咖啡因和二甲双胍通过作用不同分子靶点抑制TGF-β1诱导的C-4I和HTB-35/SiHa人宫颈鳞癌细胞侵袭性表型

摘要

在上皮性癌的进展过程中，细胞可能会失去上皮标记物，并通过上皮-间充质转化（EMT）获得间充质表型。上皮癌细胞向间质样特征的这种转化有利于可塑性并支持其迁移能力。本研究的目的是评估天然化合物咖啡酸（CA）单独使用以及与抗糖尿病药物二甲双胍（Metformin）联合使用对两种人类宫颈鳞癌细胞系C-4I和HTB-35/SiHa细胞转移进展的影响。EMT程序是由两种上皮细胞系暴露于TGF-β1而触发的。实时PCR分析与上皮/间充质表型相关的基因表达模式，western blot检测蛋白量。CA和Met治疗人类鳞癌细胞会抑制细胞的运动，其效果取决于特定的细胞系。这两种化合物通过干扰不同的分子靶点来调节C4-I和HTB-35细胞中的EMT过程。在TGF-β1刺激的C4-I细胞中，CA抑制间充质转录因子SNAI1的表达，从而导致上皮标记物E-cadherin、Occludin和Claudin的表达增强。此外，CA被阻止基质金属蛋白酶-9并加强监管TIMP公司-1表达，MMP-9的特异性抑制剂。在TGF-β1刺激的HTB-35细胞中，Met降低了波形蛋白的表达。通过抑制缺氧主调节器HIF-1α，Met导致了CAIX公司，一种参与侵袭性恶性细胞转移的酶。在本研究中，我们发现CA和Met通过不同的机制抑制癌细胞的EMT过程。然而，当混合使用时，化合物对EMT的影响大于单独使用每种化合物。这是第一份报告显示CA单独和与Met联合治疗可以逆转TGF-β1治疗的宫颈癌细胞的间充质表型，我们认为使用这两种小分子可能被视为转移性宫颈癌的潜在治疗方法。

1.简介

鳞状细胞癌是女性最常见的宫颈癌，约占该人群宫颈癌的80%[1]. 随着人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗的问世，宫颈恶性肿瘤的一级预防变得更加成功；然而，生存率和预后都很差，尤其是由于癌症转移[2]. 考虑到复发或转移癌患者的生存期较短，迫切需要改进现有的宫颈恶性肿瘤治疗方法[三].

恶性细胞转化包括一系列过程，导致细胞迁移和侵袭其他组织。当极化上皮细胞获得侵袭性特征时，它们会失去上皮标记物，尤其是细胞间粘附分子，如E-cadherin、Occludin、Claudin和β-catenin，并获得间充质标记物的表达，如Vimentin，最终导致上皮-间充质转化（Epielial-mesenchymal Transition，EMT）程序的激活[4]. 癌细胞功能和形态向间充质样表型的转化有利于可塑性，并有助于离开原发部位并通过血管或淋巴管传播到继发部位。

新的数据表明，以植物来源的小分子（如咖啡酸（3,4-二羟基肉桂酸，CA））为靶向EMT可能是多种癌症的有效化学预防方法。CA是人类饮食中主要的羟基肉桂酸之一。它存在于各种食物中，包括香草和饮料，如咖啡和红酒。在人体内，CA可能是由绿原酸水解产生的，绿原酸是一种植物中富含的酚酸。CA及其衍生物的抗癌活性已在体内得到证实[5]在体外也一样[6,7]也可以对抗妇科癌症[8]. CA及其衍生物可能通过多种机制抑制癌细胞的迁移能力，包括抑制/激活转录因子，如核因子κ-活化B细胞的光链增强因子（NFκB）和调节Akt/mTOR信号通路[9,10]. 据报道，CA可逆转TGF-β1诱导的人肿瘤细胞EMT[11]并通过非规范Wnt信号减轻前列腺癌细胞的侵袭性[5]. CA及其衍生物通过抑制波形蛋白和上调E-钙粘蛋白抑制EMT过程，如胰腺中所示[三]和恶性角质形成细胞[7]. 然而，这种天然化合物对肿瘤性宫颈癌细胞迁移能力的影响尚不清楚。用于人类治疗2型糖尿病的二甲双胍（二甲基双胍，Met）被证明可以抑制高度转移的宫颈HTB-35/SiHa细胞中的EMT[三]Met与CA类似，可通过控制间充质/上皮标记物的表达和调节触发细胞死亡的细胞内信号通路，防止TGF-β1诱导的EMT和细胞侵袭[12,13]. 本研究中使用的实验方法基于以下假设：转化生长因子β1（TGF-β1）会导致上皮性宫颈癌细胞表型转化为间充质样细胞，随后细胞的运动性增加。选取两株人宫颈鳞癌细胞株C-4I和HTB-35/SiHa，研究CA和Met的体外作用。这两种细胞株都表达上皮特征，但E-cadherin和Vimentin的表达因特定细胞株而异。在本研究中，我们旨在发现癌细胞暴露于CA和Met是否可以抑制TGF-β1诱导的癌细胞EMT表型。我们试图评估这两种化合物是否通过相同或不同的调节蛋白作用于C-4I和HTB-35细胞的EMT过程，并根据这些发现评估CA和Met同时治疗细胞是否比单一药物更有效。还进行了伤口愈合试验，以分析CA和Met对细胞运动的影响。在缺氧条件下，我们测试了药物是否可以抑制HIF-1α并调节HIF-1β下游蛋白CAIX。

2.结果

2.1. 转化生长因子β1（TGF-β1）诱导C4-I和HTB-35细胞上皮-间充质转化（EMT）

EMT的特征是与极化上皮表型相关的连接复合体（如E-cadherin）中的蛋白表达下降，同时间充质蛋白也随之上调，尤其是重组细胞骨架，如波形蛋白。我们将宫颈癌鳞癌细胞系C4-I和HTB-35暴露于10 ng/mL的TGF-β1中48小时。在相同条件下培养的非刺激性细胞是合适的对照。Western blot和qPCR分析检测EMT特异性蛋白在C4-I和HTB-35细胞中的表达(图1A、 B）。在未刺激的C4-I细胞中，强E-钙粘蛋白(CDH1型)检测到表达，而波形蛋白(VIM公司)几乎没有表达出来。用TGF-β1孵育C4-I细胞导致E-钙粘蛋白下调(第页<0.1（与未经处理的细胞相比）并增强了波形蛋白的表达(第页与未处理的细胞相比＜0.1）。如所示图1C、 C4-I细胞呈现上皮外观[14]. 在TGF-β1暴露48小时后，细胞开始从单层分离。未刺激HTB-35细胞表达波形蛋白(图1A、 B），而在TGF-β1刺激的HTB-35细胞中，波形蛋白的表达进一步增强(第页<0.1（与未经处理的细胞相比）。同时，TGF-β1刺激的HTB-35细胞散射增强(图1C） ●●●●。E-钙粘蛋白在HTB-35细胞中弱表达，TGF-β1治疗未引起蛋白表达的明显改变(图1A、 B）。

2.2. CA减弱C4-I的迁移能力，Met抑制HTB-35细胞的运动

进行划痕试验以确定CA和Met对C4-I和HTB-35人类鳞癌细胞系中EMT功能效应的可能影响。将亚汇合细胞培养物与CA和/或Met孵育24 h。同时，用受试化合物处理的培养物暴露于10 ng/mL TGF-β1。如所示图2A和图3A、 与未刺激对照组相比，TGF-β1增强了两种细胞系的迁移。100µM CA处理降低了C4-I细胞的侵袭潜能(图2B、，第页与未处理细胞相比<0.05）和HTB-35细胞(图3B、，第页与未经处理的细胞相比<0.05）。细胞暴露于10 mM Met也显著促进了C4-I细胞系裸露区域的闭合(图2B、，第页与未处理细胞相比<0.05）和HTB-35细胞系(图3B、，第页与未经处理的细胞相比<0.05）。比较受试化合物在两种细胞系中减少划痕的作用，CA比Met更有效地抑制C4-I细胞的愈合过程(图2B、，第页CA与Met的差异<0.05），而Met在HTB-35细胞系中的作用大于CA(图3B、，第页<0.05（CA vs.Met）。在用TGF-β1处理的C4-I细胞中，CA/Met可最大程度地减少划痕（高达50%）。更重要的是，联合治疗比单独使用每种化合物对细胞运动的影响更大(图2B、，第页CA/Met与CA相比<0.05，第页CA/Met与Met之间的差异<0.05）。在HTB-35细胞中，Met可使细胞划痕减少40%，并最有效地衰减细胞运动(图3B、，第页<0.05（Met vs.CA），第页<0.05（Met vs.CA/Met）。

我们检测了添加和不添加10 ng/mL TGF-β1的CA和Met对C4-I和HTB-35细胞增殖的影响。将融合细胞培养物暴露于化合物中24、48和72小时。细胞数量评估显示，CA和Met在暴露24和48小时后略微降低C4-I和HTB-35细胞的生长(图S1A） ●●●●。由于100µM的CA和10 mM的Met显著降低了两种细胞系细胞的迁移能力，仅轻微抑制了生长(图S1)，我们对这些浓度进行了进一步的研究。

2.3。CA和Met处理C4-I细胞增加上皮粘附标记物并降低调节EMT的间充质转录因子

由于CA和Met的联合治疗最有效地延缓了C4-I细胞的运动，我们评估了这些化合物是否会改变代表上皮表型的粘附分子的表达，如E-cadherin、β-catenin、Occludin和Claudin。在与化合物孵育48 h并添加10 ng/mL TGF-β1的C4-I细胞培养物中，测量CA和Met对上皮标记物mRNA水平变化的影响。同时，由于比较的原因，每个培养物都在不添加TGF-β1的情况下生长。CA上调E-cadherin、Occludin和Claudin(第页与对照组相比<0.05）。但是，如所示图4，CA/Met治疗导致mRNA表达的最大增加CDH1型(第页与对照组相比<0.05），OCLN公司(第页与对照组相比<0.05）和CLDN1型(第页与对照组相比<0.05）基因。

为了进一步阐明化合物的作用机制，我们检测了CA和Met对间充质转录因子表达的影响。我们发现，在TGF-β1刺激的细胞中，E-钙粘蛋白表达的强烈阻遏物SNAI1的表达被CA下调(第页与对照组相比<0.05）和CA/Met治疗(第页与对照组相比<0.01）。CA/Met被抑制SNAI1公司并加强监管CDH1型C4-I细胞在TGF-β1刺激/非刺激细胞中孵育24天后的表达(图S2). 如所示图5CA和Met的共同作用对SNAI1公司细胞暴露于药物48小时后表达。的表达式ZEB1号机组CA显著下调(第页<0.05与对照组），Met(第页与对照组相比<0.05）和CA/Met(第页与对照组相比<0.05）。Met下调扭转1表达式(第页与对照组相比<0.05），而CA降低mRNA扭转2(第页与对照组相比<0.05）。

2.4. CA下调C4-I细胞MMP-9和基质金属蛋白酶特异性组织抑制剂TIMP-1的表达

鉴于MMP-9和MMP-2对细胞侵袭至关重要，我们使用实时RT-PCR检测了明胶酶在mRNA水平的表达。在培养基中加入10 ng/mL TGF-β1的情况下，用CA和/或Met处理C4-I细胞48小时。同时，其他C4-I培养细胞只暴露于CA和/或者Met，不添加TGF-α1。结果表明，CA降低了基质金属蛋白酶-9(第页与对照组相比<0.05）(图6). 由于MMP-9的活性由特异性内源性抑制剂TIMP-1调节，我们测定了受试化合物对mRNA水平编码的影响TIMP-1公司事实上TIMP-1公司与对照组相比，CA处理的细胞显著增加(第页与对照组相比<0.05）。此外，CA/Met治疗对基质金属蛋白酶-9表达式(第页<0.01 vs.对照组），符合TIMP-1公司在暴露于这两种化合物的细胞中。qPCR分析表明CA抑制基质金属蛋白酶-2表达式(第页与对照组相比<0.05），同时上调TIMP-2(第页与对照组相比<0.05）。

我们还测定了CA和Met对mRNA水平的影响VEGFA（血管内皮生长因子）在TGF-β1刺激的C4-I细胞中，因为VEGFA是促进肿瘤诱导的血管生成的有效因子。细胞暴露于CA后，VEGFA的mRNA显著降低(第页与对照组相比<0.05）。在这里，CA/Met对VEGFA（血管内皮生长因子）基因表达(图6,第页CA/Met与对照组相比<0.01，第页CA/Met与CA相比<0.05，第页CA/Met与Met之间的差异<0.05）。

2.5. Met对HTB-35细胞间充质标志物的抑制作用

肿瘤中EMT的诱导与分子标记物波形蛋白的表达增加有关。评估CA和Met对mRNA水平的影响VIM1型将HTB-35细胞暴露于TGF-β1和测试化合物中48 h。制作适当的对照品，添加CA和/或Met，但不添加TGF-α1。孵育后，进行qPCR和western blot分析。如2.1所示，未刺激的HTB-35细胞显示出Vimentin的强表达，而E-cadherin的表达较弱。用10 mM二甲双胍处理细胞第页与对照组相比，TGF-β1刺激的细胞<0.01，如图7.CA对VIM1型(第页与对照组相比<0.05）。

2.6. 低氧条件下Met抑制HTB-35细胞CAIX的表达

考虑到转录因子HIF-1α在低氧诱导的EMT程序中起主要作用，我们推测Met可能影响HIF-1β蛋白的表达。qPCR分析显示，HTB-35细胞在5%的氧浓度下孵育24小时后₂级别，表示HIF1A型与常氧条件下保存的细胞相比（21%O₂水平），如所示图8A.细胞暴露于Met后HIF1A型显著减少(图8B、，第页与对照组相比<0.01）。此外，由于HIF-1α控制CAIX公司，作为对有限氧气供应的反应，HIF-1α可能导致CAIX公司[15]. 在生长肿瘤中形成的慢性缺氧条件下，CAIX有助于细胞外酸中毒，从而进一步促进前介导级联诱导癌细胞迁移[16]. 结果表明，在低氧条件下，HTB-35细胞暴露于Met后，其mRNACAIX公司通过RT-PCR检测下调(图8C） ●●●●。

3.讨论

最近，EMT被认为在肿瘤扩散机制中起着关键作用。因此，EMT调控途径代表了抑制恶性细胞进展和转移的潜在新靶点[17]. 一些研究表明CA及其衍生物可能通过抑制EMT来抑制癌细胞的扩散[6,7]. Met以前被证明对妇科肿瘤有益[12,13]并抑制人宫颈癌细胞系中的EMT[三]. 因此，这些化合物用于当前研究，以研究它们是否可以抑制TGF-β1诱导的C-4I和HTB-35宫颈癌细胞的转移表型。两种细胞系均表现出上皮特征，但上皮和间充质标记物的表达因特定细胞系而异。C-4I细胞大量表达E-cadherin和弱Vimentin，与正常宫颈上皮相似[18]. 细胞暴露于TGF-β1导致波形蛋白上调和E-钙粘蛋白丢失。HTB-35细胞波形蛋白高表达，TGF-。同时，TGF-β1处理和未处理的HTB-35细胞中E-钙粘蛋白的数量较少。Vessey等人报告HTB-35细胞呈E-cadherin阴性[2]Lee等人提出，一些宫颈癌细胞可能同时表达上皮和间充质标记物[1,19]. Cheng等人已经证明，未刺激的HTB-35细胞可能表达E-cadherin[三]. 我们之前进行的E-cadherin水平的免疫荧光分析及其在HTB-35细胞中的亚细胞定位表明，在野生型HTB-35的细胞中，E-cadherin可能弱表达，但该蛋白从细胞间连接处被提取[20]. 我们的结果表明，CA和Met这两种化合物都有可能抑制TGF-β1诱导的子宫颈癌细胞的间充质表型，但每种药物都通过特定细胞系中的各种蛋白发挥作用。

来自原发性肿瘤相关基质（如TGF-β1）的信号可能触发细胞骨架重组的改变，并导致核转录因子ZEB1、TWIST1和TWIST2的激活，这些转录因子一旦激活，就会实施EMT程序并促进侵袭性[21]. 许多细胞培养实验和体内研究表明，其转录抑制因子SNAI1对E-cadherin表达的抑制是驱动EMT的关键过程[22]也用于宫颈癌[1]. 也有报道称，E-cadherin表达的抑制与人类宫颈癌的分期和分级呈正相关[23]. 在当前的研究中，C-4I细胞暴露于100µM CA导致SNAI1转录和蛋白质的下调。我们可能推测这导致E-cadherin的表达增加(图9). 宫颈癌细胞E-cadherin表达的恢复导致运动能力和侵袭力下降[24]. 功能测试表明，CA治疗减轻了C-4I细胞的运动，延缓了伤口愈合。SNAI1也可能抑制紧密连接分子闭塞素和克劳丁的转录[25]. 除E-钙粘蛋白外，这些上皮膜蛋白被认为在细胞因子诱导的紧密连接调节中起着重要作用，其表达缺失与癌细胞移动和转移增加有关[26]. 结果表明，CA处理后Occludin和Claudin的表达增加，这表明SNAI1不再能够抑制这些下游蛋白。在当前的研究中，CA对蜗牛表达的影响是在mRNA和蛋白质水平上检测到的，因此我们可以推测CA可以直接作用于转录因子的表达。然而，我们希望在接下来的研究中能够认识到参与该过程的确切机制和可能的上游蛋白。

结果表明，CA下调了转录因子的表达ZEB1号机组是E-钙粘蛋白的另一阻遏物。ZEB1诱导EMT的促进，并与其他因素联合触发转移[25]在侵袭性癌细胞系中高度表达[1]该蛋白的过度表达可能是乳腺癌、胰腺癌和肺癌预后不良的指标[21]. 此外，最近确定了SNAI1和ZEB1之间的相互监管[25]; SNAI1作为主要的EMT调节因子，可以增强其他转录因子的表达，包括ZEB1号机组和扭转[27]. 在转移细胞核中，ZEB1和TWIST1蛋白阻止E-cadherin基因转录[1]. 有趣的是，与Met联合治疗时，CA对C-4I细胞E-cadherin表达的作用更大。同时，扭转1是Met在C-4I细胞中调控的分子靶标。因此，我们推测在联合治疗下抑制这些转录因子可能是连接蛋白转录增强的一种可能解释。与这些导致间充质标志物低表达和上皮蛋白高表达的细胞内变化一致，C-4I细胞与CA/Met孵育抑制TGF-β1诱导的细胞迁移，并导致最明显的划痕减少。

此外，SNAI1是基质金属蛋白酶（MMPs）的阳性调节物，MMPs属于锌依赖性细胞外基质（ECM）降解蛋白酶家族。基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）降解侵袭组织的结构蛋白，在肿瘤细胞转移和血管生成中起关键作用[28]. 尽管MMPs的表达模式因肿瘤的起源、类型和分期而异，但许多研究表明，抑制MMPs合成可降低癌细胞的转移潜能[29]. 据报道，MMP-9的过度表达与卵巢和乳腺肿瘤侵袭性增加有关，这可能导致患者生存率下降[30]. 另一方面，CA衍生物对MMP-9活性有较强的抑制作用[31]. 在本研究中，CA抑制基质金属蛋白酶-9以两种独立的方式在C-4I细胞中。首先，CA对SNAI1的抑制可能导致基质金属蛋白酶-9第二，CA处理C-4I细胞导致特定组织抑制剂上调TIMP公司-1控制MMP-9的降解活性[30]. 以前有报道称，肿瘤细胞中MMPs合成增加可能与血管内皮生长因子A（VEGFA）过度表达导致的血管生成能力增强有关，VEGFA可促进癌细胞的转移潜能[32]. 在乳腺癌细胞中，VEGF-A增加SNAI1的mRNA和蛋白质水平，导致E-cadherin转录受到抑制[33]. 我们的发现表明CA通过抑制VEGFA（血管内皮生长因子），可能有助于减少SNAI1公司宫颈癌细胞中的转录，但需要进一步的机制研究。

而在C-4I细胞系中CA对TGF-β1诱导的转移表型的抑制作用最大；Met似乎是HTB-35细胞EMT过程的有效抑制剂。我们发现，在HTB-35细胞中，10 mM浓度的Met降低了间充质标志物波形蛋白的表达。如上所述，侵袭性更强的HTB-35细胞中的波形蛋白mRNA转录和蛋白高于C-4I细胞系。这一发现可能部分解释了化合物在两种宫颈癌细胞系中所产生的不同效应。此外，根据功能划痕试验，Met对HTB-35细胞的运动性影响最大。

在宫颈癌中，细胞的运动可能由周围组织的缺氧和酸中毒加剧引起[15,34]. 实体瘤内充氧不足的环境可能诱导缺氧诱导因子1α（HIF-1α）。HIF 1α的激活导致参与迁移和侵袭的几种蛋白质上调，从而驱动EMT程序并帮助肿瘤细胞适应环境应激[16]. 为了进一步阐明Met在HTB-35细胞中的分子作用，我们测试了该化合物在缺氧条件下引起转录因子表达增加的作用HIF-1αHIF 1α激活后的细胞内变化涉及其下游蛋白碳酸酐酶IX的诱导(CAIX公司). CAIX可以作为一种生存因子，保护肿瘤细胞免受组织微环境酸化的影响，并通过调节肿瘤环境的pH值，促进恶性细胞的迁移。[35]. 由于其在转移中的相关作用，CAIX也被认为是宫颈癌的潜在治疗靶点[15,36]. 在我们的研究中，Met下调HIF-1α，导致转录水平下降CAIX公司(图9). 我们推测，Met对HTB-35细胞中CAIX的抑制可能会损害宫颈癌细胞的侵袭性。

在广泛的药理和生化作用中，CA[5,6,7,8,9,10,11]和Met[12,13]在各种癌症中显示抑制EMT。鉴于EMT激活剂和抑制剂之间的净平衡决定了EMT抑制的进一步进展，我们可以推测，药物作用下间充质转录因子的下调和上皮分子的激活可能会逆转宫颈癌细胞的间充质表型并损害其运动性。新的数据表明，这种针对不同分子机制的组合方法在减少癌症侵袭性方面可能比标准的单药疗法更有效[37,38]. 我们最近报道，CA可能通过调节代谢重编程来扩大Met在人宫颈上皮癌细胞中的抗肿瘤作用[39,40].

4.材料和方法

4.1. 细胞培养和治疗

人类宫颈癌细胞系C-4I（ATCC名称CRL-1594）和HTB-35（ATCC编号HTB-35，SiHa）购自美国类型细胞培养库（LGC Standards-ATCC，Teddington，UK）。C-4I细胞保存在Waymouth的MB 752⁄1培养基中（美国纽约州格兰德岛生命科技公司），HTB-35细胞生长在美国马里兰州沃克斯维尔的Dulbecco改良Eagle培养基Lonza中）。培养基中添加10%胎牛血清（BSA）（Eurex Sp z-o.o.，波兰格但斯克）和50µg/mL庆大霉素（Sigma-Aldrich，Seelze，德国）。培养物在37°C、5%CO的增湿环境中生长₂.对于实验，C-4I细胞的密度为2.5×10⁵细胞/mL和HTB-35细胞，密度为1×10⁵将细胞/mL置于细胞培养板（德国Numbrecht Sarstedt）中，并进行培养以达到充分的融合。在用PBS溶液（Lonza）清洗后，用新鲜培养基替换每个孔中的培养基，培养基中含有足够体积的CA（100µM，Sigma-Aldrich）、Met（10 mM，Simma-Aldrich）储备溶液或这两种化学品，持续48小时。制备每种培养基时，添加或不添加10 ng/mL TGF-β1（PeproTech，Rocky Hill，NJ，USA）。为了进行细胞计数，将细胞培养至完全汇合状态，然后将其暴露于含有或不含TGF-β1的化合物中24、48和72小时。对照细胞在添加溶剂（未处理的细胞）或溶剂和10 ng/mL TGF-？处理细胞的培养基中生长。每项实验一式三份。细胞数量由自动细胞计数器计数员（美国纽约州格兰德岛Gibco实验室）进行评估。

4.2. 免疫印迹法

与化合物孵育24小时后，收集细胞并通过添加冰镇M-PER缓冲液（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科学公司）和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（德国达姆施塔特的默克）形成提取物。总蛋白质采用Bradford法测定。在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离20μg蛋白质，并转移到PVDF膜上进行Western印迹。如前所述，用TBST中含有1%BSA的缓冲液（20 mM/L盐酸曲安奈德，pH 7.5，150 mM/L氯化钠，0.05%吐温20；BioRad，Laboratories，Hercules，CA，USA）封闭膜[39]. 然后在含有0.1%吐温20%和1%牛血清白蛋白的Tris缓冲盐水（TBS）中用一级抗体孵育过夜，然后进行大量冲洗，并用HRP连接的二级抗体（1:4000）孵育1h。以下主要抗体用于实验：抗E-cadherin（Cell Signaling，Danvers，MA，USA，稀释1:1000）、抗Vimentin（Cell-Signaling，稀释1:1000）、抗SNAI1 Santa Cruz Biotech（Santa Cru z，CA，USA），稀释1:500。β-肌动蛋白（1:1000，细胞信号）为负荷对照。二级HRP偶联抗体购自Santa Cruz Biotech。每种蛋白质的特异性免疫反应性通过增强化学发光测定，并使用美国伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯化学公司的Super Signal West Pico化学发光底物试剂盒，使用凝胶逻辑成像系统1500（柯达；美国纽约州罗切斯特市Corestea Health Inc.分子成像系统）进行开发。

4.3. 定量聚合酶链反应（qPCR）

根据供应商的方案，使用通用RNA纯化试剂盒（波兰EURx）提取总RNA。根据制造商使用ProFlex PCR系统（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）的协议，使用MMLV逆转录酶（美国威斯康星州麦迪逊市Promega）进行mRNA的逆转录聚合酶转录。

实时qPCR在QuantStudio 7 Flex（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）中使用空白qPCR主混合（EURx）和以下Taq-Man人类探针（应用生物系统）进行：CDH1（Hs01023894_m1）、VIM（Hs00185584_ml）、CTNNB1（Hs001 7025_m1，ZEB1（Hs00232783_m1）、TWIST1（Hs 00361186_m1。将数据与GAPDH转录物作为参考基因进行标准化，并用2^{−ΔΔC类t吨}方法。

4.4. 伤口愈合迁移

通过伤口愈合迁移（二维细胞运动的改变）来评估CA、Met和CA/Met在C-4I和HTB-35细胞培养中诱导的细胞迁移的改变。将细胞在12孔培养皿中培养至亚汇合状态，然后用无菌10µL塑料吸管在单层细胞上划痕。用PBS清洗浮动细胞后，用新的培养基替换每个孔中的培养基，新的培养液中添加了足够数量的测试化合物，并添加/不添加TGF-β1。在实验开始时（0小时）和24小时后，在倒置光学显微镜（德国汉堡奥林巴斯的奥林巴斯IX-70荧光显微镜）下，从与第一张照片完全相同的位置拍摄细胞向伤口区域移动的照片。使用Image J（v1.44；美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）测量划伤面积，并将迁移率量化为划伤减少率（0小时划伤面积-24小时划伤区域），数据计算为其中描述的3个区域的平均值[41].

4.5. 缺氧条件

HTB-35细胞以1×10的密度接种到6孔板（Sarstedt）中⁵细胞/mL。24小时后，使用添加CA、Met或这两种化合物的新鲜培养基，并在常压（21%O）下培养细胞₂或缺氧（5%O₂然后，收集细胞进行RNA分离。

4.6. 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

使用RNeasy Mini试剂盒（德国希尔登市齐根）从细胞中分离出总RNA，并使用NanoDrop ND-1000分光光度计（美国德州威明顿市NanoDrot Technologies）测量总RNA的数量。根据制造商的说明，使用oligo（dT）15引物和GoScript转录酶进行cDNA合成（德国曼海姆Promega GmbH）。PCR混合物包含：1.5 uL cDNA、1×PCR缓冲液（Sigma-Aldrich）、2.5 mM氯化镁（Sigma Aldrich。使用MJ Research PTC-200 Thermal Cycler，用以下引物通过PCR扩增cDNA：CAIX（碳酸酐酶9）正向（5′-TACAGCTGAACTTCCGAGCG-3′）、CAIX反向（5′-CTAGGCTCCAGTCTCGCTA-3′），HPRT1（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶）正向（5'-TGGCGTTGATTAGTG-3′，HPRT1反面（5′-TATCCAACACTTCGTGGGGT-3′）。所有分析基因的PCR条件如下：在95℃下变性5 min，然后在95℃、58℃和72℃下30 s循环30 s。反应在72°C下完成10分钟。通过检查1.5%的PCR产物来评估PCR反应w个/v（v）琼脂糖凝胶。使用HPRT1对条带进行标准化，以校正cDNA负载的差异。

4.7. 统计分析

实验数据显示为平均值±标准差。采用单因素方差分析和邓肯事后检验进行分析。第页值<0.05和第页<0.01被认为具有统计学意义。使用商用软件包Statistica PL v.10（StatSoft，Tulsa，OK，USA）进行计算。

5.结论

总之，CA和Met治疗人类鳞癌细胞会抑制细胞的运动，其效果取决于特定的细胞系。这两种化合物通过干扰不同的分子靶标来调节C4-I和HTB-35细胞中的EMT过程。在TGF-β1刺激的C4-I细胞中，CA抑制间充质转录因子SNAI1的表达，从而导致上皮标记物E-cadherin、Occludin和Claudin的表达增强。此外，CA被阻止基质金属蛋白酶-9并加强监管TIMP-1公司MMP-9的特异性抑制剂。在TGF-β1刺激的HTB-35细胞中，Met降低了波形蛋白的表达。通过抑制缺氧主调节器HIF-1型α、 Met导致的下调CAIX公司，一种参与侵袭性恶性细胞转移的酶。在本研究中，我们发现CA和Met通过不同的机制抑制癌细胞的EMT过程。然而，当混合使用时，化合物对EMT的影响大于单独使用每种化合物。

这是第一份报告，表明CA单独治疗和与Met联合治疗可能逆转TGF-β1治疗的宫颈癌细胞的间充质表型，我们认为使用这两种小分子可能被认为是转移性宫颈癌的潜在治疗方法。