SOCS3介导的阻断揭示JAK2/STAT5信号通路对奶牛乳腺上皮细胞泌乳和增殖的主要贡献体外

摘要

细胞因子信号转导抑制因子3（SOCS3）是细胞因子诱导的细胞因子信号负反馈调节因子。越来越多的证据证明它是信号转导物和转录激活物5（STAT5）的抑制剂。在这里，我们使用奶牛乳腺上皮细胞（DCMECs）来分析SOCS3的功能以及SOCS3和STAT5a之间的相互作用。荧光免疫染色发现SOCS3在DCMECs的细胞质和细胞核中表达。SOCS3的过度表达和抑制通过调节JAK2/STAT5a通路活性带来了显著的乳蛋白合成变化，SOCS3表达也降低了SREBP-1c的表达和脂肪酸的合成。抑制STAT5a活化与SOCS3表达降低相关，这表明SOCS3基因可能是STAT5a活化的靶点之一，经L-蛋氨酸（Met）处理的DCMECs导致SOCS3的表达降低。通过CASY-TT检测，SOCS3也可降低细胞增殖和活力。总之，我们的研究结果表明，SOCS3作为JAK2/STAT5a通路的抑制剂，通过降低SREBP-1c的表达来干扰脂肪酸的合成，这证明其参与了乳蛋白合成和脂肪合成。总之，这些结果表明，牛奶合成和DCMEC增殖需要低SOCS3表达在体外.

1.简介

细胞因子信号转导（SOCS）蛋白的抑制剂是JAK/STAT通路的抑制剂，作为一个经典的负反馈回路，调节细胞对细胞因子的反应性，这是1997年不同群体首次发现的[1,2,三]. 作为SOCS家族的一员，SOCS3的许多生物学功能都归因于其活性，从生长发育到泌乳和凋亡，从胰岛素抵抗到肥胖，以及免疫和炎症反应[4,5,6]. SOCS3的表达受到各种细胞因子的刺激，包括生长激素（GH）、催乳素（PRL）、胰岛素（INS）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1），并受到糖皮质激素的抑制[7,8]. SOCS3和STAT5之间的相互作用最近得到了深入研究。SOCS3对STAT5有较强的抑制作用，其在乳腺癌细胞中的表达依赖于STAT5[9]，并且似乎独立于STAT5激活体内[10]而不是妊娠和哺乳期小鼠STAT5信号的显著负调控因子[11]. 然而，在其他实验中，SOCS3被证明可以抑制PRL诱导的乳蛋白基因表达和STAT5激活在体外[12]. SOCS3是否是奶牛乳腺上皮细胞（DCMEC）中JAK2/STAT5信号通路的负反馈调节器尚不完全清楚，需要进一步的实验来阐明这一点。STAT5最初被认为是一种转录因子，可调节β-酪蛋白基因对PRL的反应。它由两个密切相关的基因STAT5a和STAT5b编码[13]. STAT5是控制乳蛋白基因表达和细胞增殖的主要因子，这在小鼠和牛中已得到大量研究[14,15,16,17]. 这些报告与Bionaz和Loor的报告不同等. [18]支持JAK2/STAT5信号在牛乳腺乳蛋白合成中的次要作用体内STAT5基因和连接STAT5的调控网络在DCMEC产奶中的作用仍存在争议。SOCS3是否参与JAK2/STAT5通路来调节DCMEC中的乳蛋白合成尚不清楚。

雷帕霉素（mTOR）促进蛋白质合成的哺乳动物靶点已有详细描述，甾醇调节元件结合蛋白（SREBP）在调节脂质合成中起着重要作用[19]. SOCS3是否通过DCMEC中的这些途径影响泌乳，其作用的分子机制尚不清楚。研究已经调查了SOCS3和SREBP-1c之间的关系，但尚未对DCMEC进行研究[20]. SOCS3可能参与DCMEC中乳脂合成的调节[21]. 了解单个氨基酸（AAs）对乳蛋白合成的调节作用对哺乳很重要。蛋氨酸（Met）是一种必需的AA，在蛋白质合成和包括细胞增殖在内的许多细胞过程中起着基本作用[22,23]. 在低氨基酸培养基中，Huh-7细胞中SOCS3的表达增加[24]. 虽然没有研究直接显示Met对SOCS3表达的调节，但Met对其表达的影响在很大程度上尚不明确。本研究旨在建立SOCS3对DCMECs泌乳和增殖的直接作用，并进一步阐明SOCS3介导的JAK2/STAT5信号通路阻断的作用。

2.结果和讨论

2.1. SOCS3过度表达降低DCMEC细胞增殖和负调控JAK2/STAT5a信号通路及脂肪酸合成

SOCS3是公认的STAT负调控因子。为了测试SOCS3是否能够阻止DCMEC中STAT5a的激活，SOCS3过度表达，并在48小时分别用qRT-PCR和WB检测相关基因的表达。同时用CASY检测细胞增殖和活力。pGCMV-IRES-EGFP-SOCS3组SOCS3 mRNA表达显著增加(图1A） ●●●●。pGCMV-IRES-EGFP-SOCS3组SOCS3蛋白表达明显高于pGCMV-IRES-EGFP组(图1B、 C）。我们观察到DCMEC中SOCS3蛋白显著增加60%-65%。这表明SOCS3在感染pGCMV-IRES-EGFP-SOCS3的DCMEC中稳定且高表达。与空载体组相比，SOCS3转染细胞中STAT5a、p-STAT5a、mTOR、p-mTOR和β-酪蛋白的mRNA水平和蛋白表达明显降低(图1A–C）。在这里，我们证明了SOCS3在DCMEC中的过度表达显著抑制了细胞生长和活性(图1D、 E）。在本研究中，我们发现SOCS3蛋白分布在DCMEC的细胞质和细胞核中。细胞很少显示斑点状核SOCS3表达模式(图1F） ●●●●。在SOCS3蛋白过度表达的实验中，我们发现当SOCS3的水平升高时，其核定位水平较高(图1G、 I）。此外，在SOCS3过度表达后，通过免疫荧光评估p-STAT5a的定位。p-STAT5a蛋白分布于细胞质和细胞核中。转染SOCS3基因后，细胞核中p-STAT5a表达水平下调(图1H、 J），与WB结果一致。

为了证明SOCS3对脂质合成的影响，我们检测了脂质代谢关键基因的表达，如SREBP-1c、脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）和硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD）mRNA水平。结果表明，SOCS3的过度表达下调了SREBP-1c、FAS、ACC和SCD mRNA水平(图1A） ●●●●。western blotting检测SREBP-1c蛋白的表达与mRNA水平的表达趋势一致。SOCS3明显抑制SREBP-1c蛋白的表达(图1B、 C）。这些结果表明，SOCS3的过表达抑制了SREBP-1c的表达并减少了脂肪酸的合成。

2.2. 抑制SOCS3增加DCMEC泌乳和增殖关键基因的表达

利用针对SOCS3的siRNA，我们检测了SOCS3沉默对DCMEC泌乳和增殖的影响。SOCS3被抑制，并在24小时分别用qRT-PCR和WB检测某些基因的表达。同时用CASY检测细胞增殖和活力。使用qRT-PCR验证siRNA转染后SOCS3的敲除。与阴性对照组相比，SOCS3抑制增加了转染SOCS3的细胞中STAT5a、p-STAT5a、mTOR、p-mTOR，SREBP-1c、FAS、ACC、SCD和β-酪蛋白的表达(图2A） ●●●●。不同基因的mRNA水平和蛋白表达显示于图2A–C。沉默SOCS3导致增殖和生存能力增加(图2D、 E）。此外，在SOCS3抑制后通过免疫荧光评估p-STAT5a的定位。细胞核中p-STAT5a蛋白表达上调(图2F、 G），与WB结果一致。

图1。SOCS3过表达对DCMECs泌乳和增殖的影响。DCMECs分为三组：转染SOCS3表达载体或空载体（对照组），未转染，生长48h(一)使用qRT-PCR检测生长48 h的DCMEC中的基因表达，并将其归一化为β-actin mRNA表达；(B类)SOCS3过度表达后48小时DCMEC中SOCS3、STAT5a、p-STAT5a、mTOR、p-mTOR，SREBP-1c，β-酪蛋白和β-肌动蛋白的Western blotting结果；(C类)SOCS3过度表达后通过western blotting对SOCS3、STAT5a、p-STAT5a、mTOR、p-mTOR，SREBP-1c和β-酪蛋白/β-肌动蛋白相对折叠的灰度扫描结果；(D类,E类)用CASY测定生长24小时的DCMEC的增殖和存活率；(F类)SOCS3本地化。SOCS3（绿色），细胞核（红色）。比例尺=75μm。(G公司)过度表达的SOCS3蛋白具有较高的DCMEC核定位水平。a： 细胞转染SOCS3表达结构并生长24小时；b： 用空载体转染细胞并生长24小时；c： 未转染细胞。SOCS3（绿色）、Giantin（红色）和DAPI（蓝色）。比例尺=20μm；(H（H）)对DCMEC进行p-STAT5a免疫荧光染色。a： 细胞转染SOCS3表达结构并生长24小时；比例尺=75μm；b： 用空载体转染细胞并生长24小时；比例尺=20μm；c： 未转染细胞。p-STAT5（绿色）、Giantian（红色）和细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺=20μm；(我,J型)SOCS3过度表达后的荧光染色分析。不同的上标表示相对于对照组的显著差异。*或**表示与阴性对照组相比存在显著差异(第页<0.05或第页<0.01).

图1。SOCS3过度表达对DCMEC泌乳和增殖的影响。DCMECs分为三组：转染SOCS3表达载体或空载体（对照组），未转染，生长48h(一)使用qRT-PCR检测生长48 h的DCMEC中的基因表达，并将其归一化为β-actin mRNA表达；(B类)SOCS3过度表达后48小时DCMEC中SOCS3、STAT5a、p-STAT5a、mTOR、p-mTOR，SREBP-1c，β-酪蛋白和β-肌动蛋白的Western blotting结果；(C类)SOCS3过度表达后通过western blotting对SOCS3、STAT5a、p-STAT5a、mTOR、p-mTOR，SREBP-1c和β-酪蛋白/β-肌动蛋白相对折叠的灰度扫描结果；(D类,E类)用CASY测定生长24小时的DCMEC的增殖和存活率；(F类)SOCS3本地化。SOCS3（绿色），细胞核（红色）。比例尺=75μm。(G公司)过度表达的SOCS3蛋白具有较高的DCMEC核定位水平。a： 细胞转染SOCS3表达结构并生长24小时；b： 用空载体转染细胞并生长24小时；c： 未转染细胞。SOCS3（绿色）、Giantin（红色）和DAPI（蓝色）。比例尺=20μm；(H（H）)对DCMEC进行p-STAT5a免疫荧光染色。a： 细胞转染SOCS3表达结构并生长24小时；比例尺=75μm；b： 用空载体转染细胞并生长24小时；比例尺=20μm；c： 未转染细胞。p-STAT5（绿色）、Giantian（红色）和细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺=20μm；(我,J型)SOCS3过度表达后的荧光染色分析。不同的上标表示与对照组相比存在显著差异。*或**表示与阴性对照相比的显著差异(第页<0.05或第页<0.01).

图2。SOCS3抑制对DCMECs泌乳和增殖的影响。DCMEC分为三组：转染SOCS3 siRNA或阴性对照（对照组），未转染，生长24小时(一)用qRT-PCR检测SOCS3抑制后生长24 h的DCMEC中不同基因的相对mRNA表达；(B类)抑制SOCS3 24 h后，DCMEC中SOCS3、STAT5a、p-STAT5a、mTOR、p-mTOR和SREBP-1c、β-酪蛋白和β-肌动蛋白的Western blotting结果；(C类)SOCS3抑制24小时后，通过western blotting对SOCS3、STAT5a、p-STAT5a、mTOR、p-mTOR，SREBP-1c和β-酪蛋白/β-肌动蛋白相对折叠的灰度扫描结果；(D类,E类)用CASY测定生长24小时的DCMEC的增殖和存活率；(F类)SOCS3抑制后荧光染色。a： 细胞转染SOCS3 siRNA；b： 阴性对照；c： 未转染细胞。a和b中的比例尺=75μm；c中为20μm；(G公司)SOCS3抑制后的荧光染色分析。*或**表示与阴性对照组相比有显著差异(对<0.05或第页<0.01).

图2。抑制SOCS3对DCMEC泌乳和增殖的影响。DCMEC分为三组：转染SOCS3 siRNA或阴性对照（对照组），未转染，生长24小时(一)用qRT-PCR检测SOCS3抑制后生长24 h的DCMEC中不同基因的相对mRNA表达；(B类)抑制SOCS3 24 h后，DCMEC中SOCS3、STAT5a、p-STAT5a、mTOR、p-mTOR和SREBP-1c、β-酪蛋白和β-肌动蛋白的Western blotting结果；(C类)SOCS3抑制24小时后，通过western blotting对SOCS3、STAT5a、p-STAT5a、mTOR、p-mTOR，SREBP-1c和β-酪蛋白/β-肌动蛋白相对折叠的灰度扫描结果；(D类,E类)用CASY测定生长24小时的DCMEC的增殖和存活率；(F类)SOCS3抑制后荧光染色。a： 细胞转染SOCS3 siRNA；b： 阴性对照；c： 未转染细胞。a和b中的比例尺=75μm；c中为20μm；(G公司)SOCS3抑制后的荧光染色分析。*或**表示与阴性对照组相比的显著差异(第页<0.05或第页<0.01).

2.3. DCMEC中SOCS3激活需要STAT5a

研究了STAT5a在乳腺中是否在SOCS3的转录调控中发挥重要作用。通过转染STAT5a-siRNA 24小时沉默STAT5a基因表达(图3A） ●●●●。我们评估了沉默STAT5a基因表达对DCMEC中SOCS3的影响，采用qRT-PCR和WB分别研究STAT5amRNA水平和蛋白表达，p-STAT5a，SOCS3，β-酪蛋白。数据显示，与阴性对照组相比，STAT5a抑制组的表达均下调(图3B–D），表明该转录因子负责DCMEC中SOCS3的表达。

图3。STAT5a是DCMEC中SOCS3表达所必需的。DCMECs分为三组：转染STAT5a siRNA或阴性对照（对照组），未转染，生长48h(一)用qRT-PCR检测STAT5抑制后生长24 h的DCMEC中STAT5a、SOCS3、β-酪蛋白基因的相对mRNA水平。(B类)生长24小时的DCMEC中STAT5a、p-STAT5a、SOCS3、β-酪蛋白的Western blotting分析受到STAT5a-抑制。β-actin作为负荷控制；(C类)24小时STAT5a抑制后，western blotting对STAT5a、p-STAT5aSOCS3和β-酪蛋白/β-肌动蛋白相对折叠的灰度扫描结果*或**表示与阴性对照组相比存在显著差异(第页<0.05或对<0.01).

图3。STAT5a是DCMEC中SOCS3表达所必需的。DCMECs分为三组：转染STAT5a siRNA或阴性对照（对照组），未转染，生长48h(一)用qRT-PCR检测STAT5抑制后生长24 h的DCMEC中STAT5a、SOCS3、β-酪蛋白基因的相对mRNA水平。(B类)生长24小时的DCMEC中STAT5a、p-STAT5a、SOCS3、β-酪蛋白的Western blotting分析受到STAT5a-抑制。β-actin作为负荷控制；(C类)24小时STAT5a抑制后，western blotting对STAT5a、p-STAT5aSOCS3和β-酪蛋白/β-肌动蛋白相对折叠的灰度扫描结果*或**表示与阴性对照组相比存在显著差异(第页<0.05或第页<0.01).

2.4. Met对SOCS3调节β-酪蛋白表达和细胞增殖的影响

为了确定Met对DCMEC中β-酪蛋白表达和细胞增殖的影响，用Met（0.6 mmol L⁻¹)根据我们实验室之前的描述，在处理后24小时收获[25]. 用CASY测定细胞活力和增殖。通过qRT-PCR和蛋白质印迹分别评估SOCS3、STAT5a、p-STAT5a、mTOR、p-mTOR和β-酪蛋白的mRNA水平和蛋白质表达。Met治疗导致mTOR、STAT5a、β-酪蛋白mRNA水平显著升高(图4A） 以及STAT5a和p-STAT5a、mTOR和p-mTOR、β-酪蛋白的蛋白表达(图4B、 C），而SOCS3的mRNA水平和蛋白表达均降低(图4B、 C）。结果还表明，与对照组相比，细胞活力和增殖显著增加(图4D、 E）。这些数据表明，Met抑制了SOCS3的表达。

图4。Met对SOCS3调节DCMECs中β-酪蛋白表达和细胞增殖的影响。用Met（0.6 mmol L）处理DCMEC⁻¹)24小时，未处理（对照）。(一)qRT-PCR检测乳蛋白合成关键基因mRNA水平的变化；(B类)Met治疗24小时后SOCS3、STAT5a、p-STAT5a、mTOR、p-mTOR，β-酪蛋白和β-肌动蛋白的Western blotting结果；(C类)Met治疗后SOCS3、STAT5a、p-STAT5a、mTOR、p-mTOR和β-酪蛋白/β-肌动蛋白相对折叠的免疫印迹灰度扫描结果；(D类,E类)用CASY法测定细胞增殖和活力。不同的上标表示与对照组相比存在显著差异。*或**表示与阴性对照组相比存在显著差异(第页<0.05或第页<0.01).

图4。Met对SOCS3调节DCMEC中β-酪蛋白表达和细胞增殖的影响。用Met（0.6 mmol L⁻¹)24小时，未处理（对照）。(一)qRT-PCR检测乳蛋白合成关键基因mRNA水平的变化；(B类)Met治疗24小时后SOCS3、STAT5a、p-STAT5a、mTOR、p-mTOR，β-酪蛋白和β-肌动蛋白的Western blotting结果；(C类)Met治疗后SOCS3、STAT5a、p-STAT5a、mTOR、p-mTOR和β-酪蛋白/β-肌动蛋白相对折叠的免疫印迹灰度扫描结果；(D类,E类)用CASY法测定细胞增殖和活力。不同的上标表示与对照组相比存在显著差异。*或**表示与阴性对照组相比存在显著差异(第页<0.05或第页<0.01).

2.5. 讨论

通过SOCS3的过表达和抑制实验，我们证明SOCS3作为JAK2/STAT5a信号通路的抑制剂抑制了DCMEC中β-酪蛋白基因的表达和细胞增殖。转染细胞中STAT5a转录物的相对水平以及STAT5a和p-STAT5a-蛋白的表达与DCMEC中β-酪蛋白的表达相关。最近在小鼠和人身上的研究提供了SOCS3和STAT5之间的直接联系[26,27]. SOCS3通过几种不同的机制充当JAK-STAT信号传导的负调节器，但没有研究报告通过其与STAT5蛋白的直接相互作用实现负反馈机制，尽管其结果的总体趋势表明SOCS3在减弱STAT5表达中起作用[28,29]. 总之，这些数据表明，SOCS3可能通过抑制STAT5a的激活，是DCMECs中蛋白质合成的抑制剂。

STAT5a/b在乳腺中的作用一直存在争议，根据所研究的模型，有矛盾的证据。然而，在小鼠和牛乳腺中，越来越多的证据表明STAT5a对乳腺发育和乳蛋白表达至关重要[30,31]. 因此，我们研究了STAT5a在DCMEC中是否发挥同样的作用。STAT5a的抑制导致β-酪蛋白的mRNA水平和蛋白表达降低。这一结果与之前的研究一致，即小鼠乳腺中STAT5缺乏会导致小叶肺泡发育几乎完全丧失，导致妊娠和哺乳失败期间乳蛋白基因表达减少[32,33]. 基于这些发现，可以得出结论，SOCS3参与JAK2-STAT5a通路，以调节DCMEC中的乳蛋白合成。

为了解决STAT5a和SOCS3之间相互作用的机制，我们试图确定过表达和抑制SOCS3蛋白是否以依赖于SOCS3定位的方式改变激活的STAT5a蛋白水平，我们使用免疫荧光观察SOCS3的定位，我们发现SOCS3蛋白分布在细胞质和细胞核中，过表达的SOCS3蛋白质主要定位在细胞核中，可能会降低DCMEC中STAT5a蛋白的活性。抑制SOCS3后，细胞核内p-STAT5a水平升高。我们的结果表明，p-STAT5a的表达和亚细胞定位受SOCS3的调控，这将在细胞水平上提供SOCS3抑制STAT5a活性的评估。因此，这些结果与Kyeong-Hee Lee发现SOCS3在某些生物条件下从细胞质转移到细胞核的结果一致[34]因此，我们预测可能存在一种机制，即STAT5a等蛋白质与SOCS3相互作用，可能将其带入细胞核。

在这里，SOCS3在DCMEC中的表达依赖于STAT5a，这可以通过siRNA靶向STAT5a的DCMEC缺乏SOCS3表达来证明。结合其他报道，我们推断SOCS3基因可能是STAT5a激活靶点之一。该结果与Ehrentraut S的报告一致等STAT5抑制剂pimozide对STAT5活化的抑制伴随着所有三种PCM1-JAK2细胞系（人类白血病/淋巴瘤细胞系）、MAC-1/2A/2B中SOCS2/3表达的剂量依赖性缺失[35]. 这一结果与Le Provost的结果不同等. [36]他发现STAT5a不参与刺激处女小鼠乳腺组织中SOCS3的表达。为了确定SOCS3是否通过STAT5a表达，必须识别SOCS3基因启动子中的STAT5结合位点。STAT5可以被招募到SOCS3启动子的STAT反应元件（pSRE）中，以启动其在人类中的转录，并且对小鼠SOCS3基因启动子区域的序列分析显示STAT5结合位点[9,37]. 根据这些，我们推断活化的STAT5a可能与DCMECs中SOCS3的启动子结合。总之，SOCS3是DCMEC中JAK2/STAT5a信号通路的负反馈调节器。简言之，STAT5a增加SOCS3的表达，然后SOCS3反过来限制进一步的STAT5a信号传导，从而实现细胞内负反馈回路。这是首次报道SOCS3抑制DCMEC中的乳蛋白合成。到目前为止，SOCS3在乳蛋白合成中的作用和机制已被证实。

最近对啮齿动物和反刍动物的研究强调了mTOR在调节乳蛋白合成中的作用[38,39]. 在本研究中，我们还发现SOCS3抑制mTOR的表达和磷酸化。SOCS3的这种负作用似乎不是DCMEC特有的，因为最近在氧诱导视网膜病变和癌症的小鼠模型中也有描述[40]. 这一结果进一步揭示了SOCS3参与调控DCMEC的牛奶合成。SOCS3调节mTOR的确切机制尚待阐明。

DCEMC的数量和活性是牛奶生产的决定因素[41]. 因此，我们接下来阐明了SOCS3对细胞增殖的影响。通过CASY实验，我们发现SOCS3过度表达抑制细胞生长，而SOCS3抑制则诱导细胞生长。我们的数据表明，SOCS3本身是细胞增殖的抑制剂。此外，SOCS3作为STAT5a或mTOR磷酸化的负调控因子发挥作用。这些结果表明，SOCS3可能通过STAT5a或mTOR非依赖性机制抑制细胞增殖。这一发现与在人类肺癌中进行的研究相似，其中SOCS3也导致细胞生长减少[42].

在这里，我们的结果验证了SOCS3影响DCMECs中SREBP-1c的表达及其下游调控靶点FAS、SCD和ACC。这一结果与早期的研究形成了鲜明对比，在胰岛素信号SOCS3过度表达增加了病态肥胖女性和肥胖糖尿病小鼠肝脏中SREBP-1c及其下游调节靶点[43,44]. 目前尚不清楚SREBP-1c和SOCS3之间的结合是直接的还是通过mTOR或STAT5a等乳合成关键基因的表达实现的。SREBP-1在牛脂质合成的综合调控中起着重要作用[45]. SOCS3和SREBP-1c之间的联系的发现为我们理解调节脂质合成的分子机制打开了新的篇章。

蛋氨酸是一种必需氨基酸，是蛋白质合成的底物。在这里，Met治疗导致更多细胞增殖，mTOR、STAT5a和β-酪蛋白的表达显著增加。令人惊讶的是，SOCS3的丰度并没有增加，但实际上有所下降。必需氨基酸的存在导致直接诱导mTOR激活，例如直接与Rag GTPase结合的亮氨酸-tRNA合成酶（LRS）激活mTORC1[46]有助于提高乳蛋白基因表达[47]. 我们推断Met对mTOR激活的积极作用可能是降低SOCS3表达的主要原因。但机制尚不清楚。结合我们的报告，我们预测保持SOCS3处于低水平状态对于确保泌乳和乳腺上皮增殖而不是启动细胞凋亡非常重要。Met可以通过抑制SOCS3表达部分上调牛奶蛋白合成。

3.实验

3.1. 细胞制备和处理

DCMEC是根据Lu报告的我们实验室先前的方法培养的等. [48]. 细胞培养在Dulbecco改良的Eagle培养基中：添加10%胎牛血清（FBS）、胰岛素（牛，5μg mL）的营养混合物12（DMEM:F12）⁻¹)，氢化可的松（1μg mL⁻¹)，青霉素（100 U mL⁻¹)和链霉素（0.1 mg mL⁻¹). 在实验处理之前，细胞被镀成3×10⁴单元格厘米⁻²将培养基替换为含有胰岛素（5μg mL）的DMEM:F12⁻¹)，氢化可的松（1μg mL⁻¹)和催乳素（羊，3μg mL⁻¹)没有FBS。

3.2. 细胞活性测定

根据制造商的说明，使用CASY TT分析仪系统（德国罗伊特林根Schärfe System GmbH）测定细胞活力。用死亡和存活的DCMEC细胞进行校准后，将光标位置设置为11.75至50.00μm（评估光标）和7.63至50.00微米（标准光标）。细胞被胰蛋白酶化。使用CASY-TT对用CASY电解质溶液（1:100）稀释的细胞进行检查，并对100μL等分样品进行三次分析。

3.3. RNA提取和定量实时PCR

使用Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）提取DCMEC的总RNA。随后，通过凝胶分析量化RNA的完整性和质量，并根据制造商的协议，使用热脚本逆转录酶（中国大连TaKaRa）将其逆转录成cDNA。使用实时PCR试剂盒Sensimix TM SYBR和Flurescen进行定量实时PCR反应，并使用ABI PRISM 7300 RT-PCR系统（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）进行分析，总体积为20μL，使用96 well微孔板。以下所有基因mRNA均归一化为β-肌动蛋白mRNA水平。这些基因转录物的引物如下：SOCS3:sense5'-GAGAAGATCCCTCTGGTGTTGA-3'，antisense5'-GGTCCGAACTCGAATT-3'；STAT5a:感应5'-GTCCCTCCCGTGGTTGT-3'，反感应5'-CGGCCTTGAATTTCATGTTG-3'；β-酪蛋白：sense5'-AACAGCCTCCCACAAAC-3'，antisense5'-AGCCATAGCCCTCTCAC-3；SREBP-1c：传感器5'-AGTAGCGGTGGAAGT-3'，反义5'-GCAGCGCTCTGGATT-3'；mTOR:sense5'-ATGTGTCCCTGGTCCTTATG-3'，antisense5'-GGGTCAGAGTGGCCTCAA-3'；FAS:sense5'-CACGCTGTCGGTAAT-3'，antisense5'-CGCTCCACTCATCCTG-3'；ACC:sense5'-AGACAACAGGACCATT-3'，antisense5'-AGGACTGCCGAAACAT-3’；SCD:sense5’-CTGTGTCACCGAACC-3’，antisense5’-TAGCGGACCTTT-3’；β-肌动蛋白：感觉5'-AAGACCTCTACGCCAACACG-3'，反感觉5'-TTTGCGTGGACGATGGAG-3'。所有RT-PCR反应均根据之前的报告进行[49]. 采用比较CT方法进行RT-PCR分析。

3.4. 免疫荧光

将DCMEC接种在玻璃盖玻片上，在六孔板中达到30-50%的浓度。然后用pGCMV-IRES-EGFP-SOCS3表达载体或靶向SOCS3的siRNA瞬时转染细胞并培养24小时，然后用PBS洗涤细胞两次并固定在4%(w/v型)4°C下的冰镇多聚甲醛10分钟。然后，在37°C下将固定细胞在封闭缓冲液中（在含有5%BSA和0.1%TritonX-100的三缓冲盐水中）封闭1小时，然后在37°C下与抗SOCS3初级抗体或抗p-STAT5a初级抗体以1:50的稀释度孵育1小时。在TBS/T中清洗三次后，将标本与FITC-结合的抗兔IgG在37°C下以1:200的稀释度孵育1小时，并在37℃下以DAPI孵育10分钟。最后，在TBS/T中洗涤三次后，使用徕卡TCS-SP2 AOBS共焦显微镜将盖玻片安装到共焦显微镜上，分别检测SOCS3、p-STAT5a的表达。

3.5. Western Blot分析

使用LiMin Lu报告的标准技术进行Western blot分析[48]. 将含有约30μg蛋白质的总细胞裂解液在10%SDS-PAGE凝胶上分离，并转移到硝化纤维素膜上（Bio-RAD，中国上海）。5%脱脂牛奶（含5%脱脂奶和0.1%吐温-20的三缓冲盐水）中的膜被堵塞。用针对以下抗体的一级抗体对膜进行检测：SOCS3（H-103；Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cru z，CA，USA）、STAT5a、p-STAT5a、mTOR、p-mTOR（Cell Signaling Technology，Beverly，MA，USA，美国）、SREBP-1c（成熟型，68kD）（Santa Crux）、β-酪蛋白（Abbiotec，USA，然后用与HRP结合的二级抗体[1:1000]进行第二次孵育（ZSGB-BIO，中国北京）。使用Super ECL plus（ApplyGEN，中国北京）进行HRP结合二级抗体的化学发光检测。

3.6. SOCS3真核表达质粒的构建及转染

用Trizol试剂（Invitrogen）提取培养的DCMEC总RNA，合成cDNA并将PCR产物插入pMD18-T质粒（TaKaRa公司），然后用限制性内切酶鉴定生态RI和萨尔I（TaKaRa公司）和DNA测序。将SOCS3基因克隆到pGCMV-IRES-EGFP载体（中国上海基因制药有限公司）。因此，通过消化获得并鉴定了结合质粒生态RI和萨尔I.用特定的限制性内切酶位点设计以下引物，克隆SOCS3的完整编码区。正向引物5'-CGGAATTCATGGTCACCAAGAGTT-3'(生态R I）和反向引物5'-ACGCGACCTAAAAGCGGGCATCGTACT-3'(萨尔一） ●●●●。优化的放大条件是在58.9°C下退火，在72°C下延伸35个周期。

瞬时转染根据Lu之前的报告[48]. 简而言之，根据制造商的方案，用pGCMV-IRES-EGFP-SOCS3或空载体转染DCMEC，添加空载体以平衡使用Lipofectamine TM 2000（LF2000，Invitrogen）转染的DNA样本总量。未转染细胞以相同的转染方式作为对照。细胞培养48小时，然后收集细胞进行进一步实验。

3.7. 小干扰RNA转染

小干扰RNA（转染SOCS3或STAT5a siRNA，GenePharma Co.，Ltd.）和阴性对照RNA寡核苷酸（GenePharma Co.，Ltd.）。根据制造商的方案，用SOCS3或STAT5a siRNA转染DCMEC，并使用Lipofectamine TM 2000（LF2000，Invitrogen）进行阴性对照。为了沉默SOCS3或STAT5基因表达，转染细胞培养24小时。然后收集细胞进行进一步实验。

3.8. 统计分析

结果报告为平均值±SE。所有数据均来自至少三个独立实验。数据统计和组间个体差异使用t吨-使用Sigma Plot 9.0软件进行测试，如果第页<0.05或第页< 0.01.

4.结论

SOCS3作为JAK2/STAT5信号通路的负反馈调节因子抑制了DCMEC中β-酪蛋白基因的表达和细胞增殖。Met可以通过抑制SOCS3的表达来上调牛奶蛋白的合成。DCMEC中SOCS3激活需要STAT5。我们还注意到，由于SOCS3的激活和抑制，mTOR和SREBP-1c表达发生了变化。