Anti-Inflammatory Activity of Methyl Salicylate Glycosides Isolated from Gaultheria yunnanensis (Franch.) Rehder

Zhang, Dan; Liu, Rui; Sun, Lan; Huang, Chao; Wang, Chao; Zhang, Dong-Ming; Zhang, Tian-Tai; Du, Guan-Hua

doi:10.3390/molecules16053875

开放式访问第条

水杨酸甲酯糖苷的抗炎活性透骨香（法语）Rehder

¹

中国医学科学院和北京协和医学院药物研究所国家药物筛选中心，北京100730

²

中国医学科学院北京协和医科大学药物研究所植物化学系，北京100730

^三

中草药生物活性物质与资源利用教育部重点实验室，北京100050

^*

应向其发送信件的作者。

分子 2011,16(5), 3875-3884;https://doi.org/10.3390/molecules16053875

收到的意见：2010年2月12日/修订日期：2011年4月28日/接受日期：2011年5月6日/发布日期：2011年5月9日

（本条属于本节天然产物化学)

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摘要

:

透骨香雷德是一种用于治疗类风湿关节炎、肿胀和疼痛的中药。两种水杨酸甲酯糖苷，即苯甲酸甲酯-2-哦-β-D类-木吡喃糖（1-6）-哦-β-D类-吡喃葡萄糖苷（J12122）和苯甲酸甲酯-2-哦-β-D类-木吡喃糖（1-2）[哦-β-D-吡喃木糖基（1-6）]-哦-β-D类-吡喃葡萄糖苷（J12123）是从云南紫檀。在本研究中，我们通过测量促炎细胞因子的产生、一氧化氮（NO）的积累和活性氧（ROS）水平，研究了J12122和J12123对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的抗炎活性。结果表明，两种水杨酸甲酯苷均能剂量依赖性地抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-6的产生。与这些观察结果一致，J12122和J12123显著抑制NO的积累，在3.0μg/mL浓度下，抑制率分别为56.20%和51.72%。此外，这两种水杨酸甲酯苷降低了LPS诱导的ROS水平。这些结果表明，分离的化合物通过抑制促炎细胞因子、NO和ROS的产生而具有抗炎特性。

关键词：

Gaultheria植物;抗炎;甲基水杨酸苷;炎性细胞因子

1.简介

炎症是宿主对外来挑战或组织损伤的有益反应，最终导致组织结构和功能的恢复[1]. 为了消灭入侵的病原体，大量细胞和分子因子被释放出来对抗入侵者，产生多层次的攻击[2,三,4]. 然而，炎症就像一把“双刃剑”，是许多疾病状态的发病机制，也可能伴随着长时间的炎症[5]. 在炎症过程中，巨噬细胞向感染区域招募巨噬细胞、NO、活性氧（ROS）和细胞因子（如TNF-α、IL-1β和IL-6）是由巨噬细胞产生的，这些是炎症反应和组织损伤的关键介质[6,7]. 作为炎症的中枢介质，TNF-α受多种致病刺激诱导，在慢性炎症疾病的发病机制中起着关键作用[8,9]. 同样，IL-1β是一种重要的促炎细胞因子，调节免疫和炎症反应的多个方面。急性炎症诱导炎症部位IL-1β的上调，IL-1β水平升高可引起细胞或组织损伤[10,11]. 此外，IL-6是一种关键的促炎细胞因子，可调节过多的生理功能，包括淋巴细胞的发育分化、细胞增殖、细胞存活和凋亡信号的改善[12,13,14,15]. 因此，促炎因子水平是评价抗炎药疗效的重要参数。

透骨香（法语）Rehder(云南广藿香)属于杜鹃花科，是一种生长在中国西南和南部地区的中草药，作为民间药物广泛用于治疗风湿性关节炎、肿胀、疼痛、创伤、慢性气管炎、感冒和眩晕[16]. 一些水杨酸衍生物、木脂素、黄酮、二萜、三萜、有机酸、香豆素和甾醇已从云南广藿香并确定[17]. 我们从白头翁茎叶中提取并分离出两种甲基水杨酸苷云南广藿香有趣的是，有两种化合物的化学结构与水杨酸相似。两种水杨酸甲酯糖苷，如图所示图1，是苯甲酸甲酯-2-哦-β-D类-吡喃木糖基（1-6）-哦-β-D类-吡喃葡萄糖苷（J12122）和苯甲酸甲酯-2-哦-β-D类-木吡喃糖（1-2）[哦-β-D类-木吡喃糖（1-6）]-哦-β-D类-吡喃葡萄糖苷（J12123），。在本研究中，我们旨在研究这两种水杨酸衍生物对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞的抗炎活性。

2.结果和讨论

2.1. 化合物

从中提取水杨酸甲酯糖苷云南广藿香我们研究所植物化学系。简单地说云南广藿香用95%乙醇煮沸提取三次。乙醇蒸发后真空中，用水稀释水残渣。用水和30%乙醇-水依次分离滤液，得到A组分₁-A类₂A部分₂在硅胶上用CHCl进行柱层析_三-甲醇-H₂O（8:2:0.2）提供水杨酸甲酯苷。用乙醇重结晶后，得到两个糖苷，并鉴定为苯甲酸甲酯-2-哦-β-D类-木吡喃糖（1-6）-哦-β-D类-吡喃葡萄糖苷（J12122）和苯甲酸甲酯-2-哦-β-D类-木吡喃糖（1-2）[哦-β-D类-木糖基吡喃（1-6）]-哦-β-D类-吡喃葡萄糖苷（J12123）。

我们首先使用MTT分析检测了J12122和J12123在几种浓度（0.1–100μg/mL）下的细胞毒性作用。结果表明，两种化合物在培养24小时后均不影响RAW264.7细胞的活性（数据未显示）。

图1。化合物J12122和J12123的结构云南人参。

2.2. 促炎细胞因子的产生

脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是一种来源于革兰氏阴性菌膜的典型内毒素，可直接激活巨噬细胞，触发促炎介质的产生，如TNF-α、IL-1β和IL-6[18,19]. LPS作用于巨噬细胞，随后释放TNF-α，分泌的TNF-β或LPS进一步诱导细胞释放IL-1β和IL-6[20]. 在这里，通过使用ELISA法在单独用LPS（0.5μg/mL）处理的RAW264.7细胞或用不同浓度的J12122或J12123预处理的细胞的培养基上测量细胞因子的产生。图2结果表明，用LPS处理细胞后，在12小时内显著增加了TNF-α和IL-6的细胞因子产生量，在18小时内显著提高了IL-1β的细胞因子生成量。带有J12122或J12123的预培养细胞剂量依赖性地抑制了生成。J12122和J12123对促炎细胞因子的详细抑制作用总结如下表1研究结果表明，J12122和J12123均通过抑制促炎因子的产生而发挥抗炎作用。这一发现部分解释了我们之前的研究结果，即J12122对巴豆油诱导的小鼠耳肿胀具有显著的抗炎作用[21]。

图2。J12122和J12123对LPS诱导的RAW264.7细胞产生TNF-α、IL-6和IL-1β的影响。(A类)肿瘤坏死因子-α(B类)IL-6和(C类)培养基中IL-1β的含量。

表1。J12122和J12123对RAW264.7细胞中促炎细胞因子的抑制作用。

**表1。**J12122和J12123对RAW264.7细胞中促炎细胞因子的抑制作用。
促炎细胞因子	抑制J12122（%）			抑制J12123（%）
促炎细胞因子	0.3微克/毫升	1.0微克/毫升	3.0微克/毫升	0.3微克/毫升	1.0微克/毫升	3.0微克/毫升
肿瘤坏死因子-α	11.21 ± 2.08	32.69 ± 3.29	56.46 ± 2.98	18.37 ± 2.44	39.92 ± 3.09	57.16 ± 6.32
IL-1β	53.58 ± 3.56	64.40 ± 7.34	75.67 ± 8.02	54.47 ± 6.98	56.93 ± 4.51	74.33 ± 7.86
白介素-6	61.81 ± 4.01	71.26±6.46	73.15 ± 4.37	39.83 ± 5.42	53.92 ± 6.72	58.73 ± 6.78

数据表示三个独立实验的平均值±S.D。

2.3. NO产生的影响

NO作为重要的促炎因子之一，在免疫调节和炎症过程等多种生理和病理生理条件中发挥作用[22]. NO合成的诱导已被确定为巨噬细胞对炎症刺激的主要反应之一，即产生过量的NO[23]. 虽然生理性NO产生具有有益的杀菌、抗寄生虫和抗肿瘤作用，但iNOS产生的过量NO是炎症疾病的介质，并通过产生反应性自由基导致细胞损伤[24,25,26]. 为了评估J12122和J12123对LPS诱导的RAW264.7细胞的影响，我们检测了NO的生成。结果表明，与对照相比，LPS处理使NO生成增加了12倍，而J12122或J12123处理显著抑制了NO生成(图3). 在1.0μg/mL和3.0μg/mL浓度下，J12122抑制LPS处理的RAW264.7细胞NO积累45.90%和56.20%，J12123分别为37.45%和51.72%。

图3。J12122和J12123对LPS刺激的NO积累的抑制作用。

2.4. 活性氧生成的影响

活性氧与多种病理状态的发生或加重有关[27]. 炎症部位单核细胞/巨噬细胞过度产生活性氧影响炎症过程[28]. 活性氧强烈影响炎症前表达和NF-kB活化[29]. 因此，活性氧在炎症疾病的发展中发挥着重要作用。为了确定J12122和J12123对细胞内ROS激活炎症的影响，在有或无J12122或J12123的RAW264.7细胞中检测LPS诱导的ROS水平。与未经LPS处理的细胞相比，LPS诱导的ROS生成显著增加。如所示图4J12122或J12123显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞ROS生成。

图4。J12122和J12123对LPS刺激的ROS水平的抑制作用。

3.实验

3.1. 化学和生物材料

除非另有规定，否则所有化学品均购自Sigma–Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）、胎牛血清和抗生素-抗真菌溶液购自Gibco（新西兰奥克兰）。TNF-α、IL-1β和IL-6的ELISA试剂盒来自中国北京佳美生物科技有限公司。苯甲酸甲酯-2-哦-β-D类-木吡喃糖（1-6）-哦-β-D类-吡喃葡萄糖苷（J12122）和苯甲酸甲酯-2-哦-β-D类-木吡喃糖（1-2）[哦-β-D类-木吡喃糖（1-6）]-哦-β-D类-吡喃葡萄糖苷（J12123）由中国医学科学院药物研究所提取和分离。

3.2. 细胞培养

将RAW 264.7小鼠巨噬细胞细胞系（ATCC TIB-71；美国型培养物收集中心，美国弗吉尼亚州马纳萨斯市）培养在添加了10%热灭活胎牛血清（FBS）、2 mM的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中我-谷氨酰胺、100 IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素在37°C培养箱中，5%CO₂在所有实验中，细胞生长到80-90%的汇合处，不超过20代。在存在或不存在J12122（0.3、1.0和3.0μg/mL）或J12123（0.3、1.0和3.0μg/mL）的情况下，用LPS（0.5μg/mL）刺激细胞，以测量TNF-α、IL-6和IL-1β、NO和ROS的促炎介质的产生。使用微板分光荧光计（美国加利福尼亚州门洛帕克，分子器件5）测定吸收值和荧光强度。

3.3. 植物材料

本研究中使用的植物材料于2004年4月至9月从中国云南省大理市收集。该植物由中国科学院昆明植物研究所杨崇仁博士鉴定和认证。制作凭证标本（编号：Z040901），保存于中国医学科学院本草研究所和北京协和医学院标本室。

3.4. 细胞活性测定

如前所述，通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）测定测定细胞活力[30]. RAW 264.7细胞以10的密度接种⁴96 well板中每孔的细胞数，以确定任何潜在的细胞毒性。将细胞血清饥饿12小时，然后用J12122或J12123（0.1–100μg/mL）处理接下来的24小时。计算细胞活力百分比以评估J12122和J12123对RAW264.7细胞的毒性。

3.5. 酶联免疫吸附试验

Raw264.7细胞在96个培养板（1×10）中培养⁴细胞/mL），并与J12122（0.3、1.0和3.0μg/mL）或J12123（0.3、1.0和3.0μg/mL）预孵育1h，与LPS（0.5μg/mL）连续孵育12h（TNF-α和IL-6）或18h（IL-1β）。根据制造商的说明，使用抗小鼠TNF-α、IL-1β或IL-6抗体和生物素化二级抗体，通过ELISA测定培养基中的TNF-β、IL-1α和IL-6含量。在450 nm处测量每个孔的光密度。抑制率（%）使用以下公式计算：

3.6. NO释放的测量（通过Griess分析）

通过测量培养基中亚硝酸盐的含量来监测NO的生成。用J12122或J12123预处理RAW 264.7细胞1小时，并在培养12小时后用LPS刺激。使用Griess分析法，通过光度法定量细胞培养上清液中产生的稳定亚硝酸盐的数量[31]. 每个实验至少重复进行四次，并与针对不同浓度亚硝酸钠绘制的标准曲线进行比较。抑制率（%）使用以下公式计算：

3.7. 活性氧（ROS）的产生

如前所述，通过用荧光探针2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）培养细胞来测量细胞内ROS的产生[32]. RAW 264.7细胞接种（1×10⁴96孔板中的细胞/孔），并在LPS刺激12小时之前，用增加浓度的J12122或J12123处理1小时。然后，添加DCFH-DA（10μM）以额外培养45分钟。当样品在488 nm激发时，测量二氯荧光素的积累，作为525 nm荧光的增加。抑制率（%）使用以下公式计算：

3.8. 统计分析

结果表示为至少三个实验的平均值±S.D。采用单因素方差分析和Student t检验评估配对人群的统计显著性。假设平均值之间的差异为0.05或更低的P值。

4.结论

总之，我们的研究表明，从中草药中分离出的天然水杨酸衍生物水杨酸甲酯糖苷具有抗炎活性，其原因是抑制促炎细胞因子（如TNF-α、IL-1β和IL-6）、NO和ROS的产生。我们的研究结果显示，这些水杨酸甲酯苷对炎症的抑制作用可能有助于理解水杨酸甲酯苷的主要药理作用和抗炎作用透骨香（法语）Rehder.更重要的是，本文的研究结果表明，水杨酸甲酯糖苷化合物可能是潜在的抗炎先导物。这也暗示了新的抗炎药先导物的发现，特别是从天然产物中发现，可能是一条宽阔的道路。

致谢

本研究得到了国家科技重大专项“重大新药创制”（No.2009ZX09102-034）、国际科技合作项目（2009DFA32010）和国家自然科学基金（No.81073120）的支持。

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样品可用性：作者提供的样本。

分享和引用

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