表面增强拉曼散射定量灵敏检测氯霉素

摘要

我们使用表面增强拉曼散射（SERS）对氯霉素（CAP）进行定量和灵敏检测。使用30 nm胶体金纳米粒子（NP），CAP的检测下限为10⁻⁸获得M。CAP的特征拉曼峰位于1344厘米处⁻¹用于三种不同类型CAP滴眼液中CAP的快速定量检测，并通过高效液相色谱（HPLC）验证了测量结果的准确性。实验结果表明，基于胶体金纳米粒的SERS技术准确、灵敏，可用于多种抗生素的快速检测。

1.简介

氯霉素（CAP）是一种常见的广谱抗生素，因其有效抑制细菌生长而广泛应用于畜牧业和水产养殖。然而，一旦CAP的残留物通过饮食进入人体，就会对人体的消化和造血系统产生严重的不良影响[1,2]. 此外，当CAP被人体吸收时，它很容易在肝脏中积聚。即使排放到环境中，短期内也不会降解[三,4]造成了持久的环境污染。由于这些原因，CAP在许多国家被禁止用于动物饲料和治疗，包括中国、美国、澳大利亚和许多欧洲国家[5,6].

然而，在现实中，CAP仍然被许多追求经济利益的企业非法使用，更糟糕的是，CAP残留很难快速检测。传统的CAP检测方法，如高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法和液相色谱-质谱法（LCMS）通常需要昂贵、耗时且复杂的分析程序[7,8,9,10]. 因此，开发快速检测CAP的方法具有重要意义。

近年来，基于金属纳米结构局域表面等离子体共振的表面增强拉曼散射（SERS）技术因其无损检测性能和超高的化学敏感性而备受关注[11,12]应用于结构分析和生物传感，甚至药物安全和环境分析[13,14]. 在临床化学和一些环境领域，SERS也是一种强大的光谱工具[15,16]. 研究人员设计了各种SERS基底，以满足物质检测的需要，并显示出各种测试性能；其中包括银纳米粒子（NP）[17]，石墨烯/银/激光织构硅[18]，和金芯Ag壳NPs膜[19]. 然而，胶体银纳米粒子容易氧化，石墨烯/银/激光织构硅和金核-银壳纳米粒子薄膜的制备过程复杂而乏味[17,18,19]. 仅由单一贵金属组成的胶体Au NPs具有制备工艺简单、灵敏度高、重复性好、生物相容性好、稳定性和增强性能好、表面等离子体共振（SPR）强且可调谐等优点，是一种很有前途的SERS活性基底来自可见光和近红外光谱区域[20,21]. 本研究以胶体金纳米粒为SERS活性底物，检测了几种CAP滴眼液中CAP的浓度，并用HPLC验证了检测结果的准确性。

2.实验段

2.1. 材料和仪器

氯金酸（HAuCl₄)、柠檬酸钠和AgNO_三购自上海阿拉丁丽晶有限公司（中国上海），罗丹明6G（R6G）购自J&K Scientific Ltd。纯CAP粉末（99.7%）购自Dr.Ehrenstorfer Gmbh（德国奥格斯堡）。三种CAP滴眼液（表示为样品1、2和3）分别由中国山东博士伦福瑞达制药有限公司、中国邯郸康业制药有限公司和中国广东红鹰科技有限公司生产。甲醇、冰醋酸和去离子水来自北京化工厂。所有化学品均为分析级，并按收到时使用。

利用透射电子显微镜（TEM）（HT7700，日立）研究了金纳米颗粒的典型形貌和微观结构。使用岛津UV-3600 UV-Vis分光光度计获得了紫外可见吸收光谱。所有拉曼信号均在LabRAM ARAMIS拉曼测试系统上获得。HPLC光谱由岛津LC-6A系统监测。

2.2. 胶体金纳米粒子和CAP溶液的制备

分别制备了平均粒径为10、20、30、40和50nm的胶体金纳米粒子。采用以下方法制备10 nm胶体金纳米粒：1.5 mL 1%w个/v（v）柠檬酸钠和42.5μL 0.1%w个/v（v）硝酸银_三添加到1 mL 20 mM HAuCl中₄水溶液在剧烈搅拌下连续搅拌，搅拌5min后，将混合溶液加入47.5mL沸腾去离子水中。然后，将混合溶液加热至沸腾，并在剧烈搅拌下保持1h，以完成胶体金纳米粒的制备，然后缓慢冷却至室温。按照与上述相同的程序制备20 nm胶体金纳米粒，但使用1 mL 20 mM HAuCl₄水溶液，0.7 mL 1%w个/v（v）柠檬酸钠，42.5μL 0.1%w个/v（v）硝酸银_三溶液和0.8 mL去离子水。

采用与上述相同的方法制备的30、40和50 nm胶体金纳米粒过度聚集，因此不使用AgNO的另一种方案_三试图让他们做好准备。更具体地说，通过以下程序制备30、40和50 nm胶体金纳米粒：1%w个/v（v）将体积分别为0.5、0.4和0.35 mL的柠檬酸钠添加到50 mL 0.25 mM煮沸的HAuCl中₄强烈搅拌下的水溶液。然后，将混合溶液加热至沸腾，并在剧烈搅拌下保持18分钟，以完成胶体金NP的制备，然后缓慢冷却至室温。

将0.0032 g原始CAP粉末溶解在10 mL去离子水中作为储备溶液（10⁻³M） 。超声振动10分钟后，储备溶液逐渐与去离子水串联稀释，以获得所需浓度的CAP溶液：10⁻⁴, 10⁻⁵, 10⁻⁶, 10⁻⁷、和10⁻⁸M。通过直接测量收到的CAP粉末，获得了纯CAP的拉曼光谱。

2.3. SERS测量

在室温下，以785nm激光为激发源，在LabRAM ARAMIS拉曼系统上获得了拉曼信号。入射功率为0.325mW，光斑区域的直径为~1μm。以15s的累积时间记录拉曼光谱，光谱分辨率为1cm⁻¹在没有特殊说明的情况下，上述参数对于所有拉曼光谱都是相同的。所有数据均取20个随机选择位置的平均值。

3.结果和讨论

3.1. 胶体金纳米粒子的表征

为了获得优异的SERS增强效果，制备了10、20、30、40和50nm的胶体金纳米粒子。TEM用于表征胶体金纳米粒子的结构。图S1（补充资料中）和图1a显示了不同尺寸胶体金纳米粒子的TEM图像。发件人图S1a可以看出，胶体金NP高度分散，平均尺寸约为10nm。由于“热点”的密度太低，这种类型的胶体不会有显著的拉曼增强。如所示图S1c，胶体金纳米粒子聚集并变大（~50 nm），这导致类似的微弱拉曼信号。因此，选择30nm胶体金纳米粒子作为基底，以增强SERS信号，因为“热点”具有适当的分散性和高密度。10到50纳米大小的胶体金纳米颗粒的形成可以反映在图S1d其中胶体金纳米粒子的紫外-可见吸收峰从516 nm移动到538 nm。

3.2. 胶体金纳米粒子的SERS活性

R6G因其良好的振动特性而被广泛应用于SERS技术，并被用作探针分子来表征胶体Au-NP基底的SERS性能[22]. 首次将532 nm激光视为SERS测试的激励源，因为该波长更接近R6G的电子共振波长[23]. 此外，从UV-Vis曲线来看，产生最高表面等离子体带的波长在500-600 nm之间。但是，如所示图S2对于CAP的检测，785nm激发比532和633nm激发产生更强的拉曼信号，因此最终选择785nm作为R6G检测的激发，以保持实验条件的一致性。为了检测R6G，将不同浓度的溶液以1:1的体积比添加到胶体金NP中，以获得混合物。图1b显示了10的混合物的拉曼光谱⁻³M R6G和不同大小的胶体金NP。拉曼谱带集中在约611780和1187厘米处⁻¹可以分别指定为C-C-C环平面内弯曲、C-H平面外弯曲和C-H平面内弯曲。其他特征约为1311、1361和1510厘米⁻¹所有这些都源于芳香族C-C拉伸振动[24]. R6G和30nm胶体金纳米粒子的混合物显示出最佳的SERS增强效果，因此选择30nm胶体Au-NP作为基底来增强检测R6G的拉曼信号。为了进一步检查底物的SERS活性，R6G与梯度浓度（10⁻²到10⁻¹⁷M） 记录了30 nm的胶体金纳米颗粒，如图所示图1c.R6G的拉曼峰仍然非常清晰，即使浓度低至10⁻¹⁷M.因为拉曼峰位于~1361厘米⁻¹比其他峰更强烈，因此选择它来建立拉曼强度与探针分子浓度之间的定量关系。图1d显示了1361厘米的综合SERS强度之间的定量关系曲线⁻¹峰值(我)和R6G溶液的浓度(C类). 使用对数刻度轴时，对数之间的线性响应我和日志C类结果表明，该线性关系可用于测定溶液中未知R6G浓度[25].

还对胶体金纳米粒子的时间稳定性进行了研究，得出的结论是SERS标签的寿命取决于储存条件。胶体金纳米粒可以在低温（例如4°C）下以优异的稳定性和活性储存数周。有关详细信息，请参阅补充资料中的图S3.

3.3. 用SERS定量检测CAP

将不同浓度的CAP溶液和三种类型的CAP滴眼液分别加入体积比为1:1的胶体金纳米粒中制备混合物。图S4显示了10的混合物的拉曼光谱⁻³M CAP和不同大小的胶体金NP。由于SERS增强效果很好，因此选择了30nm胶体金纳米粒子作为SERS基底用于CAP的检测。图2a显示了CAP溶液混合物的拉曼光谱，范围为10⁻³到10⁻⁸M和30 nm胶体金NP。这里，还检测到CAP固体粉末的拉曼光谱，如图所示图2a.CAP溶液的拉曼峰与CAP固体粉末的拉曼峰一致。CAP分子由硝基苯基、丙二醇和二氯乙基酰胺基团组成，如图S5不同的结构成分产生不同的拉曼峰。约1102厘米处的拉曼带⁻¹归属于14C-18O的弯曲振动和苯环上C-H键的拉伸振动。约1344cm处的拉曼带⁻¹分配给-NO的弯曲振动₂基团、苯环上的C-H键和碳链的拉伸振动。约1596厘米处的拉曼带⁻¹可指定为24C-25O和24C-22N的拉伸振动。

发件人图2a、 可以看出，CAP溶液的拉曼峰在低浓度（10⁻⁸M.此外，约1344 cm处的拉曼峰⁻¹显示了最佳拉曼信号。图2b显示了~1344 cm的综合SERS强度之间的定量关系曲线⁻¹峰值(我)和CAP溶液的浓度(C类). 在图2b、 六个黑色方块是来自图2a.每个数据点是20个独立实验的平均值。当使用对数刻度轴时，对数之间的响应我和日志C类是线性的，线性回归给出了关系$\mathrm{<trans\; data-src="log">日志</trans>}<trans\; data-src=" "> </trans>\mathrm{<trans\; data-src="I">我</trans>}<trans\; data-src="=">=</trans>\mathrm{<trans\; data-src="3.45">3.45</trans>}<trans\; data-src="+">+</trans>\mathrm{<trans\; data-src="0.175">0.175</trans>}<trans\; data-src="\times ">\times </trans>\mathrm{<trans\; data-src="log">日志</trans>}<trans\; data-src=" "> </trans>\mathrm{<trans\; data-src="C">C类</trans>}<trans\; data-src=".">.</trans>$

为了确认线性关系的准确性，制备了两种随机浓度的CAP滴眼液，即1×10^−5.50M（样品1）和1×10^−5.00M（样品2）和SERS测量。拉曼光谱如所示图2c.日志我计算了这两个样本的值，如所示图2b为青色圆圈（示例1）和蓝色五边形（示例2）。替换日志我公式中的值$\mathrm{<trans\; data-src="log">日志</trans>}\mathrm{<trans\; data-src="I">我</trans>}<trans\; data-src="=">=</trans>\mathrm{<trans\; data-src="3.45">3.45</trans>}<trans\; data-src="+">+</trans>\mathrm{<trans\; data-src="0.175">0.175</trans>}<trans\; data-src="\times ">\times </trans>\mathrm{<trans\; data-src="log">日志</trans>}\mathrm{<trans\; data-src="C">C类</trans>}$CAP浓度为1×10^−5.44M和1×10^−4.80M分别代表样品1和样品2，接近实际浓度。这种巧合在图2b、 其中青色圆圈和蓝色五边形基本上位于红色拟合线上。因此，线性关系可用于确定使用该底物的溶液中CAP的未知浓度。

为了验证该方法的准确性，使用SERS和HPLC分析了另一个含有未知CAP浓度的实际滴眼液样品（样品3）。样品3的检测拉曼光谱如所示图2c、 计算浓度为1×10^−3.80M使用公式$\mathrm{<trans\; data-src="log">日志</trans>}\mathrm{<trans\; data-src="I">我</trans>}<trans\; data-src="=">=</trans>\mathrm{<trans\; data-src="3.45">3.45</trans>}<trans\; data-src="+">+</trans>\mathrm{<trans\; data-src="0.175">0.175</trans>}<trans\; data-src="\times ">\times </trans>\mathrm{<trans\; data-src="log">日志</trans>}\mathrm{<trans\; data-src="C">C类</trans>}<trans\; data-src=".">.</trans>$此结果显示在图2b作为绿色三角形。另一方面，根据五种不同浓度CAP溶液的HPLC结果图2d、 线性关系$\mathrm{<trans\; data-src="A">A类</trans>}<trans\; data-src="=">=</trans><trans\; data-src="-">-</trans>\mathrm{<trans\; data-src="2255.65">2255.65</trans>}<trans\; data-src="+">+</trans>\mathrm{<trans\; data-src="605.56">605.56</trans>}<trans\; data-src="\times ">\times </trans>\mathrm{<trans\; data-src="C">C类</trans>}$获得，其中A类和C类分别表示CAP的峰面积和浓度。中的绿色三角形图2d是样品3的结果。根据该HPLC结果，样品3的浓度测定为32.3 mg/L。该计算值与计算浓度（1×10^−3.80M） 利用SERS线性回归公式，验证了SERS方法检测CAP的准确性。

4.结论

总之，已经制备了均匀和单分散的胶体金纳米粒子，并将其用作低成本SERS基底，用于CAP的定量和快速检测。实验结果表明，30 nm胶体金-纳米颗粒基底具有优异的SERS性能，检测极限为10⁻⁸M代表CAP。1344 cm处CAP的特征拉曼峰⁻¹用于三种不同类型CAP滴眼液中CAP的快速定量检测。HPLC光谱验证了SERS方法检测CAP的准确性。该方法可用于CAP的定量、灵敏检测，也可用于其他分子有机物的检测。