1.简介
创伤性脑损伤（TBI）是指由外力引起的脑功能障碍，通常是由于头部受到打击或突然移动，通常发生在摔倒或交通事故之后[1]. 疾病预防控制中心（CDC）认为TBI是全球残疾的重要原因之一，每年给医疗系统带来高额成本[2]. TBI也代表了至少一半的创伤相关死亡[三]据报道，重度TBI患者的死亡率为37%[4]. 急性期神经损伤的临床识别延迟导致TBI患者的死亡率升高[5]. 这种延迟通常与格拉斯哥昏迷量表（GCS）的主观和定性性质有关，该量表通常被用作TBI严重程度的分类策略。除GCS外，其他有创和无创神经监测技术也有助于建立医疗决策标准。这些技术的使用需要专业知识和先进的医疗技能，意味着潜在的有害电离辐射，并且对医疗系统的成本要求很高，这限制了它们在许多资源有限的环境中的可用性，例如在中低收入国家，在许多情况下，临床检查是，唯一可用的神经监测工具[6]. 上述局限性推动了血液生物标记物的研究，以改善所有严重程度TBI的预后[7]. 在研究的TBI生物标记物中，S100B蛋白可能是研究最广泛的。S100B是一种钙结合二聚体蛋白（MW:21kDa），主要在星形胶质细胞中表达，并在生理条件下在人类脑脊液和血清/血浆中以非常低的水平发现。先前的研究表明，TBI后，S100B通过血脑屏障（BBB）从受损的神经细胞释放到血流中，而血脑屏障在头部原发性损伤后可能会被破坏[8]. 在临床背景下，这些生物标记物的测量需要一种易于使用、易于获得、成本低、响应时间快的技术，如便携式和定点生物传感器。相比之下，目前TBI相关生物标记物的量化通常很困难，因为标准免疫分析耗时，需要广泛的专业知识和仪器，并且通常成本较高[9]. 表1总结了过去12年中针对S100B测试的主要生物传感器。这些研究中使用的检测范围在pg/mL到ng/mL的浓度之间变化。这是为了生物传感器的不同临床应用，因为S100B已被研究为阿尔茨海默病等其他疾病的中枢神经系统损伤标志物[10,11,12]，冲程[13]、脊椎创伤[14]和脓毒症相关脑病[15]因此，其使用不限于TBI。 从这个意义上说，S100B检测范围的临床意义取决于脑损伤的类型和严重程度[16]. S100B的各种截止值已被提出用于识别脑损伤[17]. 因此，临界水平为100 pg/mL[18]已在轻度TBI中使用，以消除计算机断层扫描（CT）中出现的颅内出血，据报道，接近30 pg/mL的值是血脑屏障通透性的指标，即使没有相关症状[19]. 同样，中度至重度TBI患者的血清/血浆S100B水平较高，以ng/mL为序，与颅内高压、神经系统恶化和治疗反应不良相关[16]. 电化学生物传感器是检测生物标志物S100B最常用的系统之一，主要通过法拉第过程监测电荷转移电阻（Rct）。目前，大型宏电极通常与单层膜一起用于制作生物传感器。然而，各种研究表明交叉指状电极（IDE）的使用[20,21,22,23]与典型电极相比，它们可能具有一些优点，例如样品体积小、形成双层的电活性离子浓度低、欧姆降低、快速建立稳态、快速反应动力学、提高信噪比和更容易的清洁程序。IDE消除了对参考电极的需要，并提供了获得稳态电流响应的简单方法，特别是与三电极和四电极设置相比，减少了对高电源仪表的需要。此外，IDE更容易集成到完整的检测系统中，以快速执行并行电化学分析。值得注意的是，基于IDE的生物传感器还可以提供良好的法拉第-电容电流比，从而提高生物传感器的信噪比、更高的灵敏度和更低的检测限，从而增强对抗体抗原或适体靶结合事件的检测[24]. 最后，可回收的IDE能够在分析物结合之前和之后以及在表面修饰的每个步骤上对相同的电极系统进行电化学检测。 在这项工作中，我们开发了两种检测和量化S100B的策略，S100B是一种已知的用于TBI预后测试的生物标记物，在标准溶液和加标血浆样品中都是如此。本工作中制造的生物传感器基于零长度交联方法，使用EDC-NHS在半胱胺自组装单层（SAM）上进行交联，以通过羰基抗体键将抗S100B单克隆抗体有效固定在金电极（AuE）和金交指电极（AuIDEs）上。
本文重点研究了在双电极系统中使用可回收AuIDEs检测缓冲溶液和加标人血浆样品中S100B蛋白时，基于Au-Cysteamine的生物传感器在典型三电极系统中的性能改进。
2.材料和方法
2.1. 电极和试剂
沉积在玻璃基板电极（AuEs）上的金（Au）是在国家同步实验室设施（巴西坎皮纳斯）光刻制作的，并由圣卡洛斯物理研究所（IFSC）-USP（巴西）的GNano研究小组慷慨协助。薄膜金交指电极（AuIDEs）和180对交指金电极（5/5µm，电极/间隙）由西班牙Micrux Technologies公司提供。
乙醇、丙酮、1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、磷酸盐缓冲液（PBS）、30%过氧化氢、30%氢氧化铵和小于10 um的亚铁氰化钾（III）粉末99%（702587）均来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。氢氧化钾（KOH）和大于98.0%（30070）的半胱胺购自Sigma-Aldrich（巴西圣保罗）。氯化钾（P217500）ACS 99.0 a 100%从Fisher（美国新罕布什尔州汉普顿）获得。使用的所有试剂均为分析级试剂。去离子水（MiliQ®（位于法国摩尔谢姆的默克-密理博公司）负责制备所有溶液。重组抗S100β抗体[EP1576Y]-星形胶质细胞标记物、重组人S100β蛋白（ab55570）和重组人nNOS（神经元）蛋白（ab159005）购自Abcam（马萨诸塞州剑桥市，美国）。
2.2. 生物传感器结构
对于AuEs功能化(图1)首先，使用连续声波仪用丙酮、去离子水、2%氢氧化钾乙醇、乙醇和去离子水彻底清洗。接下来，使用30μL 0.5 M半胱胺水溶液通过滴注在每个WE上，将半胱氨酸-SAM培养到干净的Au WE上。然后在室温下培养4小时（RT）。AuEs用去离子水充分冲洗，并用N2随后，通过在10 mM PBS（pH 7.4）中EDC（2 mM）和NHS（5 mM）的溶液中激活单克隆抗体S100B，使最终抗体浓度达到20 ug/mL，从而进行零长度交联功能化。然后，将50 uL的该溶液滴在WE上，并在RT下孵育4小时。然后用去离子水和N冲洗2干燥，在每个WE用15 uL 0.5%BSA在10 mM PBS中封闭AuEs，并在RT下干燥15分钟。最后用去离子水洗涤，然后用N干燥2已完成。 使用修改后的协议对抗S100B的AuIDEs进行功能化。按照RCA-1方案，首先将AuIDE浸入5:1:1的去离子水（27%NH）中进行彻底清洁4OH，30%H2哦2解决方案[31]5分钟，然后用去离子水充分冲洗并用N干燥2在亚铁氰化钾中进行了电化学阻抗谱（EIS）研究，以评估AuIDEs工作表面的清洁效率，这些工作表面再次用去离子水冲洗并用N2为了形成SAM，将PBS中的10微升0.5 M半胱胺滴在AuIDEs WE表面上，并在旋转机器上在RT下覆盖45分钟，以改善AuIDEs的相互作用。然后用去离子水冲洗AuIDE，并用N2为了激活抗S100B羧基，在PBS中制备0.5 M EDC-50 ug/mL抗S100B溶液，并在室温下每隔15分钟涡旋混合两小时。然后，将10微升EDC-抗S100B溶液滴在每个AuIDEs WE上，并在旋转机器上在RT下覆盖12小时，以将抗S100B偶联到Au-cysteamine SAM。然后将电极短暂浸入10 mM PBS溶液中三次，并用去离子水仔细冲洗。然后用亚铁氰化钾进行EIS测试，以表征功能化电极的电化学行为。随后，通过在每个AuIDE WE上滴注10微升0.5%BSA进行封闭，并在旋转机器上RT覆盖过夜。然后用去离子水彻底冲洗电极，并在亚铁氰化钾中进行EIS，以为每个AuIDE设置一个单一的参考Rct基线，随后将其用于同一电极上的抗原生物传感。 在这项工作中使用了小浓度的试剂。因此，为了避免它们不希望地固定在受体壁上，在功能化和进一步的S100B测试期间，使用低保留尖端和管来稀释、等分和滴注抗体和交联剂分子。
2.3。表面特征
通过原子力显微镜（纳米表面）对功能化金电极进行了表面表征。通过使用Nicolet i50 FT-IR（Thermo Scientific）的镜面反射FTIR（波数为400至4000 cm）对功能化WE进行化学表征−1.
2.4. 电化学表征和S100B测试性能
电化学阻抗谱用于表征生物传感器构建的每个步骤和S100B蛋白的定量。S100B试验是通过在AuEs（50 uL）和AuIDEs（10 uL）的WE表面上滴注少量样品并在室温下干燥来进行的。然后将AuEs和AuIDE连接到M204恒电位仪/恒流仪（Metrohm®由NOVA 2.11软件控制，用于电化学测量(图2). EIS是使用Autolab进行的®FRA32（Methrom Company，Herisau，Switzerland）模块，在0.1至10000 Hz的频率范围内测试AuE，在1至10000 Hz的频率范围内测试AuIDE。记录Rct的变化，以评估抗原-抗体结合15分钟后阻抗的变化。使用10 mM K进行电化学测量三[铁（CN）6]0.2 M KCl作为支持解决方案，40 uL用于AuE，10 uL用于auIDE。在与电极氧化还原探针相关的高频范围内观察到典型的半圆行为。 为了检测AuEs的分析物，对10 mM PBS中的S100B样品和10至1000 pg/mL范围内的加标人血浆进行了测试。对于AuIDEs，仅评估了S100B加标的10至1000 pg/mL人血浆样品。在所有情况下，在抗原-抗体结合15分钟后用去离子水冲洗WE，并在RT处覆盖。
2.5. 缓冲液和加标人血浆样品的制备
通过在10 mM PBS（pH 7.4）中连续稀释储备抗S100B抗体制备缓冲样品，以获得10、31、100、316和1000 pg/mL的等分样品，然后在低保留管中再次悬浮并冷冻至−20°C。人类全血是在北大（哥伦比亚巴兰基拉）第167号伦理委员会事先同意的情况下，从健康捐赠者的静脉穿刺中获得的。全血，收集至凝胶和EDTA K2管（Improvacuter®722350202），然后在10000 g下离心30分钟，以去除分子量超过30 kDa的蛋白质。通过移液管提取人血浆，并在低保留管中进行校准。将每个等分样品加入相应量的S100B蛋白，以在缓冲样品中获得相同的浓度，并在再次悬浮后，将其储存在−20°C下。在试验前15分钟，将每个缓冲液和加标的人血浆样品解冻，然后重新悬浮，并将其滴落在WE上。
2.6. 实验设计（DOE）
进行了单因素实验设计，以评估S100B浓度对从每个生物传感器的EIS获得的电荷转移电阻（Rct）的影响。首先进行了初步试验，以确定每个传感器平台的自然变化，从中进行清洁(图S1)并对每个平台的功能化协议进行了有效优化。 生物标志物S100B在对数标度的五个水平下进行测试，使用具有临床实用价值的浓度：10 pg/mL（log10=1），100 pg/mL（对数10=2）和1000 pg/mL（对数10=3），根据对数刻度，两个中间点：31 pg/mL（log10=1.5）和316 pg/mL（对数10= 2.5). 选择电荷转移电阻的变化（ΔRct）作为响应变量，其定义为从S100B测试用EIS获得的Rct（tRct）与从抗S100B/BSA功能化WE上运行的EIS得到的基本Rct（bRct）之间的差异。
由于本工作中使用的AuE不可重复使用，因此AuE的bRct显示为一组Cys/anti-S100B/BSA功能化AuE的独立测量值的平均值。同时，将AuIDE与其bRct直接进行比较，因为它们可以用于连续测量而不会导致信号恶化。
样本大小(n个=5）使用置信区间估计方法和系统方差（S2)根据一级因子的先导试验进行估算（AuEs的[S100B]=100 pg/mL，AuIDEs的[S100 B]=31 pg/mL），1型误差α等于0.05(表2). AuEs和AuIDES的有意义差异（d），即要检测的临床相关效应的大小，分别为1500Ω和1300Ω。随着自由度（DOF）（重复次数）的增加，使用操作特征曲线，以获得II型错误概率，直到给定样本量的统计幂大于或等于0.9。 2.7. 统计分析
使用RStudio和Statgraphics Centurion 18进行统计分析。最初，RStudio用于评估残差的正态性、同方差性和独立性的假设，以图形和分析的方式建立统计有效性。然后，当需要实现实验残留物的正态分布时，应用对数变换(图S2–S4). 我们使用单向Welch-ANOVA来检查各组之间的差异，然后使用Games-Howell作为事后测试(表S1–S3). 最后，使用Statgraphics Centurion 18开发了所有数据集的回归模型。 所有统计测试均被认为具有显著性第页-值小于0.05。还创建了等高线图，以分析沿实验区域的响应行为。然后，进行线性回归模型和缺乏拟合检验，以确定模型对每个响应变量的充分性。考虑到全局模型显著性、系数显著性和残差结构分析，建立了模型适用性(图S5-S7和表S4-S6). 3.结果
我们开发了一个简单的平台来量化S100B，该平台基于单克隆抗体抗S100B与AuEs和AuIDEs的EDC-NHS的零长度交联功能化，并用半胱胺SAM修饰羰基抗体键。当测试每种类型的电极时，S100B定量的电化学响应表现出相似的性能，显示出灵敏度和再现性的差异。
3.1. 表面特征
3.1.1. 镜面反射FTIR分析
FTIR光谱AuEs/Cys（红色）和AuE/Cys/抗S100B（蓝色）显示在图3a.小带~1020厘米−1在AuEs/Cys中，这归因于半胱胺的NH2弯曲，并且在1259厘米处有条带−1是由于半胱胺中的C=N和C-N键。在AuE/Cys/抗S100B的FTIR光谱中可以看到抗体成功固定在SAM上。1700厘米处的酰胺I带−1可以看到，主要由C=O拉伸振动和许多重叠带组成，这些重叠带代表不同的结构元素，如a螺旋和b片、扭曲和无特定顺序的不规则结构[32]. 1550–1640 cm之间的酰胺II带也证明了抗体固定−1，主要包括N–H弯曲[33]. 3.1.2. 原子力显微镜（AFM）形貌表征
对于每个功能化步骤，使用Gwyddion 2.55软件进行原子力显微镜（AFM）表征，用于图像编辑和表面形貌数据分析。在（a）AuE和（b）AuE/Cys和（c）AuE/Cys/anti-S100B表面上拍摄的AFM图像如所示图4RMS粗糙度（Sq）随着表面的改性而增加，从裸露AuEs中的901pm增加到抗S100B功能化电极中的2.5nm。抗体固定化还可以通过中间峰高从4.3 nm增加到20.4 nm来证明(表3). 3.2. 电化学表征
还通过EIS评估了AuEs和IDE工作电极表面的界面特性。由于抗S100B抗体和生长的生物膜的附加分子组分不具有高导电性，因此空间位阻阻碍了K的电子传递三[铁（CN）6]三负极/2负极如图所示，在AuS和AuIDE中，Rct的增加与生物膜逐层生长成正比图5a、 b）。当使用0.5%BSA封闭抗S100B功能化表面时，Rct也会增加，因此该值最终用作S100B后续测量的基础Rct。这些数据与FTIR和AFM的表面表征结果一致，证实了抗体的正确固定。对于AuEs，通过计算五次重复实验的平均值，bRct估计为1685.7±100.8Ω。对于AuIDE，使用每个电极的单独bRct作为S100B测试的参考。 3.3. S100B测量
在10mM K存在下从EIS光谱中收集的数据三[铁（CN）6]用于S100B定量的氧化还原探针(附录A 表A1)评估结果表明，三种条件（AuEs-PBS、AuEs-plasma和AuIDEs-plasma）的方差均不均匀。在AuEs数据集中观察到响应变量（ΔRct）的非正态分布；因此，对AuEs数据集应用了对数转换。 对于AuEs-PBS实验，方差分析（Welch-ANOVA）和事后分析表明，各测试浓度之间的信号差异具有统计学意义(第页< 0.05). 此外，图6b显示了在条件1（AuEs-PBS）下在10至316 pg/mL范围内定量S100B所获得的EIS光谱。随着S100B浓度的连续增加，在对数ΔRct中始终观察到成比例的增加。为了评估这些生物传感器在医疗诊断中的未来可能应用，S100B的EIS测量也在条件2中进行，即使用AuEs（AuEs-plasma）在加标的人类血浆样品中进行测试，如图6c、 d.对于AuEs-plasma测试，基本信号对应于未添加血浆的Au/Cys/抗S100B/BSA电极，而阴性对照指未添加S100B的血浆，如图6d.结果与AuEs-PBS中进行的EIS运行记录的结果非常相似。条件3（AuIDEs等离子体）下S100B测量的EIS光谱显示在图7与测试检测范围的ΔRct箱线图一起，还显示了随着[S100B]的增加，ΔRct的预期行为增加。 通过在每种条件下进行五次独立的[S100B]=100 pg/mL的测量来测试生物传感器的再现性。电极的响应（ΔRct）是一致的，AuEs-PBS的相对标准偏差（RSD）为12.6%，AuEs-plasma为11.4%，AuIDEs血浆为23.32%，表明S100B检测在所有情况下都具有良好的再现性（参见表S10). 3.3.1. 校准曲线
在10至316 pg/mL范围内观察到ΔRct线性增加。较高浓度（1000 pg/mL）显示ΔRct显著增加(图S8)导致校准曲线斜率显著增加。 在线性检测范围为10至316 pg/mL的条件1和条件2下，生物传感器（y=ΔRct）对S100B浓度（x=Log[S100B]（pg/mL））的响应由回归方程y=2158.48+3102.75*×(n个=5）对于AuEs-PBS测试，y=1947.55+7917.07*×(n个=5）分别针对AuEs-plasma(图8a、 b）。校准曲线上的每个点代表五个独立测量的平均值，误差栏代表平均值的标准误差。在线性检测范围为10至316 pg/mL的AuIDEs血浆中的响应，不包括由于非线性行为而产生的1000 pg/mL，通过回归方程y=1593.48+49.1927*×(n个=5），其中x是实际比例的[S10B](图8c） ●●●●。 3.3.2. 检测极限
AuEs-plasma和IDEs-血浆条件下的检测限（LOD）分别以18 pg/mL和6 pg/mL计算。LOD由方程（1）确定，其中SD是每个特定测量的平均标准偏差，m是由校准曲线的斜率确定的校准灵敏度。 同样，EIS实验的结果比较了血浆中较低浓度样品（P1）和空白血浆（P0）中AuEs的响应，如所示图9，显示出统计上的显著差异(第页<0.01）。 3.3.3. 特异性和非特异性结合
图9a、 当使用抗S100B功能化AuEs和AuIDE针对不同的分析物进行EIS时，b显示了生物传感器的足够特异性。在本实验中，选择另一种已知的脑损伤生物标志物一氧化氮合酶（nNOS）作为测试分析物，将其加入血浆样品中，以获得1000 pg/mL的浓度。nNOS测试与基础信号之间未发现显著差异(第页=0.86（对于AuEs）。 为了评估血浆样品中分析物与BSA封闭表面的非特异性结合，我们使用了一种新制备的Au/Cys/BSA电极，以对抗本研究中先前研究的较高浓度S100B。使用AuEs添加S100B 1000 pg/mL后，BSA阻断表面的Rct与Rct之间没有显著的统计差异(第页= 0.59). AuIDE也观察到类似的结果(第页= 0.98).
3.3.4. 单频分析（SFA）
考虑到AuIDEs等离子体EIS实验的奈奎斯特图中观察到的半圆形行为，开发了单频分析以便于监测生物传感器的响应(表S7). 各频率下的电容由方程式（2）确定，其计算公式如下：哪里Z轴“对应于阻抗虚部的值（以欧姆为单位测量），该值是从EIS在频率下获得的每次试验运行。电容与基本值的变化定义为：哪里是BSA固定在电极表面后获得的基本电容，以及是在规定S100B浓度下每次测量获得的电容。图10显示了使用1到10000 Hz之间的特定频率，以对数增量，电容随定义的S100B浓度的百分比变化。在，我们看到随着S100B浓度的增加，电容不断增加。 单向方差分析（f）=31.6 Hz用于检查零（空白血浆）和1000 pg/mL之间S100B浓度电容变化平均值之间的显著差异。在方差分析之前，对正态性、同方差性和残差独立性的假设进行了评估(图S9和S10以及表S8). 电容变化的显著差异（f）=31.6 Hz，在每个S100B浓度之间(表S9). 因此，单个频率下的电容变化也可以用作AuIDE中S100B的量化测量。单频分析（SFA）再现性数据可在表S11. 4.讨论
本工作旨在用Au/Cys/抗S100B生物传感器制造和精确定量TBI相关血液标志物的更直接的方法，比较了两种不同电极形态的表面修饰的简单且可扩展的化学方法。采用EDC-NHS零长度交联方法，通过形成稳定的Au-S键，将单克隆抗体固定在金电极上的半胱胺自组装单层（SAM）上，成功开发了一个简单的通过羰基键固定单克隆抗体的平台。
总的来说，AuEs和AuIDEs构建的S100B生物传感器在稳定性、特异性和再现性方面均获得了可接受的全局性能。正如预期的那样，随着S100B浓度的增加，由于抗S100B和S100B蛋白的相互作用，以及S100B与缓冲液和支持液中负电荷氧化还原物种之间的静电斥力（PBS pH 7.4和10 mM K三[铁（CN）6]0.2M KCl）[28]，对于两个试验平台，在Rct中始终观察到S100B浓度的连续增量成比例增加。此外，我们报告了我们的生物传感器的高度特异性，通过测试不同的分析物时信号的无显著变化证明了这一点，很可能与单克隆抗体的使用有关。 关于AuEs-PBS和AuEs-plasma实验获得的信号量的观测增量，这可能与小血浆蛋白和其他血浆成分（主要是白蛋白）在电极表面的一些无BSA空间上的吸附有关。考虑到血浆中的白蛋白浓度（3.4–5.4%）大约是我们用于阻断的BSA浓度（0.5%）的十倍，与PBS相比，总的Rct预计会随着血浆而增加。
尽管使用两个电极的配置在临床相关范围内实现了分析物的测量，但AuIDEs的使用提供了各种优势，以促进生物传感器的进一步工业发展和商业化。首先，对于AuIDE而言，在功能化之前采用更简单的清洁方案（RCA-1）是可行的，避免了昂贵的试剂，并大大减少了所需的时间。其次，AuIDEs具有较小的平面检测面积，允许较小的细胞体积，从而减少生物传感器功能化所需的抗体数量，而不会对生物传感器性能产生负面影响。第三，AuEs中的基本信号必须事先使用一组重复测试的平均Rct进行估计。相反，对于AuIDE，可以在分析物检测之前为每个电极设置基线。这一事实可以提高分析的准确性，减少AuIDEs方法的方差和全局误差。注意，对于AuIDEs实验，校准模型不需要将[S100B]值转换为对数标度，以观察线性响应，就像AuEs一样。
与基于AuEs的生物传感器相比，AuIDE具有更高的灵敏度和更低的LOD。AuIDEs电极用于分析物检测的另一个优点在于，阻抗测量不需要参考电极，这使得进一步开发点-中心系统更加容易，运算放大器更少，等效电路模型更简单(图11). AuIDEs中Nyquist图的一致半圆行为，而不是使用AuEs中的三电极系统时Warburg电阻分量在低频下引起的典型斜率，也允许通过半圆拟合进行更直接的分析，以估计Rct，甚至执行单频分析（SFA）如前所述，无论是阻抗的实际分量还是双层电容（Cdl）。 虽然EIS通常需要2到4分钟，但SFA提供了更快的检测，因为只有一个频率点用于发现表面电容的变化。该属性可用于执行非法拉第电化学测量，其中样品蒸发通常与微流体一起出现
考虑到我们的实验是在单个供体的加标血浆样品中进行的，显然缺乏关于不同血浆成分如何影响生物传感器功能的信息。因此，有必要使用来自多个个体的样本进行进一步的研究，无论是否有其他伴随病理，以评估我们的结果中显示的高特异性的再现性。还需要进行进一步的研究，以确定影响测量的干扰因素，例如温度、湿度、电气噪声以及实验室以外的实际环境中的测试。同样，目前正在进行更详细的研究，以使用AuIDE实现非法拉第测量，因为使用氧化还原溶液可能会限制商业规模的扩展。
尽管许多其他研究报告了更广泛的检测范围和更低的LOD（参见表1)，我们的工作证明了在TBI患者的临床相关范围内有效检测S100B。上述数值，考虑到血浆浓度高于100 pg/mL的临界值[18]排除了CT中出血的存在，并且30 pg/mL周围的水平与血脑屏障破坏有关[19]. 此外，由于夹心免疫分析和荧光标记的要求，文献中发现的许多传感器在快速分析方面存在局限性。无标记和简单的功能化化学是我们的生物传感器的宝贵特性，它为快速分析生物标记物提供了一种很有前景的替代方法，即使是对于非常小的样本量[14]. 据我们所知，这是第一个使用基于半胱胺-SAM的单克隆抗S100B抗体固定化的S100B生物传感器，这意味着使用简单但有效的表面化学功能化，可以用作商业生物传感器管道开发的框架。
5.结论
在这项工作中，我们基于简单的功能化化学，开发了一种灵敏和特异的生物传感器，用于在临床相关水平上量化脑损伤生物标记物S100B。我们的结果表明，基于AuEs和AuIDEs的生物传感器具有充分的整体性能和再现性。据我们所知，这是第一个使用基于半胱胺-SAM固定单克隆抗S100B抗体的S100B生物传感器。
AuIDEs-S100B生物传感器具有简单的制造协议、良好的再现性、较短的响应时间、较少的制造时间和可能的低成本。这里提出的策略可能是一个有价值的框架，用于设计和制造新的免疫传感器，以检测其他临床感兴趣的生物标记物。
补充资料
以下内容可在线获取，网址为https://www.mdpi.com/1424-8220/21/6/1929/s1图S1：连续三次RCA-1清洗后裸AuIDE的奈奎斯特图，图S2：AuEs-PBS数据集正态性假设的图形验证，图S3：AuEs-plasma数据集中正态性假定的图形验证，图S5:AuEs-PBS回归模型的残差结构分析，图S6:AuEs-plasma回归模型的剩余结构分析，表S7:AuIDEs-血浆回归模型的残余结构分析，图表S8:AuEs-PBS和AuEs-plasma中[S100B]1000 pg/mL的奈奎斯特图，图S9:AuIDEs等离子体电容测量残差的正态性，图S10:AuIDEs等离子电容测量残值的独立性，表S1:AuEs-PBS数据的方差分析和事后检验，表S2:AuEs-plasma的方差分析与事后检验，表S3:AuIDEs血浆的方差分析和事后检验，表S4:AuEs-PBS回归模型的方差分析，表S5:AuEs-plasma回归模型的变异分析，表S6:AuIDEs-血浆回归模型的ANOVA，表S7:AuIDEs等离子体电容测量的实验设计结果，表S8:AuIDEs血浆电容测量的同方差检验，表S9:AuIDEs等离子体电容测量的方差分析和事后检验，表S10:AuEs-PBS响应变量（∆Rct）再现性评估，AuEs-plasma和AuIDEs-plasma通过估计相对标准偏差（RSD）。，表S11：通过估计相对标准偏差（RSD）评估AuIDEs中使用的单频分析的再现性。 作者贡献
概念化、A.R.、F.B.-F.、V.Z.和P.J.V。；数据管理、A.R.和F.B.-F。；形式分析，A.R.、F.B.-F.和J.D.P。；资金收购、V.Z.、M.S.和P.J.V。；调查、A.R.和F.B.-F。；方法学、A.R.、F.B.-F.、J.D.P.、M.S.和P.J.V。；项目管理、V.Z.、H.S.、M.S.和P.J.V。；资源、A.R.、F.B.-F.、V.Z.、H.S.、M.S.和P.J.V。；软件、A.R.、F.B.-F.、J.D.P.和P.J.V。；监督、V.Z.、H.S.、M.S.和P.J.V。；验证、A.R.、F.B.-F.和E.C。；可视化、A.R.、F.B.-F.、E.C.和J.D.P。；书面原稿、A.R.、F.B.-F.和E.C。；Writing-review&editing，A.R.，F.B.-F.，E.C.，J.D.P.，H.S.，M.S.和P.J.V.所有作者均已阅读并同意手稿的出版版本。
基金
这项研究由国家行政管理局（Departamento Administrativo de Ciencia）、科技创新局（COLCIENCIAS）757-2016号拨款以及亚特兰蒂克政府809-2018号电话资助。APC由北大资助。
机构审查委员会声明
这项研究是根据赫尔辛基宣言的指导方针进行的，并由位于哥伦比亚巴兰基拉的诺特大学道德委员会批准（第167号法案，于2018年1月25日批准）。
致谢
我们感谢巴西圣卡洛斯物理研究所（IFSC）的GNano小组为所有表面表征实验提供了一些必要的材料和设备。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。资助者在研究设计中没有任何作用；收集、分析或解释数据；在撰写手稿时，或在决定公布结果时。
附录A
表A1。本工作中评估的三种条件下S100B试验的Rct（ΔRct）差值。
表A1。本工作中评估的三种条件下S100B试验的Rct（ΔRct）差值。
| 日志[S100B] | 运行 | ΔRct变化（Ω） |
|---|
| 条件-1 | 条件-2 | 条件-3 |
|---|
| AuEs PBS公司 | AuEs血浆 | AuIDEs等离子 |
|---|
| 1 | 三 | 459 | 5266 | 1081 |
| 1 | 9 | 954 | 5992 | 1347 |
| 1 | 15 | 981 | 5268 | 1679 |
| 1 | 17 | 717 | 4642 | 1672 |
| 1 | 25 | 1114 | 8866 | 1694 |
| 1.5 | 4 | 2626 | 11,071 | 2561 |
| 1.5 | 7 | 2519 | 10,148 | 3086 |
| 1.5 | 8 | 2786 | 10,878 | 3336 |
| 1.5 | 11 | 2990 | 9790 | 2636 |
| 1.5 | 18 | 2603 | 9659 | 2242 |
| 2 | 2 | 3532 | 13,967 | 10,356 |
| 2 | 10 | 4221 | 15,184 | 5766 |
| 2 | 12 | 3315 | 11,938 | 8717 |
| 2 | 23 | 4045 | 11,802 | 7717 |
| 2 | 24 | 4519 | 12,249 | 6477 |
| 2.5 | 13 | 4884 | 16,747 | 15,547 |
| 2.5 | 14 | 5247 | 21,705 | 19,479 |
| 2.5 | 16 | 5925 | 16,770 | 15,731 |
| 2.5 | 20 | 7158 | 19,268 | 15707年 |
| 2.5 | 21 | 4831 | 17,003 | 17,444 |
| 三 | 1 | 28,466 | 38,698 | 32,093 |
| 三 | 5 | 36,384 | 49,786 | 31,986 |
| 三 | 6 | 12799人 | 58,484 | 29,331 |
| 三 | 19 | 9767 | 63,611 | 35,398 |
| 三 | 22 | 37297个 | 64,370 | 28,681 |
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