBS的动力学方案。K是一个基本步骤的动力学常数，其中正下标表示产品形成步骤，负下标表示反向过程。对于方案(b条)，其中包括n个PCBS，上标使每个PCBS个性化。

图2。催化效率随PCBS数量的增加而增加。对MM模型的6个动力学常数条件（第一点i=0）和i=1、2、3、4、5和5 PCBS进行了数值模拟。对于每个模拟，催化效率(

\frac{{k个}_{c（c） 一 t吨}}{{K（K）}_{M（M）}}

)绘制为PCBS数量的函数。由于曲线b和d以及e和f重叠，因此可以用分段线观察到这些曲线。

图2。催化效率随PCBS数量的增加而增加。对MM模型的6个动力学常数条件（第一点i=0）和i=1、2、3、4、5和5 PCBS进行了数值模拟。对于每个模拟，催化效率(

\frac{{k个}_{c（c） 一 t吨}}{{K（K）}_{M（M）}}

)绘制为PCBS数量的函数。由于曲线b和d以及e和f重叠，因此可以用分段线观察到这些曲线。

表1。酶动力学的数值模拟

{{k个}_{2}^{我} = k个}_{1}^{我} > {k个}_{c（c） 一 t吨}

.对于模拟，底物结合的动力学常数

{k个}_{1}^{我} = 10

，离解常数

{k个}_{- 1}^{我} = 0.01

和催化常数

{k个}_{c（c） 一 t吨} = 2

酶浓度为0.0002 mM，底物浓度为0.1、0.2、0.5、5、10、100 mM。为了进行动力学分析，取每个底物浓度的前10个点的斜率，从倒数加倍中获得动力学参数。

表1。酶动力学的数值模拟

{{k个}_{2}^{我} = k个}_{1}^{我} > {k个}_{c（c） 一 t吨}

.对于模拟，底物结合的动力学常数

{k个}_{1}^{我} = 10

，离解常数

{k个}_{- 1}^{我} = 0.01

和催化常数

{k个}_{c（c） 一 t吨} = 2

酶浓度为0.0002 mM，底物浓度为0.1、0.2、0.5、5、10、100 mM。为了分析动力学，取每个底物浓度的前10个点的斜率，从倒数加倍中获得动力学参数。

动力学参数	Michaelis–Menten公司*	$我 = 1$	$我 = 2$	$我 = 三$	$我 = 4$	$我 = 5$
${V（V）}_{米一 x个}$	$4 \times 10^{- 4}$	$3.31 \times 10^{- 4}$	$3.31 \times 10^{- 4}$	$3.31 \times 10^{- 4}$	$3.330 \times 10^{- 4}$	$3.30 \times 10^{- 4}$
${K（K）}_{M（M）}$	$20.1 \times 10^{- 2}$	$17.1 \times 10^{- 2}$	$8.64 \times 10^{- 2}$	$5.76 \times 10^{- 2}$	$4.32 \times 10^{- 2}$	$3.45 \times 10^{- 2}$
催化效率	$19.2 \times 10^{- 4}$	$19.2 \times 10^{- 4}$	$38.3 \times 10^{- 4}$	$57.4 \times 10^{- 4}$	$76.5 \times 10^{- 4}$	$95.6 \times 10^{- 4}$

*无PCBS的数值模拟。

表2。酶动力学的数值模拟

{{k个}_{c（c） 一 t吨} > k个}_{1}^{我} = {k个}_{2}^{我}

.对于模拟，底物结合的动力学常数

{k个}_{1}^{我} = {k个}_{2}^{我} = 2

，离解常数

{k个}_{- 1}^{我} = 0.01

和催化常数

{k个}_{c（c） 一 t吨} = 10

酶浓度为0.0002 mM，底物浓度为0.1、0.2、0.5、5、10、100 mM。为了进行动力学分析，取每个底物浓度的前10个点的斜率，从倒数加倍中获得动力学参数。

表2。酶动力学的数值模拟

{{k个}_{c（c） 一 t吨} > k个}_{1}^{我} = {k个}_{2}^{我}

.对于模拟，底物结合的动力学常数

{k个}_{1}^{我} = {k个}_{2}^{我} = 2

，离解常数

{k个}_{- 1}^{我} = 0.01

和催化常数

{k个}_{c（c） 一 t吨} = 10

酶浓度为0.0002 mM，底物浓度为0.1、0.2、0.5、5、10、100 mM。为了进行动力学分析，取每个底物浓度的前10个点的斜率，从倒数加倍中获得动力学参数。

动力学参数	Michaelis–Menten公司*	$我 = 1$	$我 = 2$	$我 = 三$	$我 = 4$	$我 = 5$
${V（V）}_{米一 x个}$	$2 \times 10^{- 三}$	$3.32 \times 10^{- 4}$	$3.32 \times 10^{- 4}$	$3.31 \times 10^{- 4}$	$3.31 \times 10^{- 4}$	$3.31 \times 10^{- 4}$
${K（K）}_{M（M）}$	$505 \times 10^{- 2}$	$86.6 \times 10^{- 2}$	$43.3 \times 10^{- 2}$	$28.8 \times 10^{- 2}$	$21.6 \times 10^{- 2}$	$17.3 \times 10^{- 2}$
催化效率	$3.97 \times 10^{- 4}$	$3.83 \times 10^{- 4}$	$7.67 \times 10^{- 4}$	$11.5 \times 10^{- 4}$	$15.3 \times 10^{- 4}$	$19.1 \times 10^{- 4}$

*无PCBS的数值模拟。

表3。酶动力学的数值模拟

{{k个}_{c（c） 一 t吨} > k个}_{1}^{我} > {k个}_{2}^{我}

.对于模拟，底物结合的动力学常数

{k个}_{1}^{我} = 6

,

{k个}_{2}^{我} = 2

，离解常数

{k个}_{- 1}^{我} = 0.01

和催化常数

{k个}_{c（c） 一 t吨}^{我} = 10

酶浓度为0.0002 mM，底物浓度为0.1、0.2、0.5、5、10、100 mM。为了进行动力学分析，取每个底物浓度的前10个点的斜率，从倒数加倍中获得动力学参数。

表3。酶动力学的数值模拟

{{k个}_{c（c） 一 t吨} > k个}_{1}^{我} > {k个}_{2}^{我}

.对于模拟，底物结合的动力学常数

{k个}_{1}^{我} = 6

,

{k个}_{2}^{我} = 2

，离解常数

{k个}_{- 1}^{我} = 0.01

和催化常数

{k个}_{c（c） 一 t吨}^{我} = 10

酶浓度为0.0002 mM，底物浓度为0.1、0.2、0.5、5、10、100 mM。为了进行动力学分析，取每个底物浓度的前10个点的斜率，从倒数加倍中获得动力学参数。

动力学参数	Michaelis–Menten公司*	$我 = 1$	$我 = 2$	$我 = 三$	$我 = 4$	$我 = 5$
${V（V）}_{米一 x个}$	$20 \times 10^{- 4}$	$3.32 \times 10^{- 4}$	$3.31 \times 10^{- 4}$	$3.31 \times 10^{- 4}$	$3.31 \times 10^{- 4}$	$3.31 \times 10^{- 4}$
${K（K）}_{M（M）}$	$505 \times 10^{- 2}$	$28.9 \times 10^{- 2}$	$14.4 \times 10^{- 2}$	$9.63 \times 10^{- 2}$	$7.22 \times 10^{- 2}$	$3.46 \times 10^{- 2}$
催化效率	$3.97 \times 10^{- 4}$	$11.5 \times 10^{- 4}$	$23 \times 10^{- 4}$	$34 \times 10^{- 4}$	$46 \times 10^{- 4}$	$96.6 \times 10^{- 4}$

*无PCBS的数值模拟。

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MDPI和ACS样式

奥索里奥，M.I。；Petrache，M。；萨利纳斯，D.G。；瓦伦祖埃拉·巴西塔，F。；González-Nilo，F。；蒂兹纳多，W。；佩雷斯·多诺索，J.M。；布拉沃，D。；亚涅斯，O。催化位点上游具有多个结合位点的酶的稳态动力学。对称 2023,15, 2176.https://doi.org/10.3390/sym15122176

AMA风格

Osorio MI、Petrache M、Salinas DG、Valenzuela-Ibaceta F、González-Nilo F、Tiznado W、Pérez-Donoso JM、Bravo D、Yánez O。催化位点上游具有多个结合位点的酶的稳态动力学。对称. 2023; 15(12):2176.https://doi.org/10.3390/sym15122176

芝加哥/图拉宾风格

奥索里奥（Osorio）、曼努埃尔一世（Manuel I.）、米尔恰·彼得雷奇（Mircea Petrache）、迪诺·萨利纳斯（Dino G.Salinas）、菲利佩·瓦伦苏埃拉·巴西塔（Felipe Valenzuela-Ibaceta）、费尔南多·冈萨雷斯-尼洛（Fernando González-Nilo）、威廉·蒂兹纳多（William。2023.“催化位点上游具有多个结合位点的酶的稳态动力学”对称第15页，第12页：2176。https://doi.org/10.3390/sym15122176

请注意，从2016年第一期开始，该杂志使用文章编号而不是页码。请参阅更多详细信息在这里.

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催化位点上游多结合位点酶的稳态动力学

摘要

1.简介

2.材料和方法

3.结果

3.1. 具有几种PCBS的酶的稳态动力学

3.2. 基于PCBS的数值系统仿真

3.3. 催化效率对PCBS数的依赖性

4.讨论

5.结论

6.专利

作者贡献

基金

机构审查委员会声明

知情同意书

数据可用性声明

致谢

利益冲突

缩写

附录A

附录A.1。带有两个PCBS的模型

附录A.2。具有n个PCBS的约束模型 ${k个}_{1}^{1} = {k个}_{1}^{2}$ 和 ${k个}_{- 2}^{1} = {k个}_{2}^{2}$

附录A.3。使用的算法

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催化位点上游多结合位点酶的稳态动力学

摘要

1.简介

2.材料和方法

3.结果

3.1. 具有几种PCBS的酶的稳态动力学

3.2. 基于PCBS的数值系统仿真

3.3. 催化效率对PCBS数的依赖性

4.讨论

5.结论

6.专利

作者贡献

基金

机构审查委员会声明

知情同意书

数据可用性声明

致谢

利益冲突

缩写

附录A

附录A.1。带有两个PCBS的模型

附录A.2。具有n个PCBS的约束模型 k个 1 1 = k个 1 2 和 k个 − 2 1 = k个 2 2

附录A.3。使用的算法

工具书类

分享和引用

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附录A.2。具有n个PCBS的约束模型 ${k个}_{1}^{1} = {k个}_{1}^{2}$ 和 ${k个}_{- 2}^{1} = {k个}_{2}^{2}$