永生间充质基质细胞衍生的细胞外囊泡中的N-聚糖对EV-细胞相互作用和内皮细胞功能激活至关重要

摘要

间充质基质细胞衍生细胞外囊泡（MSC-EV）由于其免疫调节和再生特性，被广泛认为是MSC细胞给药的无细胞治疗替代物。然而，EV与靶细胞之间的相互作用机制尚未完全了解。表面聚糖可能是EV-细胞通讯中的关键角色，是目前还很少探索的特定分子识别模式。在本研究中，我们重点研究了MSC-EV的N-糖基化作为MSC-EV介导物和内皮细胞相互作用在随后EV摄取和诱导细胞迁移和血管生成中的作用。为此，通过大小排阻色谱（SEC）分离永生化沃顿凝胶MSC（iWJ-MSC-EV）中的EV，并用糖苷酶PNGase-F处理以去除野生型N-聚糖。然后，使用HUVEC在体外捕获、琼脂糖斑点迁移和基于基质的试管形成分析的背景下测试CFSE标记的iWJ-MSC-EV。因此，我们发现iWJ-MSC-EV中的N-糖基化对与HUVEC细胞的相互作用至关重要。HUVEC捕获iWJ-MSC-EV，刺激其管状形成能力，促进其招募。相反，通过PNGase-F处理去除N-聚糖会降低天然iWJ-MSC-EV诱导的所有这些功能活性。最后，iWJ-MS-EV和PNGase-F处理的iWJ-MS-EV的比较凝集素阵列发现表面糖基化模式存在显著差异，尤其是在N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖、，和岩藻糖结合凝集素。综上所述，我们的结果强调了MSC-EV中N-聚糖对EV-细胞相互作用和相关功能的重要性。

1.简介

间充质基质细胞衍生的细胞外囊泡（MSC-EV）已经在许多临床前模型中证明了其对炎症的有效调节和再生特性的发挥[1]和临床试验[2]. 然而，MSC-EV的具体作用机制尚不清楚。

在这种情况下，人们普遍认为EV货物（脂质、RNA和蛋白质）可以通过内吞作用（网格蛋白依赖性或小窝蛋白依赖性）穿梭到靶细胞[三,4,5,6]，吞噬作用[7]，大胞饮症[8]或在酸性pH条件下，当EV和细胞的质膜表现出相同的流动性时，通过血浆/内膜融合[9]. 此外，已经证实，这种囊泡内容物的转移在包括血管生成在内的几个生物过程中的细胞间通讯中起着关键作用[10,11]，细胞迁移[12]、炎症调节[13,14]，成骨[15]或神经间通讯[16]. EV的转录组学、蛋白质组学和脂质组学特征已被广泛研究，以发现与EV与细胞相互作用有关的分子[17]. 然而，EV识别的具体机制及其随后被靶细胞捕获的具体机制仍然没有完全阐明。

聚糖在非EV相关研究中的重要细胞机制中的意义，如细胞粘附[18,19]自我和非自我识别[20,21]分子贩运和受体活化使聚糖成为分子研究的新热点，在其中寻找EV功能和靶向的可能机制。在这方面，一些研究（在[22,23])已经报道了EV聚糖谱分析或以聚糖依赖方式摄取EV的特定受体-配体相互作用。其中大多数涉及癌症衍生的EV、尿液EV或血浆EV。具体而言，硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）与CHO细胞摄取肿瘤衍生的EV有关[4]以及肝星状细胞的旁分泌相互通讯[24]. 唾液酸残基也参与了体外EV-摄取[25,26]和体内[27]这些唾液酸残基的消耗也表明可以改变小鼠体内EV的生物分布[28]强调了蛋白质和脂质糖基化在EV靶向中的重要性。

因此，在本研究中，我们旨在评估MSC-EV N-糖基化在EV-内皮细胞相互作用、EV-摄取以及MSC-EV描述的特定功能（如内皮细胞募集和管状形成刺激）中的意义。我们的结果表明，通过PNGase-F处理MSC-EV去除N-糖基化会影响HUVEC的捕获和功能。

2.结果

2.1. iWJ-MSC-EV的分离与表征

对分离的iWJ-MSC-EV进行MSC标记CD90、EV标记CD63和CD9的筛选。iWJ-MSC-EV的SEC洗脱曲线，用PNGase-F处理或不处理(图1A） ，显示EV洗脱与EV处理不明显。EV在4-6组分中检测到，与蛋白质很好地分离，随后洗脱，证实了先前发表的结果[29]. 然而，我们观察到，在添加PNGase-F后，所有三个标记物的MFI表达均降低，特别是影响CD90（CD9:33%，第页< 0.05; CD63:24%n.s；CD90:75%，第页< 0.0001;n个= 3;图1B） ，这可能指示N-糖基化敏感的表位。将含有iWJ-MSC-EV的组分汇集在一起，并通过低温电子显微镜进行分析，证实iWJ-MS-EV和iWJ-MSC-EV PNGase-F均具有双层膜、纳米尺寸和圆形(图1C） ●●●●。还对iWJ-MSC-EV和iWJ-MS-EV PNGase-F进行了calnexin和ezrin标记筛选。calnexin斑点杂交显示EV样本中没有重要的内质网污染，ezrin在iWJ-MSC-EV两种类型中均呈阳性(图1D） ●●●●。

2.2. N-糖基化对HUVEC摄取iWJ-MSC-EV至关重要

为了研究iWJ MSC EV的N-糖基化在EV与内皮细胞相互作用的生理学中的作用，我们首先通过流式细胞术评估了EV的摄取。HUVEC与CFSE标记的iWJ-MSC-EV孵育导致细胞荧光增强，而与iWJ-MSC-EV相比，与PNGase-F处理的EV孵育的HUVEC显示EV摄取显著减少约50%(第页< 0.05;n个= 4) (图2A、 B）。流式细胞术结果通过荧光显微镜进一步证实。我们的结果显示，捕获未经处理的EV后，HUVEC细胞质中出现了特异性绿色荧光（CFSE-EV）。量化后，HU VEC对未经处理EV的摄取在每个细胞的平均强度和自荧光校正后的每个细胞的绿色面积方面均显著。对照组（无EV）和经PNGase-F处理的EV中仅观察到背景荧光，而未经处理的EV则相反，这表明EV的PNGase-F处理消除了捕获(第页< 0.0001) (图2C、 D）。这些数据表明EV N-聚糖介导与HUVEC的相互作用。

2.3. PNGase-F治疗抵消了iWJ-MSC-EV招募HUVEC

先前的研究表明，猪MSC-EV有能力诱导异基因MSC和内皮祖细胞的细胞募集[30]. 因此，我们接下来研究了EV表面N-聚糖的潜在作用，以调节同种HUVEC对含有两种iWJ-MSC-EV的琼脂糖斑点的趋化反应。

与对照PBS或PNGase-F处理的EV包埋琼脂糖点相比，iWJ-MSC-EV包埋琼脂点诱导HUVEC细胞募集(图3A、 B），都是在迁移距离方面（减少20%；第页<0.05 HUVEC）和细胞所占总面积（减少45%；第页< 0.01). 含有PNGase-F处理EV的琼脂糖斑点中的迁移水平下降到接近阴性对照水平。

2.4. iWJ-MSC-EV促进的管状结构依赖于N-糖基化

为了进一步研究N-聚糖对EV功能的功能参与，在体外测量了HUVEC的原始血管生成能力。显微镜图像显示，与阴性对照组相比，iWJ-MSC-EV以剂量依赖性的方式增强了培养6 h时试管的形成，并且与阳性对照组的VEGF-a 10 ng/mL（VEGF）的形成程度相当(图3C、 D）。PNGase-F处理的EV未能诱导试管形成，这表明N-糖基化也在这一功能中发挥作用。与PNGase-F处理的EV相比，添加iWJ-MSC-EV后，节点数和总分支长度都显著增加(图3D） ●●●●。这种减少尤其影响了节点数（85%），并且在较小程度上影响了总分支长度（70%）。

2.5. iWJ-MSC-EV和PNGase-F-处理的iWJ-MS-EV显示出不同的表面糖基化轮廓模式

鉴于在这些功能分析中，N-糖基化对iWJ-MSC-EV的隐含重要性，建立了一个由26种凝集素组成的凝集素微阵列分析，以发现iWJ-MS-EV中存在哪种类型的糖基化特征，这些特征受PNGase-F治疗的影响。iWJ-MSC-EV显示N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）结合凝集素小麦胚芽凝集素（WGA）的高荧光信号，大蒜（ASA），块茎茄（STL）和蓖麻（RCA）；以及N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）结合凝集素多花蟹（CFL）。岩藻糖结合凝集素的结合力较低豌豆（PSA）和烹饪镜头（生命周期评价）；甘露糖结合凝集素多花黄精（PMA）；以及含有唾液酸或O-聚糖（T抗原）的聚糖含量极低。不存在含有α-半乳糖残基的聚糖(图4A） ●●●●。相反，PNGase-F处理的EV对其中一些凝集素的结合信号降低。特别是，在GlcNAc-结合凝集素（ASA和RCA）、甘露糖结合凝集剂（PMA）和岩藻糖结合凝集素（AAL、PSA和LCA）中观察到减少(图4C） ●●●●。PNGase-F处理后信号的强烈下降表明，大多数糖苷残基存在于N-聚糖上，酶消化是成功的。然而，其他GlcNAc结合凝集素（WGA和STL）、所有GalNAc结合凝集素（Moa、CFL、DBL和WFL）、所有唾液酸结合凝集剂（SNA、MAL-I、SSA）和T抗原结合凝集物（ABL、ACA、BS-II）在天然EV-糖基化水平上保持结合荧光信号(图4B） ●●●●。

3.讨论

在本报告中，我们描述了N-糖基化在MSC-EV中的关键作用。MSC-EV因其适当的特性而被潜在地探索为治疗药物[31]. 他们已经在几个动物模型中显示了体内炎症病理的调节（在[1,32])以及在人体临床试验中（在[2]). 然而，EV的作用机制仍未完全阐明。此外，EV与细胞的相互作用对科学界来说仍然是一个挑战，许多蛋白质被提议参与其中，例如四spanins、整合素或凝集素。具体而言，抗体介导的CD9和CD81四spanins阻断显示树突状细胞对EV的摄取减少[33]. 同样，抗整合素或凝集素的抗体，如CD11a或DC-SIGN，也显示出同样的效果[33,34]. 在过去的几年里，允许表征聚糖结构的工具和技术的发展，如凝集素糖阵列[35]，质谱[36]细胞外囊泡中聚糖的综合磁性分析（IMAGE[37])使用静电排斥-亲水相互作用色谱法（PUC-ERLIC[38])，允许对聚糖结构进行彻底检查，例如覆盖EV表面的大量糖复合物（蛋白聚糖、糖蛋白）[39]. 这些研究表明，分子的糖基化模式可能是EV与细胞相互作用的原因。因此，在本研究中，我们研究了N-糖基化在MSC-EV捕获和功能中的作用。我们还对完整MSC-EV和PNGase-F处理的MSC-EV的聚糖谱进行了表征。

PNGase-F处理去除MSC-EV N-糖基化后，EV-细胞相互作用和HUVEC摄取减少，表明MSC-EV N糖基化在这些识别和内化过程中起着关键作用。这些结果与之前关于抑制蠕虫病原体捕获的观察结果一致，肝片吸虫-PNGase-F处理后巨噬细胞产生的EV[40]以及改变肿瘤特异性血源微泡的功能[41]. 然而，在肝细胞系衍生的EV中[26]和从脑介导的BMD2a细胞中分离出的EV[42]，N-聚糖的裂解导致摄取增加，表明EV-聚糖具有EV源特异性，可能调节相互作用和组织靶向性。事实上，一些研究已经表明，EV糖基化修饰可以改变其在小鼠模型中的生物分布[28,42].

EV刺激细胞迁移的能力已经被几个研究小组针对不同的细胞来源进行了报道。癌细胞衍生的EV被证明可以调节转移细胞的扩散模式[43]尤其是，MSC-EV可以通过CXCL5和CXCL6/CXCR2轴刺激软骨细胞和滑膜MSC的迁移[12]. 然而，这些研究均未提及聚糖依赖性机制。正如我们之前在使用前体内皮细胞的猪模型中所证明的那样[30]MSC-EV具有招募内皮细胞的能力。此外，在这里我们展示了iWJ MSC EV N-糖基化在这一关键过程中的重要作用。只有含有天然EV的琼脂糖点具有更强的HUVEC招募能力，而含有PNGase-F处理的iWJ-MSC-EV的琼脂酶点的迁移诱导减少了一半。然而，在我们的环境中，受影响最大的功能是血管生成。在这方面，在PNGase-F处理的iWJ-MSC-EV中，HUVEC的管状形成被显著抑制。这些不同程度的矫揉造作可能表明N-聚糖可能不同地参与这些功能。PNGase-F处理的EV存在时，节点数量减少，这证明了HUVEC难以建立细胞间相互作用，蛋白质N-糖基化在促进这些接触中的重要性，以及EV–HUVEC's受体相互作用的可能消除，这种相互作用负责血管生成诱导。MSC-EV诱导血管生成的机制与血管内皮生长因子（VEGF）途径有关。发现小鼠MSC-EV携带VEGF，并促进小鼠内皮细胞中VEGF受体1和2的表达，刺激其他促血管生成途径，如SRC、AKT和ERK[44]. 在这种情况下，硫酸乙酰肝素蛋白多糖与聚糖相关，可以增强血管内皮生长因子（VEGF）的细胞膜对接位点[45]. 此外，一些酪氨酸激酶受体（RTKs）的几种配体，如VEGFR，都需要N-聚糖[46,47,48]. 总之，这些观察结果表明VEGFR以聚糖依赖的方式激活，可以解释血管生成刺激。

鉴于MSC-EV N-糖基化对其摄取和功能的影响，我们进一步分析了两种MSC-EV的聚糖谱，以确定哪些是受PNGase-F处理影响的聚糖结构。我们的凝集素糖阵列显示，完整的MSC-EV主要富集于GlcNAc和GalNAc；岩藻糖基聚糖和高甘露糖聚糖含量较低，唾液酸和T抗原几乎未发现。相反，其他报道MSC-EV糖基化模式的研究发现了完全不同的情况，尤其是唾液酸[25,49]. 此外，在不同来源的MSC中报告了不同的模式[50]. 这些证据支持同一细胞类型或组织的不同来源可能有自己的聚糖谱。这些结果，再加上来自其他来源（癌症、尿液和血浆）的EV的聚糖多样性，表明EV来源的聚糖具有特异性。然而，重要的是，这种多样性也可能归因于所使用的电动汽车隔离方法的类型。事实上，已经证明EV分离策略可以直接影响最终的EV糖基化模式[51].

与野生型EV相比，经PNGase-F处理的EV导致上述大多数聚糖的数量减少。酶处理的其他证据是所分析的所有EV标记物（即CD9、CD63、CD90）的减少，表明存在PNGase-F的敏感表位。事实上，糖基化引起的抗体结合改变已经有报道[52,53]. 受PNGase-F处理影响的聚糖的高度多样性妨碍了对所分析功能中涉及的特定靶点的任何识别。从这个意义上讲，质谱分析可能有助于发现这些聚糖的分子特性，区分与这些残基相关的N-聚糖和O-聚糖，并确定哪些与蛋白质相关。

总之，我们的数据显示了MSC-EV表面N-聚糖在其摄取和与靶HUVEC相互作用中的关键作用，进而影响细胞功能。聚糖在这些关键生物过程中的意义表明，MSC-EV中聚糖谱的修饰可能是改变EV-靶细胞相互作用动力学以用于未来治疗的一种可能方式。

4.材料和方法

我们机构的临床研究伦理委员会（德国Trias i Pujol大学医院；EO-10-016和EO-12-022）批准了所有人体样本研究方案，并符合赫尔辛基宣言中概述的原则。

4.1. 细胞培养

MSC在T-175烧瓶中培养，培养基为完整的α-最低必需培养基（α-MEM；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA），补充有10%热灭活胎牛血清（FBS；Life Technologies，Carlsbad，CA，USA；2 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素（P/S；Gibco Invitrogen Corp.，Carlsba，CA，US）；5%CO时₂和37°C。

如前所述，分离沃顿凝胶衍生MSC（WJ-MSC）[29]. 简单地说，在父母同意的情况下，在出生后获得新鲜脐带，并将其保存在磷酸盐缓冲盐水缓冲液（PBS；Gibco Life Technologies/Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）中，补充5000 U肝素（Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA^三部分，用PBS清洗并机械破坏。接下来，进行两次酶消化，将获得的两种上清液混合在一起并离心。最终将细胞颗粒悬浮在完整的α-MEM中，并通过塑料黏附选择MSC进行培养。

为了减少批次间的差异，来自三名具有免疫抑制能力的捐赠者的WJ-MSC[29]按照先前公布的方案，通过hTERT和SV40转导永生化[54]，在此称为iWJ-MSC。

简单地说，将Phoenix AMPHO细胞接种至50%融合处，并使用DNA和磷酸钙沉淀法转染hTERT和SV40早期区域构建物。混合物（DNA、CaCl₂溶液、无菌水和2×HBS溶液）加入细胞中，并在37°C下孵育过夜或在37°C下在10µM氯喹存在下孵育8小时。用新鲜培养基代替转染培养基。24小时后，收集含有逆转录病毒颗粒的细胞上清液，通过0.45µm过滤器，并添加1µg/mL聚溴乙烯。最后，用从Phoenix AMPHO培养物中提取的滤过的病毒上清液替换培养基，并在750×克32°C时。离心后，去除培养基并添加新鲜的α-MEM培养基。每隔24小时重复感染程序两次。最后，用50µg/mL Geneticin（G418）和50µg/mL Hygromicin（Gibco Life Technologies/Invitrogen）选择iWJ-MSC细胞。

人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在内皮生长培养基（EGM-2）（瑞士巴塞尔Lonza）中，在预先涂有0.05%明胶A（Sigma-Aldrich）的6孔板中培养；CO的5%₂和37°C。

4.2. EV隔离

按照之前公布的方案，通过尺寸排除色谱法（SEC）从细胞培养上清液中分离EV[55]. 首先，将血清衍生的牛EV在聚异氰酸酯超速离心管（Thermo Fisher Scientific，San Diego，CA，USA）中用2×完全培养基超速离心，以100000×克在索瓦尔WX Ultra 100系列超离心机（赛默飞世尔科学）中超过16小时（TH641转子，调整后的k系数=24082）。然后使用0.22μm过滤器对上清液进行消毒（Starsted，Nümbrecht，Germany），并用α-MEM稀释成1×工作溶液用于细胞培养。

对于EV生产，MSC在T-175烧瓶中培养，直到达到汇合（10⁷细胞），然后用15 mL 1×克超速离心培养基。48小时后，收集条件培养基（CM），并在400×克在2000×克为了获得浓缩CM（CCM），CM在2000×克使用100-kDa Amicon Ultra离心过滤器（Millipore，Billerica，MA，USA）过滤40分钟。然后，使用装在SEC柱上的1mL Sepharose CL-2B（Sigma-Aldrich）通过SEC分离EV，并与PBS平衡。然后，将100μL CCM加载到柱上，使用无菌1×PBS作为洗脱缓冲液，收集20个100μL级分。

最后，用基于珠的流式细胞仪测定含EV的组分，并通过在纳米滴分光光度计（Thermo Fisher Scientific）中读取280 nm处的吸光度来检查蛋白质洗脱。将含EV的馏分混合在一起，用于进一步的实验。

4.3. iWJ-MSC-EV的PNGase-F处理

通过与酶PNGase-F孵育去除iWJ-MSC-EV的表面N-聚糖。具体而言，在100µL CCM中添加10 U PNGase-F（N-糖苷酶F；罗氏诊断有限公司，德国曼海姆），并在37°C下孵育18小时，然后分离EV。该酶通过iWJ-MSC-EV下游SEC纯化被清除。

4.4. EV染色

荧光标记的iWJ-MSC-EV用于跟踪目的。简单地说，用20µM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE；eBioscience）对100μL CCM进行染色^TM公司，Invitrogen）在37°C下持续2小时[56]在EV隔离之前。CFSE多余的染料通过标记EV的下游SEC纯化进行清洗。

4.5. 基于珠的流式细胞术

使用基于珠的流式细胞术检测SEC组分中EV的存在[55]. 首先，将20μL的SEC组分与4μL的4μm醛/硫酸盐微球（Invitrogen-Thermo Fisher Scientific）偶联，在室温（RT）下培养15分钟，然后在1 mL BCB缓冲液（PBS、0.1%牛血清白蛋白（BSA）和0.01%叠氮化钠（NaN_三); Sigma-Aldrich）旋转2小时。接下来，在2000×克10分钟，并重新悬浮在BCB缓冲区中。抗体标记是通过与荧光结合抗体抗CD90-PE-Cy7（1:50；BD，San Diego，CA，USA）孵育（RT时30分钟）或间接标记一级抗体抗CD63（1:10，克隆TEA3/18）和抗CD9（1:10、克隆VJ1/20.3.1）来进行的，然后在CFSE标记的EV中与二级抗体FITC-结合的山羊F（ab'）2抗鼠IgG（1:100；加拿大哈利法克斯的Bionova）或Alexa647-结合的驴F（ab'2抗鼠-IgG（1:100；英国伊利的Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.）孵育。每次孵育后，用BCB缓冲液在2000×克最后，在FACSLyric流式细胞仪（BD）中采集数据，并使用FlowJo v10.2软件（FlowJo，LLC，美国俄勒冈州阿什兰市）进行分析。

4.6. 斑点印记

用斑点杂交法检测阴性对照标记calnexin和EV阳性标记ezrin。简单地说，将2µL EV样品或细胞裂解物作为对照点放置在硝化纤维素膜上（德国达塞尔Whatman Protran）。接下来，在室温下将膜的非特异性位点在BSA/TBS-T（0.1%BSA溶于20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，pH 7.5+0.05%Tween20）中封闭30分钟。用主要抗体calnexin（1:250，SC-23954；Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Dallas，TX，USA）和ezrin（1:5000，ab40839；Abcam，Cambridge，UK）培养在RT和轮换条件下进行1小时，然后用二级抗体IRDye800结合山羊F（ab'）2抗鼠IgG（1:15000；美国东北部林肯的LI-COR生物科学）和IRDye680结合山羊F。每次孵育后，用TBS-T旋转清洗膜10分钟。最后，使用Odyssey CLx扫描仪（美国东北部林肯市LI-COR生物科学公司）对膜进行扫描。

4.7. 冷冻电子显微镜

如前所述，使用透射电子显微镜（Joel JEM 2011，日本东京），通过低温电子显微镜（cryo-EM）分析玻璃化EV池中EV的大小和形态[29].

4.8. iWJ MSC EV捕获分析

首次通过流式细胞术在HUVEC中评估iWJ-MSC-EV的捕获。在96个预先涂有0.05%明胶A（Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA）的平板中播种总共50000个HUVEC，培养24小时以确保粘附和稳定。CFSE标记的iWJ-MSC-EV（从5×10⁵添加预处理或未使用PNGase-F处理的生产细胞）。培养1 h后，用100µL PBS洗涤细胞两次并进行胰蛋白酶处理。将细胞重新悬浮在100µL EGM-2中，并在Canto II流式细胞仪（BD）中获得。最后，使用FlowJo软件（10.6.2版）作为CFSE的百分比，分析EV捕获⁺细胞。还进行荧光显微镜检查以确认流式细胞术结果。在这种情况下，将50000个HUVEC接种在0.05%明胶预涂µ-载玻片VI 0.4（Ibidi，Gräfelfing，德国）的每个通道中，并培养过夜以确保粘附。如前所述，添加了经PNGase-F处理或未经处理的CFSE标记的iWJ-MSC-EV。培养1小时后，用100µL PBS清洗细胞四次，并使用Axio-Observer Z1共焦显微镜（德国奥伯科钦蔡司）拍摄荧光图像。采用40倍油放大率分析EV捕获，捕获红色（自动荧光控制）和绿色（CFSE-EV）荧光信号，并使用相位对比度确定细胞边缘和数量。荧光定量使用斐济软件（ImageJ，NIH）进行。由于CFSE-EV荧光非常微弱，绿色荧光的阈值降低，从而增加了HUVEC细胞的自身荧光。因此，为了区分自荧光和特定的CFSE-EV荧光，与红色荧光共定位的绿色荧光被视为自荧光，而没有共定位的绿荧光被计为特定的EV荧光（EV捕获）。简单地说，为了获得特定的CFSE-EV绿色荧光，用红色荧光（R）对每张照片的绿色荧光（G）平均值进行归一化。如果G/R比低于对照组（单独的HUVEC）的平均G/R比，则绿色区域和平均绿色荧光被认为是0。所有高于对照组平均G/R比值的信号均被视为特定绿色CFSE-EV荧光。

4.9. 琼脂糖斑点迁移试验

细胞迁移在琼脂糖斑点中使用之前描述的方案进行测量[57]. 首先，将6孔板的孔分成四个绘制象限，并预先涂上10µg/mL纤维连接蛋白（德国达姆施塔特默克米利浦），以确保HUVEC与塑料的粘附。然后，将三点5μL 0.5%低熔点琼脂糖（40°C，Ecogen，Barcelona，Spain）与PBS（用作缓冲液）或iWJ MSC EV 1:1混合，用PNGase-F处理或不处理（从2.5×10⁵生产细胞），放置在不同象限的表面。接下来，将平板在4°C下培养15分钟，以确保琼脂糖凝胶化和粘附。那么，1×10⁵HUVEC接种在EGM-2培养基的每个孔上。将细胞在37°C下培养24小时，以允许细胞侵入凝固的琼脂糖滴。孵育后，用相位对比倒置显微镜在10倍物镜放大率（CKX41，Olympus Life Science，Center Valley，PA，USA）下拍摄每种条件下每个牢固附着的琼脂糖斑点的四张图像，并使用斐济软件（ImageJ，NIH）测量迁移。具体来说，使用公开的宏工具测量每个点的三个距离琼脂糖斑点极限最远的细胞的距离，以及迁移细胞占据的斑点的面积(https://imagej.nih.gov/ij/macros/SA_NJ.txt)（2019年9月26日访问）。

4.10. 基质试管形成试验

使用HUVEC在24孔板中测试管状地层能力。这些微孔预先涂有200µL Matrigel（美国纽约州科宁市），在RT下培养10分钟，在37°C下培养30分钟。然后，将15000个HUVEC/孔接种到不含VEGF的完整EGM-2中，用iWJ-MSC-EV从2.5×10⁵或5×10⁵产生细胞，用PNGase-F处理或不处理。VEGF-A（10 ng/mL，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）用作阳性对照。将细胞孵育6小时，并使用ImageJ–血管生成分析仪工具（ImageJ，NIH）拍摄和分析每个孔的图像。

4.11. 甘油三酯

EV的凝集素微阵列分析改编自先前发布的方法[26,58]. 使用NHS功能化玻璃载玻片（NEXTERION Slide H，SCHOTT，Jena，Germany）和0.5 mg/mL的凝集素溶液（在含有0.5%甘油和0.005%吐温-20的PBS印刷缓冲液中重组）制备阵列。使用sciFLEXARRAYER S11非接触式压电测点仪（德国柏林Science）打印每种凝集素0.67 nL的六个重复点，点之间的间距为0.30 mm。将凝集素斑点载玻片在相对湿度为50%和温度为18°C的印刷室中反应并干燥过夜，然后真空密封并在−20°C下储存。

为了进行分析，将EV在PBS中稀释至50μg/mL，并使用60μg/mL Alexa Fluor 647 NHS酯（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific）在室温下保持1小时。然后，使用1M Tris缓冲液在室温下将未反应的NHS染料再淬火1小时。对于与阵列的培养，在含有0.3 mg/mL BSA、0.1 mM CaCl的PBS中将标记的EV稀释至5μg/mL₂，0.1 mM氯化镁₂和0.005%吐温-20（“插管缓冲液”）。在使用当天从−20°C的储存中取出微阵列载玻片，在室温下用30 mM乙醇胺在硼酸盐缓冲液中淬火1 h，然后用培养缓冲液再平衡1 h。然后将EV与阵列在RT下孵育3小时，然后用PBS洗涤两次，通过离心干燥，并使用安捷伦G2565BA微阵列扫描仪（安捷伦科技，加州圣克拉拉，美国）在光电倍增管电压设置为最大值20%的条件下进行扫描。使用ProScanArray Express v4.0软件（PerkinElmer，Waltham，MA，USA）提取所有斑点的荧光强度。随后的数据处理是通过将每个点的荧光值归一化为每个阵列内的最高结合信号来进行的，然后再结合平均值和标准偏差的点复制。

4.12. 统计

数据显示为平均值（SD）。通过Shapiro–Wilk检验在所有数据集中检查数据的正态性，并对每个病例进行适当的统计检验。只有显著的统计差异(第页<0.05）。使用GraphPad Prism软件（9.0版）进行分析。