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第23卷
第1版
10.3390/ijms23010394
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第条

甲基汞半胱氨酸在BeWo细胞中的转运和毒性

通过
斯里维迪亚·加纳帕西
1，
伊丽莎·法雷尔
1，
西蒙·瓦格拉
1，
露西·乔西
1，
厄尔·G·福特四世
1，
奥尔加·乌恰基纳
1，
罗伯特·麦卡利普
1，
詹妮弗·巴金
2和
克里斯蒂·C·布里奇斯
1,*
1
美国佐治亚州梅肯市默瑟大学医学院生物医学系，邮编31207
2
美国佐治亚州梅肯市默瑟大学医学院社区医学系，邮编31207
*
信件应寄给的作者。
国际分子科学杂志。 2022，23(1), 394;https://doi.org/10.3390/ijms23010394
收到的提交文件：2021年7月21日/修订日期：2021年12月24日/接受日期：2021年12月27日/发布日期：2021年12月30日
（本条属于本节分子毒理学)
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版本注释

摘要

:
汞是一种普遍存在于环境中的重金属毒物。有机形式的汞，如甲基汞（MeHg），可穿过胎盘，对胎儿产生持续的有害影响。甲基汞对胎盘本身的毒性作用尚未明确界定。因此，本研究的目的是评估甲基汞向胎盘合胞体滋养层细胞的转运，并描述甲基汞发挥毒性作用的机制。这些研究使用了培养的胎盘合胞滋养层细胞（BeWo）。测量放射性甲基汞的转运，以确定该化合物吸收的潜在机制。通过评估可见的病理变化、自噬、线粒体活性和氧化应激来确定甲基汞对BeWo细胞的毒理作用。这项研究的结果表明，甲基汞化合物主要通过钠依赖性氨基酸载体和有机阴离子转运蛋白转运到BeWo细胞。甲基汞改变了线粒体功能和活力，减少了有丝分裂和自噬，增加了氧化应激。暴露于较高浓度的甲基汞会抑制细胞抵抗甲基汞诱导损伤的能力。研究结果表明，甲基汞对合胞体滋养层细胞具有直接毒性，并可能导致胎儿/母亲营养物质和废物转移的中断。

1.简介

汞是一种自然存在的重金属，在环境中普遍存在。虽然一些汞是从自然来源进入环境的，但环境汞的很大一部分是人为的，即人类活动的结果。燃煤发电厂和小规模手工金矿开采是环境汞的主要来源。大约80%的人为汞释放到空气中，随后沉积在土壤和水体中。土壤和水中的微生物将汞离子甲基化，形成甲基汞（MeHg）。甲基汞在水生物种中生物累积和生物放大，导致大型食肉鱼类肌肉组织中甲基汞含量较高。全世界大多数人接触甲基汞是通过摄入受污染的鱼类。考虑到这种有毒物质可能对发育中的胎儿产生潜在的有害影响，孕妇接触甲基汞尤其令人担忧[1]. 尽管有关于怀孕期间食用鱼类的警告，但汞仍在全世界孕妇的血液中检测到[2，三，4].
母体血液中的甲基汞很容易穿过胎盘并积聚在胎儿和胎盘组织中[5，6，7，8，9]. 胎儿大脑和神经系统对甲基汞特别敏感，在暴露于不会对母亲产生负面影响的甲基汞浓度后会出现损伤[10，11，12]. 有趣的是，脐血中甲基汞的浓度已被证明显著高于母体血液，这表明胎儿比母亲有更高的甲基汞中毒风险[13]. 胎儿接触甲基汞会导致许多有害影响，包括脑瘫、认知功能下降、构音障碍和斜视[11，12，13，14]. 由于甲基汞在整个环境中普遍存在，对胎儿健康有潜在危险，因此我们必须彻底了解胎盘处理汞离子的方式。
虽然这一区域在临床上很重要，但对甲基汞穿过胎盘的分子机制知之甚少。Kajiwara等人[14]据报道，甲基汞（MeHg-Cys）的半胱氨酸（Cys）结合物通过中性氨基酸载体（假设为系统L）从母体血液运输到胎盘合胞体滋养层细胞非洲爪蟾卵母细胞表明，MeHg-Cys是系统L、LAT1和LAT2两种亚型的底物[15]. 此外，对培养BeWo细胞的研究也表明，MeHg-Cys是LAT1和LAT2的底物[16，17]. 鉴于合胞体滋养层细胞中存在大量氨基酸转运蛋白[18]可能有许多不同的运输系统参与了甲基汞-半胱氨酸的吸收。因此，本研究的一个目标是验证以下假设：多个氨基酸转运系统参与了MeHg-Cys向合胞体滋养层细胞的顶端摄取。
虽然胎儿接触甲基汞的毒理学后果已有充分的记录，但关于甲基汞对胎盘细胞的毒性作用的信息很少。最近一项对胎盘滋养层的体外研究表明，接触甲基汞会导致氧化应激、细胞周期改变和细胞凋亡[19]. 虽然这项研究提供了一些关于甲基汞对胎盘细胞影响的重要信息，但我们认为暴露于甲基汞会对合胞体滋养层细胞产生额外的、未记录的毒理学影响。因此，本研究的另一个目标是确定甲基汞诱导胎盘合胞体滋养层细胞损伤和功能障碍的其他机制。

2.结果

2.1、。BeWo细胞对半胱氨酸和甲基汞半胱氨酸的摄取

钠依赖性摄取[35S] -随时间在BeWo细胞中测量胱氨酸(图1A） ●●●●。胱氨酸（Cys-Cys）由两个半胱氨酸（Cys）分子组成，在血浆中比Cys更稳定。胱氨酸是谷胱甘肽的关键成分，是胎儿正常发育所必需的。此外，血浆中胱氨酸的浓度高于胱氨酰[20]. 因此，我们评估了胱氨酸的摄取情况，以此作为正常细胞功能的衡量标准。胱氨酸的摄取在最初的30分钟内呈线性，之后开始稳定。钠依赖性摄取[三H] -还测量了蛋氨酸(图1B） ●●●●。蛋氨酸的摄取量小于胱氨酸，但摄取模式相似，在30分钟后开始稳定。
钠依赖性摄取[14摄氏度]-在BeWo细胞中测量60分钟的MeHg-Cys(图2A） ●●●●。与胱氨酸和甲硫氨酸一样，甲基汞Cys的摄取在30分钟后开始趋于平稳。在BeWo细胞中也评估了甲基汞Cys摄取的Michaelis–Menten动力学(图2B） ●●●●。V型最大值计算为5.3±2.2 mM，K米估计为1.1±0.7 mM。数据也绘制在Eadie–Hofstee图中，这表明至少有两个独立的运输系统参与了MeHg-Cys的钠依赖性吸收(图2B、 插图）。在钠离子依赖性条件下进行了MeHg-Cys摄取的底物特异性分析(图3A） 和钠依赖(图3B） 条件。在钠依赖和钠依赖条件下，由于存在各种未标记的有机阴离子和氨基酸（1 mM MeHg-Cys和胱氨酸；3 mM所有其他），MeHg-Cys的摄取显著减少。

2.2. 细胞活性和功能测定

采用MTT法测定BeWo细胞暴露于不同浓度MeHg-Cys 30分钟后的存活率(图4A） 或16小时(图4B） ●●●●。由于与较长暴露时间相关的细胞毒性，较长暴露时间的浓度低于较短暴露时间使用的浓度。暴露于100µM MeHg-Cys和较高浓度30分钟后，存活率显著下降。当细胞暴露于MeHg-Cys 16 h时，暴露于低至10µM浓度的MeHg-Cys后，观察到存活率显著下降。
在暴露于不同浓度MeHg-Cys的BeWo细胞中测量自噬小泡的形成(图5A） ●●●●。随着MeHg-Cys浓度的增加，BeWo细胞的自噬率显著下降。对照细胞中形成的自噬小泡的数量与暴露于50µM MeHg-Cys或更高浓度的细胞中的数量显著不同。为了证实自噬检测试剂盒的结果，我们还评估了编码自噬标记ATG13的mRNA的表达[21]. PCR分析表明，ATG13在暴露于各种浓度MeHg-Cys的细胞中的表达显著降低(图5B） ●●●●。有丝分裂标记物（PINK1，BNIP3L）[22，23]也使用定量PCR进行了测量。PINK1的表达(图5C） 暴露于MeHg-Cys后减少。BNIP3L(图5D） 当细胞暴露于5µM和25µM甲基汞Cys时，表达显著降低。然而，当细胞暴露于较高浓度（即50µM）时，BNIP3L的表达与对照细胞没有显著差异。蛋白质印迹(图5E） 显示ATG13、PINK和BNIP3的蛋白质水平。当细胞暴露于较高浓度的MeHg-Cys时，ATG13和PINK1蛋白水平降低。有趣的是，暴露于MeHg-Cys后，BNIP3的蛋白质水平增加。
对暴露于不同浓度MeHg-Cys的BeWo细胞进行病理学检查。用缓冲液处理的对照细胞作为完整的单层存在，没有损伤迹象(图6A） ●●●●。用100µM MeHg-Cys处理的细胞呈单层；然而，在单层表面发现了一些细胞质泡（白色箭头；图6B） ●●●●。此外，一些细胞被卷起并从单层细胞上脱落（黑色箭头）。当用250µM MeHg-Cys处理细胞时，许多细胞似乎被取整并分离（黑色箭头）。此外，单层表面有许多细胞质泡（白色箭头）。单分子膜中的间隙（*）在整个载玻片中都很明显(图6C） ●●●●。当用500µM MeHg-Cys处理细胞时，出现许多细胞质泡（白色箭头）。此外，许多细胞似乎是圆形的（黑色箭头），单层有许多缺失细胞的区域（*）。此外，在几个细胞中可以看到多个小而暗的结构（箭头）(图6D） ●●●●。这些结构可能是吞噬体、过氧化物酶体或溶酶体。
通过FACS测量DiOC6（3）的积累来评估线粒体膜电位的变化(图7A） ●●●●。数据以线粒体膜电位损失百分比表示。线粒体膜电位的损失与MeHg-Cys浓度的增加呈正相关。在暴露于不同浓度MeHg-Cys的BeWo细胞中也测量了细胞内ATP浓度(图7B） ●●●●。随着MeHg-Cys浓度的增加，细胞内ATP浓度显著降低。
用MeHg-Cys处理的BeWo细胞中丙二醛（MDA）的含量作为脂质过氧化的指标(图8)。用1mM或5mM MeHg-Cys处理细胞后，MDA浓度显著升高。

2.3。细胞内损伤和氧化应激的标志物

用缓冲液或不同浓度的MeHg-Cys处理BeWo细胞16 h，检测编码TNFα、NF-κB、SOD1、caspase 8和HIF-1的mRNA的表达(图9)。用5和25µM MeHg-Cys治疗后，编码TNFα的mRNA表达显著增加。有趣的是，当用50µM处理细胞时，TNFα的表达与仅暴露于缓冲液中的细胞相似。NF-κB的表达在暴露于5µM MeHg-Cys的细胞中显著增加，但在暴露于较高浓度的细胞中减少。暴露于各浓度的MeHg-Cys后，SOD1的表达显著降低。caspase 8和HIF-1的表达相似，用25µM MeHg-Cys处理细胞后，表达量下降最明显。GSH和GSSG水平的测量证实存在氧化应激(表1)。GSH:GSSG比值随着MeHg-Cys浓度的增加而降低，表明氧化还原平衡发生了变化[24].

3.讨论

许多研究测量了甲基汞对胎儿健康的影响，但缺乏关于甲基汞直接影响胎盘合胞体滋养层细胞的数据。因此，本研究旨在研究MeHg-Cys转运到培养的胎盘合胞体滋养层细胞中的方式，以及摄入这种汞结合物后的毒理学后果。
目前的数据表明，BeWo细胞对胱氨酸和蛋氨酸（Met）的摄取正常，这表明这些细胞是功能性合胞滋养层的可靠模型。测定胱氨酸的摄入是因为它是半胱氨酸（Cys）的来源，半胱氨酸是谷胱甘肽（GSH）的重要组成部分，是胎盘和胎儿组织健康的关键抗氧化剂。由于Met的大小和形状与MeHg-Cys相似，因此测量了Met的摄取量[25]. 此外，Met是系统L（LAT2）的底物，被认为在MeHg-Cys转运到合胞体滋养层中发挥作用[16，26]. 由于合胞体滋养层细胞中存在大量的氨基酸转运蛋白，我们假设多个载体参与了母体血液中MeHg-Cys的摄取。在钠依赖和钠依赖条件下，多种氨基酸和有机阴离子抑制了MeHg-Cys的摄取，这表明多载体参与了该结合物的摄取。事实上，当绘制为Eadie–Hofstee图时，目前的数据表明，至少有两种不同的运输系统参与了甲基汞-胱氨酸的吸收。与钠依赖载体相比，钠依赖载体似乎在MeHg-Cys的吸收中起着更大的作用。通过测量未标记MeHg-Cys在钠存在和不存在的情况下抑制放射性标记MeHg-Cys转运摄取的程度，评估钠依赖性与钠依赖性摄取的比率。MeHg-Cys的钠依赖性摄取被抑制约70%，而MeHg-Cys的钠依赖型摄取被抑制80%。这一发现表明，只有约10%的MeHg-Cys摄取是由钠依赖性载体介导的。为了确定参与MeHg-Cys摄取的特定转运体，在存在未标记氨基酸和有机阴离子的情况下测量摄取。中性氨基酸（Cys、Met、Leu、Phe、Trp、Ala）抑制MeHg-Cys的钠依赖性摄取，表明LAT1（SLC7A5）、LAT2（SLC 7A8）和/或ASC-2（SLC7 A12）可能参与了这种摄取。此外，酸性氨基酸（精氨酸、赖氨酸、组氨酸）也抑制了吸收，这表明y+LAT1（SLC7A7）也可能在MeHg-Cys摄取中发挥作用[27，28，29]. 胱氨酸的存在也抑制了MeHg-Cys的摄取，这表明胱氨酰转运体，如系统xc（c）负极（xCT；SLC7A11）也可能参与这种摄取[28]. 考虑到氨基酸转运蛋白在胎盘合胞滋养层中的普遍性[28]毫不奇怪，多个载体能够介导MeHg-Cys的摄取。丙磺舒也抑制了MeHg-Cys的摄取；因此，有机阴离子转运体，如OATP-E（SLC21A13）或OATP41（SLCO4A1），均存在于胎盘中[30，31]，也可能在这一过程中发挥作用。令人惊讶的是，过量GSH和GSSG的存在也抑制了MeHg-Cys的摄取。这种抑制可能是由于形成了大型MeHg-GSH复合物，而这些复合物不易被胎盘合胞体滋养层细胞吸收。此外，由于Ala和MeAIB不抑制甲基汞的吸收，因此可以得出结论，系统A在该结合物的吸收中不起作用[32].
胎盘合胞体滋养层细胞对不同浓度MeHg-Cys的敏感性尚未完全确定。目前的数据表明，MeHg-Cys对合胞体滋养层细胞具有直接毒性，导致细胞活力降低。MeHg-Cys降低任何细胞类型细胞活力的机制尚未完全阐明。目前的研究结果表明，BeWo细胞暴露于MeHg-Cys会导致线粒体膜电位降低。以前发表的研究，使用暴露于氯化汞的分离线粒体2，表明暴露于汞可增强线粒体内膜对H的通透性+和K+[33]. 这会导致H的向内通量+和K+穿过线粒体内膜，H的变化+和K+线粒体内的水平导致线粒体膜电位降低。这反过来又导致线粒体通透性转换孔（MPTP）的开放[33]. MPTP也被氧化应激和细胞内钙的增加刺激开放2+水平，已证明在接触汞后发生[34，35]. 长时间打开MPTP导致线粒体肿胀和损伤[36]. 因此，细胞内ATP的储存被耗尽，电子传输链被破坏，ATP的产生减少[33，37]导致细胞活性降低。事实上，目前的数据表明，暴露于MeHg-Cys后，细胞内ATP浓度降低。目前的研究结果表明，暴露于甲基汞Cys会导致线粒体的病理改变，从而导致细胞能量学的重大缺陷。
暴露于甲基汞-半胱氨酸会增加细胞内活性氧的生成，如丙二醛的生成所测，丙二醛是脂质过氧化和氧化应激的指标[38]. 有趣的是，细胞暴露于MeHg-Cys后，SOD1的表达降低。在其他模型中也观察到类似的趋势，这可能是由于细胞损伤和酶/蛋白质合成缺陷所致[39，40]. 参与减少氧化应激的基因表达减少可能会增加细胞对损伤的敏感性并加速细胞死亡。
自噬和有丝分裂是重要的细胞过程，分别促进细胞质碎片或功能失调的线粒体在自噬体内的隔离[41，42]. 当前暴露条件导致编码ATG13和ATG13蛋白的mRNA水平下降。由于ATG13是形成自噬体所必需的，这一发现表明自噬减少。对这一发现的一个可能解释是，接触甲基汞-半胱氨酸会抑制或导致自噬机制的退化。之前的一些研究使用体外和体内模型，报告了暴露于甲基汞后自噬的减少[43，44]而其他研究表明，接触低剂量甲基汞会增强自噬[45]. 这些报告的差异可能是由于所研究的细胞类型之间的差异、用于研究的甲基汞浓度的差异以及每次研究的暴露时间。同样，暴露于重金属也能诱导有丝分裂[46]. 目前的Western blot结果表明，BNIP3，一种参与有丝分裂的蛋白质，在暴露于MeHg-Cys后水平增加。这一发现与已发表的对培养的胎盘滋养层的研究相似[46]. 令人惊讶的是，编码BNIP3的mRNA水平与蛋白质水平不一致；然而，mRNA与蛋白质比率的研究表明，由于蛋白质降解和mRNA稳定性的差异，mRNA和蛋白质水平并不总是相关的[47].与BNIP3相比，接触MeHg-Cys后PINK1的蛋白和mRNA水平降低。考虑到BNIP3水平增加，这一发现出乎意料。还需要进一步研究，以充分阐明MeHg-Cys对暴露细胞中有丝分裂和自噬的影响。
自噬减少导致蛋白质聚集和额外的氧化应激，这可能导致细胞损伤和死亡[48]. 目前的数据评估了脂质过氧化作为氧化应激的一种测量方法。在暴露于MeHg-Cys的细胞中，通过MDA生成测定的脂质过氧化以剂量依赖性的方式增加。GSH:GSSG比值降低也表明氧化应激增加。此外，暴露于MeHg-Cys后，TNFα和NF-κB的表达增加，表明存在炎症过程。这些数据表明，MeHg-Cys诱导的毒性可能在一定程度上是由于氧化应激的产生。
目前的组织学分析提供了接触甲基汞-半胱氨酸导致细胞损伤的直观证据。低剂量暴露导致细胞质泡的形成和一些细胞从培养表面脱落。在最高浓度下，大面积的细胞向上聚集和/或脱落。有趣的是，一些细胞含有小颗粒结构，可能是溶酶体。有必要进行额外的分析，以确定接触MeHg-Cys后合体滋养层细胞发生的所有组织病理学变化。
总之，目前的数据表明，MeHg-Cys通过钠依赖和钠依赖机制（如OATPE、LAT1、LAT2、y）被带入合胞体滋养层+LAT1、asc2和b0,+一旦进入细胞，MeHg-Cys对合胞体滋养层细胞具有直接毒性，导致氧化应激、炎症、线粒体功能障碍，最终导致细胞死亡(图10)。这些数据代表了第一份描述甲基汞Cys对合胞体滋养层的直接影响的报告。

4.材料和方法

4.1. 组织培养

BeWo细胞（ATCC）在添加10%胎牛血清的F-12K培养基（ATCC，R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）中培养。通过在0.25%胰蛋白酶中解离传代细胞，该胰蛋白酶在磷酸盐缓冲盐水中含有0.5mM乙二胺四乙酸（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）。培养物保持在37°C，在5%CO的增湿环境中2细胞未经Forskolin处理，以保持细胞内的天然运输功能。

4.2. 摄入分析

如前所述进行摄取测量，但有微小变化[49，50]. 当前的实验测量了5µM的吸收[35S] -胱氨酸（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆珀金埃尔默），5µM[三H] -蛋氨酸（Perkin Elmer），或5µM[14C] -MeHg（美国放射性标记化学品，密苏里州圣路易斯，美国），作为Cys（MeHg-Cys）的共轭物。放射性化合物的最终浓度为1µCi/mL。通过混合氯化甲基汞或[14C] -MeHg与Cys的比例为1:1.25。细胞以0.2×10的密度接种在24孔板中6实验前培养24h。在实验时，去除培养基，并用温吸收缓冲液（25 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）/Tris、140 mM N-甲基-D-葡聚糖氯化物或NaCl、5.4 mM KCl、1.8 mM CaCl）清洗细胞2，0.8 mM硫酸镁4和5 mM葡萄糖，pH值7.5）。通过添加250μL含有放射性标记化合物的摄取缓冲液开始摄取。除非另有说明，否则将细胞在37°C下培养30分钟。吸入放射性标记化合物，然后添加含有1 mM 2,3-二巯基丙基磺酸钠（DMPS；Millipore-Sigma，St.Louis，MO，USA）的冰镇吸收缓冲液，以去除细胞外的汞，从而终止吸收[51]. 用DMPS清洗细胞两次，然后用1%十二烷基硫酸钠（SDS）在0.2 N NaOH中溶解。使用液体闪烁光谱法测量细胞内的放射性。

4.3. 细胞活性分析

如前所述，使用甲基噻唑四氮唑（MTT）试验量化MeHg-Cys的毒理学效应[50]. 本试验通过MTT（密苏里州圣路易斯Millipore-Sigma，美国密苏里洲）转化为甲赞结晶来测量线粒体脱氢酶的活性。BeWo细胞以0.2×10的密度接种696 well板中的细胞/mL（200μL/孔）。细胞培养24 h，用温吸收缓冲液洗涤两次，然后用吸收缓冲液或吸收缓冲液中的MeHg-Cys（25、50、75、100、250、500、750、1000、2500或5000μM）处理。在37°C、5%CO的增湿环境中培养30分钟或16小时2随后，用温吸收缓冲液清洗细胞两次，并在37°C的含5%CO的湿化大气中用MTT（0.5 mg/mL）培养2 h2在此培养后，向每个孔中添加增溶缓冲液（10%Triton X-100，0.1 N HCl，异丙醇），并允许混合物在室温下培养16 h。在BioTekµQuant分光光度板阅读器（美国加利福尼亚州圣克拉拉市安捷伦）中以490 nm的波长读取每块板。
显微镜下观察暴露于MeHg-Cys的BeWo细胞的形态学可辨别的病理变化。细胞以0.2×10的密度接种在隔间盖玻片（Nalge Nunc，Naperville，IL，USA）中6细胞/mL（0.5 mL/室）。在37°C的摄取缓冲液中用MeHg-Cys（100、250、500µM）处理细胞30分钟。暴露后，用缓冲液洗涤细胞，并立即使用配备有Normarsky光学器件的Olympus IX-70倒置生物显微镜（Melville，NY，USA）捕获显微镜图像。这些图像是用Jenoptik Gryphax ARKTUR数码相机拍摄的。
荧光激活细胞分选（FACS）也用于评估汞暴露于甲基汞-半胱氨酸后对线粒体膜电位的影响。用甲基汞Cys（100、250、500、750、1000、5000µM）在37°C下处理细胞30分钟，然后将细胞进行胰蛋白酶解并暴露于3，3′-二己基xacarboxyanine碘化物（DiOC6（3））中，并使用FACS进行分析。

4.4. 自噬试验

使用Millipore-Sigma的自噬检测试剂盒评估BeWo细胞中自噬体的形成。将细胞接种在24孔板中，并在37℃下暴露于缓冲液或MeHg-Cys（25、50、75、100、250或500µM）中30分钟。清洗细胞，并根据制造商的说明评估自噬。

4.5. ATP测定

在37°C下暴露于缓冲液或MeHg-Cys（100、250、500µM）30分钟的BeWo细胞中测量ATP水平。增加MeHg-Cys的浓度以观察可检测的变化。根据制造商的说明，使用Cayman Chemical的ATP检测试剂盒测量ATP水平。

4.6. TBARS（硫代巴比妥酸活性物质）测定

通过测量暴露于缓冲液或MeHg-Cys（1.5 mM）中30分钟的BeWo细胞中丙二醛（MDA）的浓度来评估脂质氧化。为了观察可检测的变化，MeHg-Cys的浓度增加。根据制造商的说明，使用Cayman Chemical的TBARS检测试剂盒测量MDA水平。

4.7、。定量聚合酶链反应

将BeWo细胞在37℃下暴露于缓冲液或MeHg-Cys（5、25、50µM）中16 h。这些研究延长了暴露时间，以考虑mRNA表达的变化。暴露后，将细胞在含有DMPS的缓冲液中洗涤两次。随后，根据制造商的方案，使用TRIzol试剂（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命技术公司）分离RNA。使用逆转录酶和随机六聚体对一微克RNA进行逆转录（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德生命科技公司）。定量PCR分析超氧化物歧化酶1（SOD1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8（caspase 8）、肿瘤坏死因子α（TNFα）、活化B细胞核因子κB（NF-κB）、低氧诱导因子1（HIF-1）、自噬相关蛋白13（ATG13）、PTEN诱导的假定激酶1（PINK1）、，使用ABI Prism 7300序列检测系统和商用基因表达分析（SOD1:Hs00533490-m1；Caspase 8:Hs01018151_m1；TNFα:Hs00174128_m1，NF-κB:Hs00765730-m1，HIF-1:Hs00153153_m1、RIPK3:Hs00179132_m1）进行BCL2和腺病毒E1B 19-kDa相互作用蛋白3（BNIP3L）的表达；ATG13:Hs00207186_m1，PINK1:Hs00260868-m1，BNIP3L:Hs00188949-m1，生命科技）。GAPDH（Hs02786624_g1；Life Technologies）被用作参考基因。

4.8. GSH/GSSG测定

使用谷胱甘肽检测试剂盒（美国密歇根州安阿伯市开曼化学公司）测量谷胱甘苷（GSH）和谷胱甘酮二硫化物（GSSG）水平。将细胞暴露于37°C下的摄取缓冲液或MeHg-Cys（5、10、25µM）中30分钟，并根据试剂盒中的说明测量GSH/GSSG水平。

4.9. 西方印迹法

将BeWo细胞暴露于37°C的培养基、实验缓冲液或MeHg-Cys（5、10、25µM）中16 h，进行Western blot分析。处理后，用冷PBS清洗细胞，然后向细胞中添加RIPA缓冲液（Millipore-Sigma，St.Louis，MO，USA）、蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物。将细胞在4°C下培养5分钟，通过刮擦从培养表面去除，并在声波仪中溶解10分钟。样品在8000×克并收集上清液。蛋白质浓度采用DC（洗涤剂兼容）蛋白质测定法测定。将60µg蛋白质与β-巯基乙醇一起装入装载缓冲液（LI-COR，Lincoln，NE，USA）中，装入10%Tris-HCl凝胶（Bio-Rad，Hercules，CA，USA。然后使用标准吸墨纸将蛋白质转移到PDVF膜（Bio-Rad）。将膜在封闭缓冲液（LI-COR）中培养1 h，然后用兔抗β-肌动蛋白单克隆抗体（1:500；Abcam ab8227，42 kDa）、ATG13（1:1000；Abcam-ab201467，72 kDa）、PINK1（1:500，Abcam ab216144，63 kDa，或BNIP3L（1:500）培养。清洗膜，然后用山羊抗兔IgG（1:1000；LI-COR）孵育。清洗后，用LI-COR Odyssey CLx对膜进行可视化。

4.10. 统计分析

数据首先通过Kolmogorov–Smirnov检验进行正态性分析，然后通过Levene检验进行方差同质性分析。随后，使用单因素方差分析（ANOVA）对数据进行分析，以评估平均值之间的差异。当具有统计显著性时F类-值通过方差分析获得，平均值之间的差异通过Tukey’s分析事后（post-hoc）多重比较测试。A类第页-值≤0.05被认为具有统计学意义。每个实验组包含三个重复，每个实验至少进行三次(n个= 9). 在每个培养箱中随机选择四个显微镜场（200×）进行显微镜研究。

作者贡献

概念化，C.C.B。；方法学、S.G.、S.V.、E.G.F.IV、L.J.、O.U.、R.J.M.和E.R.F。；形式分析，J.L.B.、L.J.和C.C.B。；资源，C.C.B。；书面原稿编制，S.G.和C.C.B。；书面审查和编辑，S.G.、S.V.、E.G.F.IV、L.J.、O.U.、R.J.M.、J.L.B.、C.C.B.和E.G.F.IV；项目管理，C.C.B。；所有作者均已阅读并同意手稿的出版版本。

基金

这项研究由纳文森特健康基金会资助。

数据可用性声明

研究中提供的数据可应通讯作者的要求提供。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

工具书类

  1. 美国毒物与疾病登记署，汞毒理学简介。美国卫生与公共服务部; 公共卫生服务，疾病控制中心：美国佐治亚州亚特兰大，2008年。在线可用：https://www.atsdr.cdc.gov/toxprofiles/tp46.pdf（2021年7月21日访问）。
  2. 多诺霍，A。；瓦格纳，C.L。；Burch，J.B。；Rothenberg，S.E.美国南卡罗来纳州查尔斯顿市孕妇的血液总汞和甲基汞。J.博览会。科学。环境。流行病。 2018，28, 494–504. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  3. 威克利夫，J.K。；M.Y.利希特维尔德。；Zijlmans，C.W。；麦克唐纳-奥特万格，S。；谢弗，M。；Dahman，C。；哈维尔，E.W。；Drury，S。；Landburg，G。；Ouboter，P.苏里南孕妇接触总汞和甲基汞：来源和公共卫生影响。J.博览会。科学。环境。流行病。 2020，31, 117–125. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  4. 略伦特·巴列斯特罗斯，麻省理工学院。；加西亚·巴拉多（Garcia Barrado），B。；纳瓦罗·塞拉诺，I。；Izquierdo Alvarez，S。；Del Pueyo Garcia Anaya，医学博士。；Gonzalez Munoz，M.J.西班牙马德里社区孕妇血汞和血清硒水平评估。《微量元素医学生物学杂志》。 2020，57, 60–67. [谷歌学者] [交叉参考]
  5. 桥梁，C.C。；Zalups，R.K.。靶组织中汞离子转运的机制。架构（architecture）。毒性。 2017，91, 63–81. [谷歌学者] [交叉参考] [绿色版本]
  6. Ask，K。；Akesson，A。；Berglund，M。；Vahter，M.瑞典女性胎盘中的无机汞和甲基汞。环境。健康展望。 2002，110, 523–526. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学] [绿色版本]
  7. Inouye，M。；Kajiwara，Y.甲基汞引起的豚鼠胎脑发育障碍。架构（architecture）。毒性。 1988，62，15–21。[谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  8. Inouye，M。；Murao，K。；Kajiwara，Y.出生前甲基汞暴露对小鼠的行为和神经病理学影响。神经行为学。毒物。Teratol公司。 1985，7, 227–232. [谷歌学者] [公共医学]
  9. 莫斯，R.F。；H.S.乔治。；Nijhara，S。；奥尔，S.E。；Joshee，L。；Barkin，J.L。；Bridges，C.C.孕妇的慢性肾脏疾病影响母体和胎儿对汞的处置。重新发布。毒性。 2020，93, 137–145. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  10. 世爵公司。；Spyker，J.M.交叉培养研究的反应模型分析：出生前与出生后对暴露于甲基汞双氰胺的后代的影响。毒物。申请。药理学。 1977，40, 511–527. [谷歌学者] [交叉参考]
  11. 苏，M.Q。；Okita，G.T.甲基汞对小鼠的杀胚和致畸作用。毒物。申请。药理学。 1976，38, 207–216. [谷歌学者] [交叉参考]
  12. Murakami，U.某些有机汞化合物的胚胎胎儿毒性效应。每年。代表Res.Inst.Environ。名古屋大学医学院。 1970，18, 33–43. [谷歌学者]
  13. Sakamoto，M。；Chan，H.M。；多明戈，J.L。；郡山，C。；Murata，K。胎盘转移和母体和脐血中汞、硒、维生素E和二十二碳六烯酸的水平。环境。国际。 2018，111, 309–315. [谷歌学者] [交叉参考]
  14. Kajiwara，Y。；Yasutake，A。；阿达奇，T。；平山，K。甲基汞通过中性氨基酸载体通过胎盘转运。架构（architecture）。毒性。 1996，70, 310–314. [谷歌学者] [交叉参考]
  15. T.A.西蒙斯·威尔斯。；Koh，A.S.公司。；克拉克森，T.W。；Ballatori，N.通过分子模拟运输神经毒性物质：甲基汞-L-半胱氨酸复合物是人类L型大中性氨基酸转运蛋白（LAT）1和LAT2的底物。生物化学。J。 2002，367 第1部分, 239–246. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  16. 巴尔塔萨尔，C。；斯坦格尔，H。；Widhalm，R。；Granizer，S。；Hengstschlager，M。；Gundacker，C.甲基汞进入BeWo细胞依赖于系统L氨基酸转运蛋白LAT2-4F2hc。国际分子科学杂志。 2017，18, 1730. [谷歌学者] [交叉参考] [绿色版本]
  17. 斯特拉卡，E。；艾林格，I。；巴尔塔萨尔，C。；Scheinat，M。；Schatz，J。；Szattler，T。；布莱切特，S。；萨利赫，L。；Knofler，M。；Zeisler，H。；等。健康人足月胎盘的汞毒代动力学涉及氨基酸转运蛋白和ABC转运蛋白。毒理 2016，340, 34–42. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  18. Grillo，文学硕士。；兰扎，A。；Colombatto，S.氨基酸通过胎盘的转运及其作用。氨基酸 2008，34, 517–523. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  19. Liao，Y。；彭，S。；He，L。；Wang，Y。；李毅。；马·D。；Sun，L。；郑浩。；Yang，W。；戴，F。；等。甲基汞在人类滋养层HTR-8/SVneo细胞中的细胞毒性和可能机制。生态毒理学。环境。安全。 2021，207, 111520. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  20. 医学博士Brigham。；W.H.斯坦因。；Moore，S.人类血浆中半胱氨酸和胱氨酸的浓度。临床杂志。投资。 1960，39, 1633–1638. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学] [绿色版本]
  21. 波佩尔卡，H。；Klinsky，D.J.Atg13在自噬诱导中的分子机制：数据背后隐藏着什么？自噬 2017，13，449–451。[谷歌学者] [交叉参考] [绿色版本]
  22. 宾格尔，B。；Sheng，M.有丝分裂机制：PINK1、Parkin、USP30及以上。自由基。生物医学。 2016，100, 210–222. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  23. 高，A。；姜杰。；谢凤。；Chen，L.Bnip3《线粒体吞噬：继发性线粒体功能障碍疾病的新见解和潜在治疗靶点》。临床。蜂鸣器。学报 2020，506, 72–83. [谷歌学者] [交叉参考]
  24. 汤森，D.M。；图，K.D。；Tapiero，H.谷胱甘肽在人类疾病中的重要性。生物识别。药物治疗。 2003，57, 145–155. [谷歌学者] [交叉参考]
  25. 桥梁，C.C。；Zalups，R.K.，分子和离子模拟以及有毒金属的运输。毒物。申请。药理学。 2005，204, 274–308. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学] [绿色版本]
  26. Gaccioli，F。；是，I.L。；罗斯，S。；拉格，S。；拉米雷斯，V.I。；Kanai，Y。；鲍威尔，T.L。；Jansson，T.人类足月胎盘中L系统氨基酸转运蛋白的表达和功能表征。重新发布。生物内分泌。英国皇家银行 2015，13, 57. [谷歌学者] [交叉参考] [绿色版本]
  27. 达尔曼，A。；刘，X.I。；G.J.伯克哈特。；van den Anker，J.《人类胎盘中表达的药物转运蛋白和母婴药物转移研究模型》。临床杂志。药理学。 2019，59（补充1），S70–S81。[谷歌学者] [交叉参考] [公共医学] [绿色版本]
  28. 克莱尔，J.K。；阁楼，E.M。；桑格斯，B.G。；Lewis，R.M.胎盘氨基酸转运的系统观点。生理学杂志。 2018，596, 5511–5522. [谷歌学者] [交叉参考] [绿色版本]
  29. Chairoungdua，A。；Kanai，Y。；Matsuo，H。；Inatomi，J。；Kim，D.K。；Endou，H.异二聚体氨基酸转运蛋白家族新成员的鉴定和表征，推测与未知重链相关。生物学杂志。化学。 2001，276, 49390–49399. [谷歌学者] [交叉参考] [绿色版本]
  30. 罗斯，M。；奥拜达特，A。；Hagenbuch，B.OATPs、OATs和OCTs：SLCO和SLC22A基因超家族的有机阴离子和阳离子转运体。英国药理学杂志。 2012，165, 1260–1287. [谷歌学者] [交叉参考] [绿色版本]
  31. 佐藤，K。；Sugawara，J。；佐藤，T。；水田茂，H。；铃木，T。；伊藤，A。；Mikkaichi，T。；Onogawa，T。；Tanemoto，M。；Unno，M。；等。有机阴离子转运多肽E（OATP-E）在人胎盘中的表达。胎盘 2003，24, 144–148. [谷歌学者] [交叉参考]
  32. Moe，A.J。；富雷斯，T.C。；Smith，C.H.胎盘绒毛膜癌细胞系（BeWo）中L-丙氨酸转运的功能特征。胎盘 1994，15，797–802页。[谷歌学者] [交叉参考]
  33. 马，L。；毕，K.D。；范，Y.M。；江，Z.Y。；张，X.Y。；张J.W。；赵，J。；Jiang，F.L。；Dong，J.X.汞诱导大鼠肝线粒体功能障碍的体外调节。毒物。物件。 2018，7, 1135–1143. [谷歌学者] [交叉参考] [绿色版本]
  34. 奥尔，S.E。；M.C.巴恩斯。；Joshee，L。；O.乌恰基纳。；R.J.麦卡利普。；Bridges，C.C.接触生理相关种类的无机汞后细胞损伤的潜在机制。毒物。莱特。 2019，304, 13–20. [谷歌学者] [交叉参考]
  35. Balali-Mood，M。；Naseri，K。；Tahergorabi，Z。；Khazdair，医学博士。；Sadeghi，M.五种重金属的毒性机制：汞、铅、铬、镉和砷。前面。药理学。 2021，12, 643972. [谷歌学者] [交叉参考]
  36. Safiulina，D。；Veksler，V。；扎尔科夫斯基，A。；Kaasik，A.线粒体膜电位的丧失与线粒体体积的增加有关：神经元的生理作用。《细胞生理学杂志》。 2006，206, 347–353. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  37. Belyaeva，E.A。；科洛特科夫，S.M。；Saris，N.E.重金属诱导大鼠肝线粒体功能障碍的体外调节：铜、汞与镉的比较。J.微量元素。医学生物学。 2011，25（补充1），S63–S73。[谷歌学者] [交叉参考]
  38. Gawel，S。；沃达斯，M。；Niedworok，E。；Wardas，P.丙二醛（MDA）作为脂质过氧化标记物。维德。列克。 2004，57, 453–455. [谷歌学者]
  39. Alhusaini，A。；阿尔吉拉尼，S。；Alhuqbani，W。；Hasan，I.H.维生素E和乳酸杆菌对HgCl2诱导的肝损伤具有保护作用：CHOP、GPR87和mTOR蛋白质的作用。剂量反应A Publ。国际惊厥协会。 2021，19, 15593258211011360. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  40. Wang，J。；方，Z。；高杰。；Sun，L。；Wang，Y。；刘，Y。；Gooneratne，R.酵母中重金属Cd（II）、Hg（II）和Cr（III）诱导的细胞毒性、DNA损伤和氧化应激的比较研究。货币。微生物。 2021，78, 1856–1863. [谷歌学者] [交叉参考]
  41. 格利克，D。；Barth，S。；麦克劳德，K.F.自噬：细胞和分子机制。《病理学杂志》。 2010，221, 3–12. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学] [绿色版本]
  42. 细枝，G。；Shirihai，O.S.线粒体动力学和有丝分裂之间的相互作用。抗氧化剂。氧化还原信号。 2011，14, 1939–1951. [谷歌学者] [交叉参考] [绿色版本]
  43. 陈，N。；唐，X。；Ye，Z。；王，S。；Xiao，X.甲基汞通过抑制小鼠生殖细胞中的自噬体-溶酶体融合来干扰自噬通量。生态毒理学。环境。安全。 2020，198，第110667页。[谷歌学者] [交叉参考]
  44. El Asar，H.M。；穆罕默德，E.A。；Aboulhoda，B.E。；艾玛，H.Y。；Imam，A.A.硒对汞神经毒性的保护：调节垂体前叶的凋亡和自噬。生命科学。 2019，231, 116578. [谷歌学者] [交叉参考]
  45. Lin，T。；阮，S。；黄，D。；X孟。；李伟（Li，W.）。；王，B。；Zou，F.MeHg通过JNK/Vps34复合途径诱导的自噬促进自噬体积累和神经元细胞死亡。细胞死亡疾病。 2019，10, 399. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学] [绿色版本]
  46. Zhu，H.L。；Shi，X.T。；X.F.徐。；周，G.X。；熊，Y.W。；Yi，S.J。；刘，W.B。；Dai，L.M。；曹X.L。；Xu，D.X。；褪黑素通过抑制ROS介导的胎盘滋养层中的GCN2/ATF4/BNIP3依赖性线粒体自噬来保护免受环境应激诱导的胎儿生长限制。氧化还原。生物。 2021，40, 101854. [谷歌学者] [交叉参考]
  47. De Sousa Abreu，R。；宾夕法尼亚州。；马科特，E.M。；Vogel，C.蛋白质和mRNA表达水平的全球特征。分子生物晶体。 2009，5, 1512–1526. [谷歌学者] [交叉参考] [绿色版本]
  48. 莱文，B。；Kroemer，G.疾病发病机制中的自噬。单元格 2008，132, 27–42. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学] [绿色版本]
  49. 桥梁，C.C。；Bauch，C。；弗·弗里（F.Verrey）。；Zalups，R.K.半胱氨酸汞共轭物通过氨基酸转运系统b（0，+）转运：分子模拟的含义。《美国肾脏学会杂志》。 2004，15，663–673页。[谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  50. 桥梁，C.C。；Zalups，R.K.同型半胱氨酸，系统b0，+和肾上皮转运以及无机汞的毒性。美国病理学杂志。 2004，165, 1385–1394. [谷歌学者] [交叉参考] [绿色版本]
  51. 扎卢普斯，R.K。；Bridges，C.C.肾脏处理DMPS和DMSA与肾脏处理汞之间的关系。化学。研究毒物。 2012，25, 1825–1838. [谷歌学者] [交叉参考] [绿色版本]
Ijms 23 00394 g001 550号
图1。吸收量5µM[35S] -胱氨酸(A类)和5µM[三H] -蛋氨酸(B类)在BeWo细胞中。在37°C下进行5至60分钟的不同时间的吸收。结果显示为平均值±SE。数据表示三次进行的三次实验。
图1。吸收量5µM[35S] -胱氨酸(A类)和5µM[三H] -蛋氨酸(B类)在BeWo细胞中。在37°C下进行5至60分钟的不同时间的吸收。结果显示为平均值±SE。数据表示三次进行的三次实验。
Ijms 23 00394第001页
国际标准协会23 00394 g002 550
图2。5µM的时间历程[14C] BeWo细胞对甲基汞Cys的摄取(A类)。在37°C下进行吸收，时间范围为5至60分钟[14C] -甲基汞-半胱氨酸(B类)在BeWo细胞中进行评估（插图：Eadie–Hofstee图）。用5µM培养细胞30分钟[14C] -存在未标记的MeHg-Cys时的MeHg-Cys。结果以平均值±标准误差表示。数据表示三次执行的三个实验。
图2。5µM的时间历程[14C] BeWo细胞对MeHg-Cys的摄取(A类)。在37°C下进行吸收，时间范围为5至60分钟[14C] -甲基汞-半胱氨酸(B类)在BeWo细胞中进行评估（插图：Eadie–Hofstee图）。用5µM培养细胞30分钟[14C] -存在未标记的MeHg-Cys时的MeHg-Cys。结果以平均值±SE表示。数据代表三次实验，一式三份。
Ijms 23 00394 g002
国际标准协会23 00394 g003 550
图3。底物特异性分析[14C] -BeWo细胞中的MeHg-Cys转运。细胞在37°C下培养30分钟[14C] -存在各种未标记化合物（1 mM Cys-MeHg和胱氨酸；3 mM所有其他）的MeHg-Cys，钠依赖性(A类)和钠依赖(B类)条件。结果以平均值±SE表示。数据表示三次执行的三个实验。*，显著不同(第页<0.05）。
图3。底物特异性分析[14C] -BeWo细胞中的MeHg-Cys转运。细胞在37°C下培养30分钟[14C] -存在各种未标记化合物（1 mM Cys-MeHg和胱氨酸；3 mM所有其他）的MeHg-Cys，钠依赖性(A类)和钠依赖(B类)条件。结果以平均值±SE表示。数据表示三次执行的三个实验。*，显著不同(第页<0.05）。
国际jms 23 00394 g003
Ijms 23 00394 g004 550标准
图4。暴露于甲基汞Cys的BeWo细胞的细胞活力。BeWo细胞暴露于不同浓度的MeHg-Cys 30分钟(A类)或16小时(B类)在37°C下，并使用甲基噻唑四唑（MTT）测定法测量细胞活力。MeHg-Cys的浓度在暴露16小时后降低，因为较高的浓度会导致明显的细胞死亡。结果以平均值±SE表示。数据表示三次执行的三个实验。*，显著不同(第页<0.05）。
图4。暴露于MeHg-Cys的BeWo细胞的细胞活性。BeWo细胞暴露于不同浓度的MeHg-Cys 30分钟(A类)或16小时(B类)在37°C下，使用甲基噻唑四氮唑（MTT）测定细胞活力。MeHg-Cys的浓度在暴露16小时后降低，因为较高的浓度会导致明显的细胞死亡。结果以平均值±SE表示。数据表示三次执行的三个实验。*，显著不同(第页<0.05）。
国际jms 23 00394 g004
编号：Ijms 23 00394 g005 550
图5。BeWo细胞自噬指标。将BeWo细胞在37°C下暴露于不同浓度的MeHg-Cys 30分钟，并测量自噬体的形成(A类)。为了分析mRNA表达和蛋白质水平，细胞在37°C下暴露于MeHg-Cys 16 h。从对照细胞和暴露细胞中分离RNA和蛋白质，并用定量PCR（qPCR）分析ATG13的水平(B类)，粉红色(C类)和BNIP3(D类)。蛋白质印迹(E类)测定了ATG13（72 kDa）、PINK（63 kDa。以β-肌动蛋白（42kDa）为对照。结果以平均值±SE表示。数据表示三次执行的三个实验。*，显著不同(第页<0.05）。
图5。BeWo细胞自噬指标。将BeWo细胞在37°C下暴露于不同浓度的MeHg-Cys 30分钟，并测量自噬体的形成(A类)。为了分析mRNA表达和蛋白质水平，细胞在37°C下暴露于MeHg-Cys 16 h。从对照细胞和暴露细胞中分离RNA和蛋白质，并用定量PCR（qPCR）分析ATG13的水平(B类)，粉红色(C类)和BNIP3(D类)。蛋白质印迹(E类)测定了ATG13（72 kDa）、PINK（63 kDa。以β-肌动蛋白（42kDa）为对照。结果以平均值±SE表示。数据表示三次执行的三个实验。*，显著不同(第页<0.05）。
国际jms 23 00394 g005
Ijms 23 00394克006 550
图6。BeWo细胞暴露于MeHg-Cys后的形态学分析。BeWo细胞暴露于缓冲液中(A类)或100µM(B类)，250微米(C类)，或500µM(D类)37°C下，MeHg-Cys持续30分钟。暴露在缓冲液中的细胞(A类)细胞形态正常，而暴露于甲基汞的细胞则出现水泡（白色箭头）和分离细胞（黑色箭头）。在暴露于250和500µM MeHg-Cys的细胞中，单层中的间隙（*）很明显。在暴露于500µM MeHg-Cys的细胞的细胞质中发现了小细胞器（箭头）。所示图像代表了三次进行的三个实验。比例尺=40µm。
图6。BeWo细胞暴露于MeHg-Cys后的形态学分析。BeWo细胞暴露于缓冲液中(A类)或100µM(B类)，250微米(C类)，或500µM(D类)37°C下，MeHg-Cys持续30分钟。暴露在缓冲液中的细胞(A类)细胞形态正常，而暴露于甲基汞的细胞则出现水泡（白色箭头）和分离细胞（黑色箭头）。在暴露于250和500µM MeHg-Cys的细胞中，单层中的间隙（*）很明显。在暴露于500µM MeHg-Cys的细胞的细胞质中发现了小细胞器（箭头）。所示图像代表了三次进行的三个实验。比例尺=40µm。
国际jms 23 00394 g006
国际jms 23 00394 g007 550
图7。暴露于MeHg-Cys的BeWo细胞的线粒体破坏。将BeWo细胞暴露于37°C的缓冲液或不同浓度的MeHg-Cys中30分钟。线粒体膜电位的丧失(A类)使用荧光激活细胞分选（FACS）进行测量。在相同暴露条件下测量ATP水平的变化(B类)。结果以平均值±SE表示。数据表示三次执行的三个实验。*，显著不同(第页<0.05）。
图7。暴露于甲基汞Cys的BeWo细胞的线粒体破坏。将BeWo细胞暴露于37°C的缓冲液或不同浓度的MeHg-Cys中30分钟。线粒体膜电位的丧失(A类)使用荧光活化细胞分选（FACS）进行测量。在相同暴露条件下测量ATP水平的变化(B类)。结果以平均值±SE表示。数据表示三次执行的三个实验。*，显著不同(第页<0.05）。
国际jms 23 00394 g007
国际jms 23 00394 g008 550
图8。暴露于MeHg-Cys的BeWo细胞脂质过氧化。BeWo细胞在37°C下暴露于1 mM或5 mM MeHg-Cys 30 min。结果以平均值±SE表示。数据表示三次执行的三个实验。*，显著不同(第页<0.05）。
图8。暴露于MeHg-Cys的BeWo细胞脂质过氧化。BeWo细胞在37°C下暴露于1 mM或5 mM MeHg-Cys 30 min。结果以平均值±SE表示。数据代表三次实验，一式三份。*，显著不同(第页<0.05）。
国际jms 23 00394 g008
国际标准协会23 00394 g009 550
图9。暴露于MeHg-Cys的BeWo细胞中的氧化应激指标。将BeWo细胞在37℃下暴露于缓冲液或5µM、25 mM或50µM MeHg-Cys中16 h。从对照细胞和暴露细胞中分离RNA，并用定量PCR分析TNFα的表达(A类)，核因子-κB(B类)，SOD1(C类)，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(D类)和HIF-1(E类)。结果以平均值±SE表示。数据表示三次执行的三个实验。*，显著不同(第页<0.05）。
图9。暴露于MeHg-Cys的BeWo细胞中的氧化应激指标。将BeWo细胞在37℃下暴露于缓冲液或5µM、25 mM或50µM MeHg-Cys中16 h。从对照细胞和暴露细胞中分离RNA，并用定量PCR分析TNFα的表达(A类)，核因子-κB(B类)，SOD1(C类)，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(D类)和HIF-1(E类)。结果以平均值±SE表示。数据表示三次执行的三个实验。*，显著不同(第页<0.05）。
Ijms 23 00394 g009
Ijms 23 00394 g010 550
图10。胎盘合胞体滋养层细胞摄取MeHg-Cys导致以氧化应激和线粒体功能障碍为特征的细胞内中毒。该图形由BioRender创建。
图10。胎盘合胞体滋养层细胞摄取MeHg-Cys导致以氧化应激和线粒体功能障碍为特征的细胞内中毒。该图形由BioRender创建。
国际jms 23 00394 g010
表
表1。暴露于缓冲液或MeHg-Cys的BeWo细胞中的GSH和GSSG浓度。
表1。暴露于缓冲液或MeHg-Cys的BeWo细胞中的GSH和GSSG浓度。
治疗谷胱甘肽（μM）GSSG（微米）GSH:GSSG公司
缓冲器1.8 ± 0.480.21 ± 0.059:1
5μM甲基汞Cys1.38 ± 0.360.31 ± 0.085:1 *
25μM MeHg-Cys2.49 ± 0.650.49 ± 0.135:1 *
50μM MeHg-Cys0.39 ± 0.100.19 ± 0.052:1 *
*，显著不同(第页<0.05）。
出版商备注：MDPI对公布的地图和机构关联中的管辖权主张保持中立。

分享和引用

MDPI和ACS样式

Ganapathy，S。；法雷尔，E.R。；瓦格拉，S。；Joshee，L。；福特，E.G.，IV；O.乌恰基纳。；R.J.麦卡利普。；巴金，J.L。；桥梁，C.C。甲基汞半胱氨酸在培养BeWo细胞中的转运和毒性。国际分子科学杂志。 2022，23, 394.https://doi.org/10.3390/ijms23010394

AMA风格

Ganapathy S、Farrell ER、Vaghela S、Joshee L、Ford EG IV、Uchakina O、McKallip RJ、Barkin JL、Bridges CC。甲基汞半胱氨酸在培养BeWo细胞中的转运和毒性。国际分子科学杂志. 2022; 23(1):394.https://doi.org/10.3390/ijms23010394

芝加哥/图拉宾风格

Ganapathy、Srividya、Elisa R.Farrell、Simran Vaghela、Lucy Joshee、Earl G.Ford、IV、Olga Uchakina、Robert J.McCallip、Jennifer L.Barkin和Christy C.Bridges。2022.“甲基汞半胱氨酸在培养BeWo细胞中的转运和毒性”国际分子科学杂志23，编号1:394。https://doi.org/10.3390/ijms23010394

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