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IJMS公司
第19卷
第1版
10.3390/ijms19010165
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第条

过度内质网应激与肝脏和脂肪组织线粒体动力学、线粒体吞噬和细胞凋亡受损相关，但与肌肉无关

通过
Krzysztof Marycz公司
1,2,*,
卡塔兹娜·科尔尼卡
1,
Jolanta Szlapka-Kosarzewska公司
1和
克里斯汀·韦斯
三
1
波兰弗罗茨瓦夫50-375弗罗茨瓦环境与生命科学大学实验生物学系
2
弗罗茨瓦夫研究中心EIT+，ul。波兰弗罗茨瓦夫，Stabłowicka 147，54-066
三
PferdePraxis医学兽医博士。Daniel Weiss，Postmatt 14，CH-8807 Freienbach，瑞士
*
信件应寄给的作者。
国际分子科学杂志。 2018,19(1), 165;https://doi.org/10.3390/ijms19010165
收到的提交文件：2017年12月18日/修订日期：2018年1月3日/接受日期：2018年1月4日/发布日期：2018年1月6日
（本条属于本节分子病理学、诊断学和治疗学)
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版本注释

摘要

:
如今，内分泌疾病在人类和兽医中变得越来越常见。在马身上，体力活动减少，加上碳水化合物和糖超载，可能会导致所谓的马代谢综合征（EMS）。EMS的特点是胰岛素抵抗、高胰岛素血症、血甘油三酯浓度升高，通常是肥胖。尽管EMS个体的表型特征是众所周知的，但疾病发展的分子机制仍然难以捉摸。因此，在本研究中，我们分析了胰岛素敏感组织，即肌肉、肝脏和脂肪组织，以评估胰岛素抵抗和凋亡。此外，我们评估了这些组织中的线粒体动力学和线粒体吞噬，因为线粒体功能障碍与代谢综合征的发生有关。我们通过RT-PCR和Western blot的线粒体吞噬实验确定了胰岛素抵抗、内质网应激和线粒体清除相关基因的表达。用电子透射显微镜观察细胞超微结构。结果表明，EMS马的脂肪组织和肝脏的特点是线粒体损伤和有丝分裂增加，随后由于有丝分裂无法恢复细胞内稳态而触发细胞凋亡。然而，在肌肉中，细胞凋亡减少，这表明存在一种保护机制，允许该组织维持体内平衡。

图形摘要

1.简介

马代谢综合征（EMS）是一种日益常见的内分泌疾病，是一组主要与胰岛素抵抗相关的临床异常。这是由于体力活动减少，加上碳水化合物和糖超载，导致胰岛素抵抗（IR）和肥胖；然而，最近的研究结果表明，肥胖和/或区域性肥胖本身不应作为诊断标准[1]. EMS马表型的最典型特征是空腹高胰岛素血症、血甘油三酯浓度升高和胰岛素对外部葡萄糖（口服或静脉注射）的反应不足。
严重肥胖症和/或区域性肥胖症除了是EMS诊断中的一个特征性症状外，还是影响外周组织生理和细胞生理状况的一个重要代谢因素，除其他外，还会诱发炎症、自噬和凋亡。已经证实，受EMS影响的马和人的脂肪组织向外周血分泌促炎细胞因子和脂肪因子，这可能是导致胰岛素抵抗发展的主要因素[2,三,4]。
我们在之前的研究中证明了[5]在胰岛素抵抗的EMS小马中，“驼峰颈”衍生的脂肪组织分泌大量促炎细胞因子、脂肪因子和激素。这反过来导致低度全身炎症，这对椎板炎的发展至关重要。其他作者也发现EMS马项韧带附近的肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）和白介素6蛋白水平较高；然而，与正常体重的健康个体相比，高胰岛素血症马的mRNA水平无统计学相关性。此外，EMS马不同脂肪库中TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1的表达与健康人相比无显著差异[6]. 这是令人惊讶的，因为EMS通常与脂肪组织炎症有关。然而，肝脏和肌肉中脂肪含量的增加被怀疑是导致全身炎症状态发展的主要因素，因为TNF-α的表达升高，同时伴有细胞因子信号传导抑制因子3（SOCS3）和Toll样受体4（TLR4）。在人类代谢综合征中，脂肪的异常堆积，尤其是在肝脏中，被认为是导致局部炎症的主要原因，因为它的脂肪毒性，进而导致肝纤维化和肝细胞凋亡。肝细胞、脂肪细胞和心肌细胞的进行性炎症和氧化应激，以及EMS过程中的进行性凋亡，可能反过来是诱导自噬或/和有丝分裂以拯救应激细胞的因素。
氧化应激（OS）与人类代谢综合征、糖尿病及其并发症的进展有关[7,8]. 活性氧（ROS）的过度积累已被证明会破坏胰岛素信号通路，从而导致胰岛素抵抗（IR）。研究表明，血脂异常、高血糖内质网（ER）应激和一氧化氮合酶是ROS过量产生的原因。此外，线粒体功能障碍通常与细胞器增加ROS分泌有关，或通过向内质网表面发送信号间接增加ROS，进而产生更多ROS。此外，它可以触发代谢综合征和糖尿病的全身炎症特征。然而，关于EMS马匹中操作系统的程度只有有限的数据。在本研究中，我们测定了血清ROS、一氧化氮和超氧化物歧化酶水平，以评估OS是否是EMS的特征。
自噬被认为是一种机制，负责受损细胞器的降解及其利用，并在维持细胞生理功能方面发挥关键作用[9]. 另一方面，有丝分裂一词与去除功能失调、受损的线粒体有关，以维持细胞内的能量平衡和体内平衡。激活自噬或溶酶体系统可以消除OS反应中的氧化细胞成分。最近的数据表明，营养诱导的内质网应激是肥胖相关炎症发生的重要因素，可能是自噬的有力诱导剂，使受损的细胞器（包括线粒体）得以循环利用[10,11]. 在我们之前的研究中，我们已经证明巨噬细胞自噬和线粒体自噬与EMS衍生的祖细胞的存活有关。因此，自噬作为细胞器的重要质量控制，可能是代谢综合征中保护心肌细胞、肝细胞和脂肪细胞的关键机制。然而，在肥胖的II型糖尿病患者中，通过有丝分裂去除有缺陷的线粒体可能是使线粒体免于代谢过载的关键机制，代谢过载会导致β-氧化不完全、有毒脂质中间产物积累和氧化应激[12]. 然而，最近对人类的研究表明，在肥胖状态下，脂肪组织中的自噬过程确实上调，但可能会严重受损。在我们之前的研究中，我们已经证明了从EMS马身上分离的脂肪干细胞中自噬作为一种保护机制的重要性，使这些细胞能够保持多能性。在这项研究中，我们旨在研究EMS马胰岛素敏感性组织中的自噬现象，并首次从分子水平检测这些动物的胰岛素抵抗。据我们所知，这是首次描述EMS在肝脏、肌肉和脂肪组织中的分子后果的研究。我们的主要目标是研究EMS与健康人相比如何影响这些组织的新陈代谢，因为有许多关于人类这种现象的数据。在本研究中，我们首次揭示了胰岛素敏感性组织的EMS相关恶化。我们评估了EMS马的肌肉、脂肪组织、肝脏以及细胞凋亡、炎症、内质网应激和自噬之间的相互作用，以首次修正这些假设。我们测定了细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1（p21）、肿瘤蛋白p53（p53）、α-丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶（BAX）/B-细胞淋巴瘤2（Bcl-2）比率、p62、Beclin-1、PINK PARKIN和微管相关蛋白1A/1B-轻链3（LC-3）水平，以及具有自噬和自噬诱导凋亡特征的自噬体的存在。此外，我们评估了线粒体动力学和内质网应激的标记物。我们的结果表明，肝和脂肪组织中的细胞凋亡、内质网应激和有丝分裂受损之间呈正相关，但肌肉中没有。

2.结果

2.1. 氧化应激与炎症

在健康和EMS个体的血清中确定氧化应激因子和细胞因子水平。两个ROS(图1A） 和否(图1B） EMS马血清中的水平显著升高(第页< 0.01). 另一方面，抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）的活性显著下调(图1C、，第页< 0.001). 采用ELISA法测定血清中白细胞介素10（IL-10）、TNF-α和IL-1β的含量。IL-10的量(图1D、，第页<0.01）减少，而TNF-α(图1E、，第页<0.001）增加了EMS马。各组间IL-1β水平无统计学差异(图1F） ●●●●。

2.2. 胰岛素抵抗

使用RT-PCR，评估了胰岛素抵抗相关基因在健康马和EMS马的肌肉、肝脏和脂肪组织中的表达。在EMS马的肌肉中几乎检测不到胰岛素受体（IR）的表达，而在脂肪和肝脏中，其表达增加(图2A中，第页<0.05和第页分别<0.001）。同样，胰岛素受体底物表达(图2B） EMS马的肌肉明显减少(第页<0.001），而在脂肪组织中，胰岛素受体底物（IRS）的mRNA水平显著升高(第页< 0.001). 研究组之间的肝脏IRS含量无显著差异。核糖体蛋白S6激酶β-1（S6K1）的表达(图2C） 在从EMS个体分离的所有组织中均扩增(第页< 0.001). 相反，葡萄糖转运蛋白4（GLUT-4）水平显著降低(第页<0.001）在EMS马的所有组织中，如图所示图2D.视黄醇结合蛋白4（RBP4）(图2E） 在肌肉中未检测到；然而，它在EMS马的脂肪组织和肝脏中上调(第页< 0.001). 固醇调节元件结合蛋白1c（SREBP1C）的RT-PCR(图2F） 显示其在肌肉中的表达减少(第页<0.001），脂肪组织(第页<0.05）和肝脏(第页<0.05）。

2.3. 细胞凋亡

所有组织在Tri试剂中均质并提交进行RNA分离。使用RT-PCR，研究研究标本中凋亡相关基因的表达。p53的表达(图3A） EMS马的肌肉明显减少(第页< 0.01). 相反，两种脂肪组织中的p53 mRNA均上调(第页<0.01）和肝脏(第页<0.01）。p21的表达(图3B） 与健康受试者相比，EMS马的肌肉明显减少(第页< 0.01). 相反，在脂肪组织中，p21转录水平显著增加(第页< 0.001). p21在健康马和EMS马肝脏中的表达无统计学意义。行李(图3C） 肌肉中的表达显著上调(第页<0.01）和脂肪组织(第页<0.001），而各组之间在肝脏中的表达没有显著差异。抗凋亡Bcl-2的表达(图3D） 肌肉明显减少(第页<0.01）和脂肪组织(第页<0.001）。EMS马肌肉和肝脏中Bcl-2/BAX的比率显著降低(图3E） ●●●●。此外，使用Western blot检测样品中caspase 3的含量。结果如所示图3F.有趣的是，仅在肝脏中观察到半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的裂解。

2.4. 内质网应激

为了评估研究组织中的内质网应激，我们对CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）进行了RT-PCR(图4A） ，真核翻译起始因子2-α激酶3（PERK）(图4B） 白细胞介素13（IL-13）(图4C） ●●●●。所得结果表明CHOP在脂肪组织中的表达增加(第页<0.001）和肝脏(第页<0.01），而肌肉减少(第页<0.001）。EMS马肌肉中PERK mRNA的数量下调(第页< 0.05). 然而，它在这些人的脂肪组织中上调(第页<0.001）和肝脏(第页< 0.05). IL-13的表达(图4D） 在肌肉中显著上调(第页<0.001）并在脂肪组织中下调(第页<0.001）和肝脏(第页<0.05）。为了进一步研究ER情况，我们对组织样品进行了透射电镜（TEM）分析(图4D） ●●●●。在TEM图像中，各组之间的ER超微结构没有显著差异。对于脂肪组织，在对照组中，ER几乎不可见；然而，在EMS组，内质网结构的体积增加，这是未折叠蛋白应激的典型结果（表示为eER（扩大内质网））。此外，在EMS动物的脂肪组织中观察到巨噬细胞浸润。在EMS马的肝脏中也观察到类似的现象，同时还观察到ER增大。此外，它们的特点是脂质滴的积聚增强。此外，观察到细胞核固缩，这表明肝细胞凋亡增加。

2.5. 自噬

采用RT-PCR评估自噬相关基因的表达。雷帕霉素的机制靶点（mTOR）在各组之间没有差异(图5A） 肌肉和脂肪组织样本中的表达。然而，在肝脏中，EMS组的表达上调(第页< 0.001). 磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶（PI3K）(图5B） 肌肉中的mRNA水平下调(第页<0.001）和脂肪组织(第页<0.001）。相反，在肝脏中，PI3K(图5C） 表达明显上调(第页<0.001）。同样，肌肉中AKT表达下调(第页<0.001）和脂肪组织(第页<0.001）。肝脏中AKT mRNA数量没有差异。反过来，Beclin-3的表达也没有发现差异(图5D） 肌肉样本中。在脂肪组织中，Beclin-3的表达减少(第页<0.001），而肝脏增强(第页<0.001）。LC-3型(图5E） 尽管在EMS动物的肝脏中表达水平显著上调，但肌肉和脂肪组织中的表达水平相当(第页< 0.001). Beclin-3/LAMP2的比例(图5F） EMS患者肌肉和肝脏中的表达显著增加(第页<0.01和第页< 0.05). 脂肪组织样本的计算比率没有差异。溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）(图5G） EMS马的所有组织中的表达都大大减少。使用LAMP2荧光染色和共焦显微镜成像，我们评估了组织中LAMP2的数量。免疫荧光染色结果证实了PCR数据，因为在EMS马的组织中发现了低强度的LAMP2信号。此外，利用透射电镜，我们观察了样品中自噬体的形成。自噬体用红色箭头表示图5小时。

2.6。线粒体和线粒体动力学

使用RT-PCR，我们研究了参与有丝分裂进程的基因的表达：PINK(图6A） 和Parkin连接酶（Parkin）(图6B） ●●●●。肝脏PINK表达无差异；然而，它在EMS马肌肉中的表达降低(第页< 0.001). 有趣的是，在EMS组，脂肪组织中PINK表达上调(第页< 0.001). PARKIN表达也有相同的趋势：在肌肉中表达减少(第页<0.001），脂肪组织中增加(第页<0.001）。肝脏样本中的PARKIN表达没有差异。为了评估组织中的线粒体动力学，我们研究了与线粒体融合和(图6C） 裂变(图6D） ●●●●。肌肉中丝裂原融合蛋白1（MNF）的表达下调(第页<0.001），而在肝脏中增加(第页<0.01）。各组之间的脂肪组织样本中MNF mRNA的数量没有差异。线粒体裂变1蛋白（FIS）在马肌肉中的表达没有差异，但在两种脂肪组织中表达上调(第页<0.001）和肝脏(第页<0.001）。此外，使用Western blot评估PARKIN量，如图6E.此外，使用PARKIN的免疫荧光染色，可以看到其在组织中的细胞定位(图6F） ●●●●。所得结果支持PCR数据，因为在EMS马的脂肪组织和肝脏中观察到最强的信号强度。此外，使用TEM，我们观察到了线粒体的形成（用黄色箭头表示，图6F） ●●●●。获得的数据表明EMS马肌肉中的线粒体退化（嵴紊乱、肿胀）（用红色箭头表示图6F） ●●●●。

3.讨论

马代谢综合征的主要病理体征是肌肉、脂肪组织和肝脏的胰岛素抵抗，这是由于饮食中碳水化合物过多和体力活动减少所致[13]. 所有这些因素都会损害胰岛素信号，胰岛素信号是内分泌紊乱（包括EMS）的主要组成部分。
我们测量了马血清中的ROS、SOD和NO水平，以进一步研究OS和EMS之间的关系。许多研究工作表明，糖尿病患者的循环中ROS生成增加，抗氧化保护降低[14,15]. 已经证明氧化应激增强大鼠模型中的胰岛素抵抗[16]. 这与我们的数据一致，因为我们观察到EMS患者的血清ROS和NO水平升高。结果表明，糖尿病大鼠动脉中一氧化氮合酶（NOS）增加[17]. 此外，活性氧已被证明对胰岛β细胞特别有害，因为它们的抗氧化剂（如SOD或过氧化氢酶）含量很低[18]. 在本研究中，我们观察到血清SOD水平降低，这表明EMS马的抗氧化保护能力降低。这与Isogawa等人的结果一致[19]，他们观察到血清SOD活性与代谢综合征受试者的体重指数（BMI）呈负相关。在这种情况下，IR可能作为一种补偿机制，保护细胞免受葡萄糖和脂肪酸的摄入，从而导致氧化损伤[20,21]. 最近的研究表明，体力活动和饮食限制可能会改善OS[22]. 研究表明，抗氧化剂摄入与糖尿病风险增加相关[23]. 因此，补充马饲料中的维生素和自由基清除剂，再加上体力活动，可能会降低ROS的循环水平，从而减少炎症。
胰岛素信号的损伤对于内质网应激以及线粒体的生物发生和动力学也有重要意义[24,25]与EMS密切相关。在此，我们观察到EMS马肌肉、脂肪组织和肝脏中GLUT4和固醇调节元件结合转录因子1（SREBF1）的表达降低，核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）的mRNA转录同时上调。我们的结果表明，与健康献血者相比，EMS马的胰岛素敏感性受损、脂肪酸稳态功能障碍以及肌肉、脂肪组织和肝脏肥胖症。此外，我们发现在EMS马的所有研究组织中S6K1转录物水平增加。据报道，高水平的S6K1 mRNA是营养过剩条件下决定胰岛素抵抗发展的关键因素[26]. 有趣的是，在EMS马的脂肪组织和肝脏中记录到视黄醇结合蛋白（RBP）4的表达增加，这与年龄、肥胖和胰岛素抵抗呈正相关，但在肌肉中没有记录到；然而，这种表达以前曾在啮齿动物肌肉中有报道[27]. 此外，研究表明，RBP4表达增加通过STRA6信号途径导致细胞凋亡[28]. 在这里，我们观察到脂肪组织和肝脏中RBP4转录物水平的增加之间存在正相关，这表明细胞凋亡正在进行。脂肪组织和肝脏中RBP4和p53的上调可能与胰岛素抵抗有关，因为据报道，抑制p53转录物可提高胰岛素敏感性并降低2型糖尿病样疾病小鼠促炎细胞因子的表达[29]. EMS马脂肪组织和肝脏中进行性p53相关凋亡可能是由内质网（ER）应激引起的，内质网应激导致ER稳态破坏，最终导致β细胞死亡[30]. 最近，有人认为慢性高血糖和高脂血症是内质网应激的主要组成部分，也是EMS症状的特征。在这里，我们观察到脂肪组织和肝脏中CHOP（C/EBP同源蛋白）和PERK（真核翻译起始因子2-α激酶3）转录物的水平显著升高，但EMS马的肌肉中没有。这与脂肪组织和肝脏中p53表达上调呈正相关，因为研究表明内质网应激导致死亡信号通路的诱导。反过来，与脂肪组织和肝脏相比，EMS马肌肉中CHOP和PERK的表达降低，可能与肌肉中IL-13转录物的高表达呈正相关。有文献证明，在内质网应激期间，通过eIF2α依赖性调节C/EBPβ转录因子，白介素4（IL-4）/白介素13（IL-13）信号被抑制，而白介素-13通过糖异生调节在调节葡萄糖稳态中发挥了意想不到的作用[31]. 这反过来可能表明，通过减少内质网应激和同时诱导IL-13表达，EMS马的肌肉可以抵抗p53诱导的细胞死亡，而不是脂肪组织或肝脏。此外，Bcl-2/BAX比率降低表明EMS马肌肉和脂肪组织中的细胞凋亡增加。有趣的是，在肝脏样本中没有发现显著差异。这可能表明肝脏通过外源性而非内源性途径发生凋亡。这与声称由于肝细胞死亡受体表达增加，肝细胞凋亡由外源性途径触发的观察结果相关[32]. 然而，这篇论文需要进一步的研究来支持。
众所周知，胰岛素抵抗、肥胖和糖尿病是诱导自噬的有力因素，自噬是一种将应激细胞从死亡中拯救出来的机制。在这里，我们发现在肝脏中诱导了自噬，但在EMS马的脂肪组织和肌肉中没有。我们观察到，与脂肪组织和肌肉相比，EMS马肝脏中的Beclin-1、LC-3、PI3K和mTOR转录物水平显著升高。这些转录物是自噬的主要成分，观察到的上调清楚地表明了自噬诱导。此外，透射电子显微镜（TEM）可以观察自噬双膜液泡的形成，这些液泡聚集在脂滴周围的肝细胞中。有趣的是，在EMS马的肌肉、脂肪组织和肝脏中观察到LAMP2表达显著降低。溶酶体是参与细胞死亡、胞吐、内吞/吞噬以及自噬的重要细胞器。然而，据报道，在糖尿病过程中，它们的活动和/或功能障碍存在于啮齿类动物的大脑中[33]. EMS马的肌肉、脂肪组织和肝脏中的脂质积累可导致溶酶体功能障碍，最终损害碳水化合物、蛋白质、核酸或细胞碎片的降解。因此，增加的糖脂毒性通过氧化应激导致内质网应激，这反过来损害了线粒体的生物发生和动力学。我们观察到EMS马的肝脏和脂肪组织中PARKIN显著上调，这与在这些组织中观察到的进行性内质网应激（CHOP和PERK上调）密切相关。PARKIN是一种E3泛素蛋白连接酶，与PTEN诱导的假定激酶1（PINK1）一起参与线粒体在有丝分裂过程中的控制，从而促进细胞存活。EMS马脂肪组织和肝脏中PARKIN的增强表达与观察到的p53上调密切相关，这表明这些脂肪细胞和肝细胞的凋亡性质。此外，TEM研究表明，线粒体嵴和吞噬体形成受损是典型的有丝分裂现象。有趣的是，尽管我们在EMS马的肌肉样品中没有发现PARKIN表达增强和线粒体形成增强，但线粒体显示出严重的超微结构变化。可以推测，肌肉中可能存在另一种清除线粒体碎片形成细胞胞浆的机制。此外，我们发现FIS在肝脏和脂肪组织中的表达增强，但在EMS马的肌肉中没有。该观察结果与肌肉中p21和p53的低表达呈正相关，这可能表明与其他受试组织（即脂肪组织和肝脏）相比，肌肉在EMS条件下的凋亡最少。线粒体分裂被描述为一种通过改变质子泄漏和膜电位来调节线粒体生物能量和功能的机制[34]. 据报道，抑制线粒体分裂可减少糖尿病引起的氧化应激，因此可以成为一个有效的治疗靶点[35,36]。
在这项研究中，我们首次表明，脂肪组织和肝脏受到EMS中渐进性p53相关凋亡的影响，并与内质网应激一起诱导自噬，以保护细胞免受糖脂毒性的影响。此外，这些组织中描述的有丝分裂可能是维持细胞能量和生存的修复机制。与这些发现相反，我们发现EMS状态下的肌肉受到p53相关凋亡的影响最小，必须存在自噬/有丝分裂以外的另一种机制来保护胰岛素抵抗细胞免受凋亡。由于这可能有助于开发EMS的未来临床治疗，因此迫切需要进一步的详细研究来探讨这个问题。

4.材料和方法

除非另有说明，否则本实验中使用的所有试剂均购自Sigma-Aldrich（波兰波兹南）。

4.1. 马的选择和EMS诊断

从位于波兰拉维茨的屠宰场挑选了8匹EMS和8匹健康的马，并在死后采集了肝脏、肌肉和脂肪组织的样本。这些马都是波兰的热血马，性别各异，年龄在9至14岁之间，符合该项研究的条件。EMS是根据2010年美国兽医学院制定的标准诊断的。EMS马的特征是基于胰岛素失调（ID）、身体状况评分（BCS）区域肥胖、体重（Wt）和椎板炎病史。在电子农业平台（德国埃森纳赫博世）上测量体重。BSC由三名经过独立培训的人员根据Henneke评分系统进行评估和确定，其中1代表极度消瘦的动物，9代表极度肥胖的动物。同样的研究人员也根据冠颈评分（CNS）系统对冠颈进行了评估，其中“0”表示颈冠缩小，“5”表示冠大到永久下垂到颈部一侧。在所有合格的马中，按照[37]. 口服糖（Karo）0.15 mL/kg剂量后，采集血样进行血糖和胰岛素测量。在以下时间点检测血糖水平：Karo给药后“0”、“60”和“120”分钟。空腹胰岛素水平>100毫国际单位每毫升（mIU/mL）被视为高胰岛素血症，服用Karo后60分钟胰岛素升高（>150毫单位/mL）则被视为ID的诊断表1提供了OST、基线血清胰岛素水平、空腹胰岛素和口服糖后60分钟胰岛素水平的数据。通过血糖仪（波兰华沙）进行血糖分析，并使用经实验生物学系（波兰弗罗茨瓦夫环境与生命科学，弗罗茨瓦夫）验证的市售试剂盒Mercodia（Equine insulin ELISA，Uppsala，Sweden，No.10-1205-01）测量胰岛素浓度根据制造商的程序，用于马血清样本。由同一技术人员重复测量三次。

4.2. 肌肉、脂肪和肝脏的采集

从健康马和患有马代谢综合征的马身上采集尸检肌肉、皮下脂肪组织和肝脏样本。收集后立即将组织放入无菌的Hanks平衡盐溶液（HBSS）中，并运至弗罗茨瓦夫大学实验生物学系。

4.3. 肌肉、脂肪和肝脏蛋白质的分离

肌肉、脂肪和肝组织样本均化，然后在含有0.001%蛋白酶抑制剂鸡尾酒的RIPA缓冲液中在冰上培养1小时。培养后，样品在4°C下以10000 rpm离心20分钟。收集上清液并将其储存在−20°C下。蛋白质浓度由Pierce™BCA蛋白质分析试剂盒（波兰华沙生命科技公司）测量。

4.4. 西方印迹法

通过Western blotting检测样品中是否存在特定蛋白质。每个样品使用30微克蛋白质。SDS-PAGE在Tris/甘氨酸/SDS缓冲液中100 V下进行90分钟。在Tris/甘氨酸缓冲液中，使用100 V、4°C的转移装置将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）。转移后，用Tris/NaCl/Tween缓冲液（TBST）清洗膜，并在4°C下用5%的脱脂牛奶在TBST中封闭过夜。然后，用TBST清洗膜，用一级抗体孵育2小时：βAKT（Sigma-Aldrich，A5441）、PARKIN（Novus，Littleton，CO，USA，NB100-91921）和caspase-3（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA，437800），稀释度为1:500。然后，用TBST清洗膜，并添加次级抗体溶液。培养2小时后，用TBST清洗膜并用BCIP培养®/NBT-紫色液体基质15分钟。用水冲洗膜，停止反应。

4.5. 酶联免疫吸附试验

采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定组织匀浆中的总蛋白浓度，检测IL-1β（My Biosource，San Diego，CA，USA）、IL-10（My Biosource（My Beosource），San Diego，CAUSA）和TNF-α（Thermo Fisher，Warsaw，Poland）。根据制造商的方案进行分析。每个样品制备两份。使用Epoch BioTek进行分光光度测定®（美国弗吉尼亚州Winooski）。

4.6. 免疫荧光和透射电镜

对于免疫荧光染色，样品固定在4%多聚甲醛中，并在蔗糖中进行低温保护。冷冻切片（10µm）在低温恒温器上切割，解冻后安装在玻璃载玻片上。将固定切片在含有0.5%皂苷、0.2%Triton X100、0.1%叠氮化钠、2%山羊血清和抗体（1:200，PARKIN，Novus，Littleton，CO，USA，NB100-91921和LAMP2，Abcam，Cambridge，UK，ab25631）的缓冲液中孵育过夜。第二天，用PBS清洗标本三次，每次10分钟，然后用Alexa Fluor 488标记的抗体孵育2小时。用DAPI（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚）对细胞核进行复染。接下来在共焦显微镜下对样品进行检查（Cell Observer，Zeiss，Oberkochen，Germany）。
为了进行透射电子显微镜分析，样品的制备如前所述[38]. 收集并用2.5%戊二醛固定。然后，用蒸馏水清洗三次，用1%四氧化锇培养2小时，用柠檬酸铅和醋酸铀酰复染，在分级丙酮系列中脱水，并用琼脂低粘度树脂试剂盒（英国埃塞克斯琼脂科学有限公司）包埋。使用FE-STEM Auriga60在20 kV灯丝张力下进行观察。

4.7. 血清分析中的氧化应激因素

从马身上采集血清并进行进一步分析。如前所述测量氧化应激因子[39]. 简单地说，根据制造商的说明，使用Griess试剂盒（波兰华沙生命科技公司）和SOD检测试剂盒（Cu-ZnSOD-3）评估一氧化氮浓度。根据制造商的协议，使用2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCF-DA，Life Technologies，Warsaw，Poland）溶液估计活性氧物种（ROS）水平。使用Epoch BioTek进行分光光度测量®（美国弗吉尼亚州Winooski）。

4.8条。基因表达分析

肌肉、脂肪和肝组织样本用HBSS清洗，并用手术剪刀和手术刀切成小块。样品用TRI试剂均质。总RNA是使用Chomczynski和Sacchi（1987）之前描述的酚-氯仿法分离的。用分光光度计（Epoch BioTek）通过吸光度测量测量分离RNA样品的浓度和纯度®（美国弗吉尼亚州Winooski），波长260-nm。使用RevertAid RT Kit（Thermo Scientific，Warsaw，Poland）制备无DNA-free RNA并将gDNA-free总RNA转录为互补DNA（cDNA）。所有程序均按照制造商的说明执行。采用SensiFast SYBR（Bioline，辛辛那提，俄亥俄州，美国），使用5μL总体积为20μL的cDNA进行定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）。在2.5µM最终浓度的引物下进行反应。引物序列见表1.qRT-PCR通过CFX Connect™实时PCR检测系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）在以下条件下进行：95°C 2 min，然后在95°C中50个循环15 s，60°C 15 s和72°C 5 s。每个循环后，对产品进行单次荧光测量。引物序列列于表2mRNA水平相对于作为看家基因的3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）进行了标准化。数据由2−ΔΔC类t吨方法。此外，我们通过将Bcl-2的相对表达除以BAX的相对表达来评估各组中Bcl-2和BAX表达的比率。

4.9. 统计

结果显示为至少三个独立实验的方框图，测量为三倍或更多。使用未配对的t吨-测试（Prism5.04；GraphPad Software，La Jolla，CA，USA）。第页<0.05被认为具有统计学意义。

5.结论

在目前的研究中，我们首次表明脂肪组织和肝脏受到EMS中进行性p53相关凋亡的影响。由于自噬和内质网应激的结合，这些组织中自噬与有丝分裂的触发被观察到是一种对抗糖脂毒性的保护机制。这些过程的激活可能是维持细胞能量和生存的修复机制。另一方面，EMS状态下的肌肉最不容易发生凋亡，必须存在不同于自噬/有丝分裂的机制来保护胰岛素抵抗细胞免受凋亡。

致谢

这项研究由波兰国家科学中心第2016/21/B/NZ7/01111号拨款资助。该出版物得到了2014年至2018年弗罗茨瓦夫生物技术领先国家研究中心（KNOW）项目的支持。

作者贡献

Krzysztof Marycz和Katarzyna Kornicka设计了这项研究。Katarzyna Kornicka和Jolanta Szlapka-Kosarzewska进行了这项研究。Krzysztof Marycz、Katarzyna Kornicka和Christine Weiss分析了数据。Krzysztof Marycz和Katarzyna Kornicka撰写了论文，Katarzyana Kornica、Jolanta Szlapka-Kosarzewska和Christine Weiss编制了数字。Krzysztof Marycz贡献了试剂/材料/分析工具。所有作者阅读并批准了最终手稿。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

缩写

BCS公司身体状况评分
中枢神经系统Cresty颈部得分
邮政特快专递马代谢综合征
重量重量
AKT公司RACα-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶
行李Bcl-2相关X蛋白
Bcl-2型B细胞淋巴瘤2
CHOP公司CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白
邮政特快专递马代谢综合征
急诊室内质网
FIS公司线粒体分裂1蛋白
GAPDH公司3-磷酸甘油醛脱氢酶
GLUT-4级葡萄糖转运子4
IL-1β白细胞介素1β
白介素-10白细胞介素10
白介素-13白细胞介素13
白细胞介素-4白细胞介素4
红外胰岛素受体
美国国税局胰岛素受体底物
灯2溶酶体相关膜蛋白2
LC-3型微管相关蛋白1A/1B-轻链3
MCP-1型单核细胞趋化蛋白1
多国部队丝裂霉素1
mTOR公司雷帕霉素的作用靶点
不一氧化氮
操作系统氧化应激
第21页细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1
第53页肿瘤蛋白p53
停车场帕金连接酶
PERK公司真核翻译起始因子2-α激酶3
PI3K系列磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶
粉红色1PTEN诱导的假定激酶1
RBP4模式视黄醇结合蛋白4
RICTOR公司哺乳动物雷帕霉素靶标的雷帕霉素不敏感伴侣
ROS公司活性氧物种
S6K1核糖体蛋白S6激酶β-1
草地超氧化物歧化酶
SREBP1C公司甾醇调节元件结合蛋白1c
肿瘤坏死因子-α肿瘤坏死因子α

工具书类

  1. Geor，R.J。；M.E.McCue。；Schultz，N.马代谢综合征表型的当前认识。J.马兽医。科学。 2013,33, 841–844. [谷歌学者] [交叉参考]
  2. Fantuzzi，G.脂肪组织、脂肪因子和炎症。过敏临床杂志。免疫学。 2005,115, 911–919. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  3. 辛格，G。；Granger，D.N.，炎症反应是与肥胖和胰岛素抵抗相关的微血管功能障碍的基础。微循环 2007,14, 375–387. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  4. 塔德罗斯，E.M。；N.弗兰克。；Donnell，R.L.马代谢综合征对马静脉注射脂多糖后炎症反应的影响。美国兽医协会。物件。 2013,74, 1010–1019. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  5. Basinska，K。；Marycz，K。；Śmieszek，A。；Nicponán，J.《马代谢综合征威尔士小马皮下脂肪组织中IL-6和TNF-α的产生和分布及其与血清浓度的相关性》。J.兽医。科学。 2015,16, 113–120. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  6. T.A.伯恩斯。；Geor，R.J。；M.C.穆奇。；麦卡琴，L.J。；Hinchcliff，K.W。；Belknap，J.K.，胰岛素抵抗和胰岛素敏感性轻种马皮下和内脏脂肪组织仓库中促炎细胞因子和趋化因子基因表达谱。J.兽医。实习生。医学。 2010,24, 932–939. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  7. Fujita，T.代谢综合征中的胰岛素抵抗和盐敏感性高血压。Nephrol公司。拨号。移植。 2007,22, 3102–3107. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  8. Tangvarasitichai，S.氧化应激、胰岛素抵抗、血脂异常和2型糖尿病。世界糖尿病杂志 2015,6, 456–480. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  9. 苏西，H。；Clément，K。；Dugail，I.肥胖中脂肪组织自噬状态：表达和通量——图片的两面。自噬 2016,12, 588–589. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  10. 美国奥兹坎。；曹琦。；Yilmaz，E。；李·A·H。；北卡罗莱纳州岩口市。；Ozdelen，E。；Tuncman，G。；哥尔根，C。；Glimcher，L.H。；Hotamisligil，G.S.内质网应激与肥胖、胰岛素作用和2型糖尿病有关。科学类 2004,306, 457–461. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  11. Cnop，M。；Foufelle，F。；Velloso，L.A.内质网应激、肥胖和糖尿病。摩尔医学趋势。 2012,18, 59–68. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  12. 萨帕兰塔，J。；García-Macia，M。；Singh，R.自噬和线粒体在肥胖和2型糖尿病中的作用。货币。糖尿病评论。 2017,13, 352–369. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  13. M.E.McCue。；Geor，R.J.公司。；Schultz，N.马代谢综合征：一种受遗传和环境影响的复杂疾病。J.马兽医。科学。 2015,35, 367–375. [谷歌学者] [交叉参考]
  14. VanderJagt，D.J。；哈里森，J.M。；拉特利夫，D.M。；洛杉矶Hunsaker。；Vander Jagt，D.L.IDDM受试者的氧化应激指数，有无长期糖尿病并发症。临床。生物化学。 2001,34，265–270。[谷歌学者] [交叉参考]
  15. 马丁·加兰，P。；卡拉斯科萨，A。；Gussinyé，M。；Domínguez，C.患有或不患有亚临床并发症的年轻糖尿病患者的糖尿病相关氧化应激和抗氧化状态的生物标志物。自由基。生物医学。 2003,34, 1563–1574. [谷歌学者] [交叉参考]
  16. Ogihara，T。；Asano，T。；安藤，K。；千叶，Y。；坂田，H。；阿奈，M。；Shojima，N。；小野，H。；Onishi，Y。；Fujishiro，M。；等。血管紧张素II诱导的胰岛素抵抗与胰岛素信号增强有关。高血压。达拉斯德克萨斯州1979 2002,40, 872–879. [谷歌学者] [交叉参考]
  17. 巴德尔，A.L。；MacLeod，K.M.链脲佐菌素糖尿病大鼠血管平滑肌中诱导型一氧化氮合酶表达和活性的证据。《药理学杂志》。实验治疗师。 2001,296, 252–259. [谷歌学者] [公共医学]
  18. 蒂奇，M。；Lortz，S。；Drinkgern，J。；Lenzen，S.抗氧化酶基因表达与胰岛素生成细胞抗氧化防御状态之间的关系。糖尿病 1997,46，1733年至1742年。[谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  19. Isogawa，A。；山冈，M。；亚诺，M。；Shiba，T.血清超氧化物歧化酶活性与代谢综合征成分或颈动脉内膜中层厚度相关。糖尿病研究临床。实际。 2009,86, 213–218. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  20. Talior，I。；雅科尼，M。；北巴山。；Eldar Finkelman，H.在肥胖、胰岛素抵抗小鼠的脂肪细胞中，葡萄糖摄取的增加促进了氧化应激和PKCδ的激活。美国生理学杂志。内分泌。Metab公司。 2003,285，E295–E302。[谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  21. Rudich，A。；Tirosh，A。；Potashnik，R.公司。；Hemi，R。；Kanety，H。；Bashan，N.长期氧化应激损害3T3-L1脂肪细胞中胰岛素诱导的GLUT4易位。糖尿病 1998,47, 1562–1569. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  22. Nayak，D.U。；卡门，C。；W.H.弗里希曼。；Vakili，B.A.抗氧化维生素、酶和合成氧衍生自由基清除剂在预防和治疗心血管疾病中的应用。心脏病。马里兰州哈格斯敦 2001,三, 28–45. [谷歌学者] [交叉参考]
  23. Ford，E.S.《美国成年人维生素补充剂使用与糖尿病发病率》。美国流行病学杂志。 2001,153, 892–897. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  24. Codogno，P。；Meijer，A.J.自噬：肥胖与胰岛素抵抗之间的潜在联系。单元格元数据。 2010,11, 449–451. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  25. 蒙哥马利，M.K。；Turner，N.线粒体功能障碍和胰岛素抵抗：最新进展。恩多克。连接。 2014,4，R1–R15。[谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  26. 加泰隆，V。；Gómez-Ambrosi，J。；罗德里格斯，A。；拉米雷斯，B。；安德拉达，P。；Rotellar，F。；瓦伦蒂，V。；蒙卡达，R。；马蒂，P。；席尔瓦，C。；等。肥胖患者内脏脂肪组织中S6K1的表达上调，并与胰岛素抵抗和炎症相关。《糖尿病学报》。 2015,52, 257–266. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  27. Ribel-Madsen，R。；弗里德里希森，M。；瓦格，A。；Poulsen，P.双胞胎中的视黄醇结合蛋白4。糖尿病 2009,58, 54–60. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  28. 陈，C.-H。；谢天杰。；林，K.-D。；Lin，H.-Y。；Lee，M.-Y。；洪，W.-W。；小平。；Shin，S.-J.未结合视黄醇结合蛋白4浓度增加通过受体介导的信号传导诱导细胞凋亡。生物学杂志。化学。 2012,287, 9694–9707. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  29. 米纳米诺，T。；奥里莫，M。；清水，I。；Kunieda，T。；横山由纪夫。；伊藤，T。；野岛，A。；Nabetani，A。；Oike，Y。；Matsubara，H。；等。脂肪组织p53在胰岛素抵抗调节中的关键作用。自然医学。 2009,15, 1082–1087. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  30. 背面，S.H。；考夫曼，R.J.内质网应激与2型糖尿病。每年。生物化学评论。 2012,81, 767–793. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  31. M.V.马查多。；Yang，Y。；Diehl，A.M.抑制的好处：IL-13在肝脏葡萄糖稳态中的关键作用。临床杂志。投资。 2013,123, 115–117. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  32. M.E.吉恰尔迪。；Gores，G.J.细胞凋亡：急慢性肝损伤的机制。肠子 2005,54, 1024–1033. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  33. Sims-Robinson，C。；贝克曼，A。；Rosko，A。；格拉瑟，R。；Feldman，E.L.《氧化胆固醇在糖尿病诱导的脑溶酶体功能障碍中的作用》。摩尔神经生物学。 2016,53, 2287–2296. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  34. 斯科特，I。；Youle，R.J.线粒体分裂与融合。生物化学论文。 2010,47, 85–98. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  35. Barazzoni，R.调节线粒体分裂以降低糖尿病氧化应激。糖尿病 2012,61, 1915–1917. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  36. 王，Q。；张，M。；托雷斯，G。；Wu，S。；欧阳，C。；谢，Z。；Zou，M.-H.二甲双胍通过抑制Drp1介导的线粒体分裂抑制糖尿病加速的动脉粥样硬化。糖尿病 2017,66, 193–205. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  37. Schuver，A。；N.弗兰克。；沙梅罗伊，K.A。；Elliott，S.B.通过马的口服糖试验评估胰岛素和葡萄糖动力学。J.马兽医。科学。 2014,34, 465–470. [谷歌学者] [交叉参考]
  38. Marędziak，M。；Marycz，K。；Lewandowski，D。；Siudziñska，A。；Śmieszek，A.静磁场促进马脂肪基质细胞（EqASCs）中富含VEGF和BMP-2的膜源性微泡（MVs）的合成和分泌，这是兽医再生医学的一种新方法。体外细胞。开发生物。阿尼姆。 2015,51, 230–240. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
  39. Kornicka，K。；Marycz，K。；托马谢夫斯基，K.A。；Marędziak，M。；Šmieszek，A.年龄对人脂肪源性基质干细胞（hASCs）成骨和成脂分化潜能的影响以及分化过程中应激因素的影响。氧化物。医学细胞。朗格夫。 2015,2015, 309169. [谷歌学者] [交叉参考] [公共医学]
Ijms 19 00165 g001 550
图1。健康（CTRL）和EMS马血清中的氧化应激和细胞因子水平。使用市售分光光度分析法，ROS(A类)，否(B类)和SOD(C类)对活动进行了评估。用ELISA检测IL-10评估细胞因子谱(D类)，肿瘤坏死因子-α(E类)和IL-1β(如果). 结果表示为平均值±标准偏差（S.D.）**第页< 0.01, ***第页< 0.001.
图1。健康（CTRL）和EMS马血清中的氧化应激和细胞因子水平。使用市售分光光度分析法，ROS(A类)，否(B类)和SOD(C类)对活动进行了评估。用ELISA检测IL-10评估细胞因子谱(D类)，肿瘤坏死因子-α(E类)和IL-1β(如果). 结果表示为平均值±标准偏差（S.D.）**第页< 0.01, ***第页< 0.001.
Ijms 19 00165 g001
Ijms 19 00165 g002 550标准
图2。马肌肉、脂肪组织和肝脏中胰岛素抵抗相关基因的表达。使用RT-PCR，IR的表达(A类)，美国国税局(B类)，S6K1系列(C类)，GLUT-4型(D类)、RBP4(E类)和SREBP1C(如果)已进行调查。结果表示为平均值±S.D*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001.
图2。马肌肉、脂肪组织和肝脏中胰岛素抵抗相关基因的表达。使用RT-PCR，IR的表达(A类)，IRS公司(B类)，S6K1系列(C类)，GLUT-4型(D类)、RBP4(E类)和SREBP1C(如果)已进行调查。结果表示为平均值±S.D*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001.
Ijms 19 00165克002
Ijms 19 00165 g003 550标准
图3。健康（CTRL）和EMS个体肌肉、脂肪组织和肝脏中细胞凋亡的评估。使用RT-PCR，我们评估了p53的表达(A类)，p21蛋白(B类)，BAX（行李）(C类)，Bcl-2型(D类)和Bcl-2/BAX比率(E类). 此外，通过Western blot分析确定了样品中caspase-3的含量(如果). 结果表示为平均值±S.D*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001.
图3。健康（CTRL）和EMS个体肌肉、脂肪组织和肝脏中细胞凋亡的评估。使用RT-PCR，我们评估了p53的表达(A类)，第21页(B类)，BAX（行李）(C类)，Bcl-2型(D类)和Bcl-2/BAX比率(E类). 此外，通过Western blot分析确定了样品中caspase-3的含量(如果). 结果表示为平均值±S.D*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001.
Ijms 19 00165 g003
Ijms 19 00165 g004 550标准
图4。健康和EMS马组织内质网应激的研究。使用RT-PCR，CHOP的表达(A类)、PERK(B类)和IL-13(C类)已检查。此外，TEM图像可以显示细胞超微结构和检测细胞器损伤(D类). 缩写：ER，内质网；eER，内质网扩大；LD，脂滴；PN，核固缩。结果表示为平均值±S.D*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001.
图4。健康和EMS马组织内质网应激的研究。使用RT-PCR，CHOP的表达(A类)，额外津贴(B类)和IL-13(C类)已检查。此外，TEM图像可以显示细胞超微结构和检测细胞器损伤(D类). 缩写：ER，内质网；eER，扩大的内质网；LD，脂滴；PN，核固缩。结果表示为平均值±S.D*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001.
Ijms 19 00165 g004
Ijms 19 00165 g005a 550号Ijms 19 00165 g005b 550号
图5。健康和EMS个体肌肉、脂肪组织和肝脏自噬的评估。使用RT-PCR，mTOR的表达(A类)，PI3K(B类)、AKT(C类)，贝克林-3(D类)，LC3(E类)，Beclin/LAMP2的比率(如果)和LAMP2(G公司)已进行调查。利用免疫荧光技术检测样品中LAMP2的细胞内定位(H（H）). TEM分析可以可视化自噬体的形成（用红色箭头表示(我))。LD，脂滴；AP，自噬体。结果表示为平均值±S.D*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001. 比例尺：共聚焦20µm，透射电子显微镜（TEM）200 nm。
图5。健康和EMS个体的肌肉、脂肪组织和肝脏中自噬的评估。使用RT-PCR，mTOR的表达(A类)，PI3K(B类)、AKT(C类)，贝克林-3(D类)，LC3(E类)，Beclin/LAMP2的比率(如果)和LAMP2(G公司)已进行调查。使用免疫荧光，检测样品中LAMP2的细胞内定位(H（H）). TEM分析可以可视化自噬体的形成（用红色箭头表示(我))。LD，脂滴；AP，自噬体。结果以平均值±标准偏差表示*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001. 比例尺：共聚焦20µm，透射电子显微镜（TEM）200 nm。
Ijms 19 00165 g005aIjms 19 00165 g005b
Ijms 19 00165 g006a 550公司Ijms 19 00165 g006b 550号
图6。健康马和EMS诊断马组织中的线粒体吞噬和线粒体动力学评估。使用RT-PCR，PINK的表达(A类)，停车场(B类)，多国部队(C类)和FIS(D类)已进行调查。用Western blot检测PARKIN量(E类)和免疫荧光染色(如果). TEM成像(如果)允许观察线粒体形成（用黄色箭头表示）和线粒体形态损伤（用红色箭头表示）。MP，线粒体；IM，线粒体受损。结果表示为平均值±S.D**第页< 0.01, ***第页< 0.001. 比例尺：共焦20µm，TEM 100 nm。
图6。健康马和EMS诊断马组织中的线粒体吞噬和线粒体动力学评估。使用RT-PCR，PINK的表达(A类)，停车场(B类)，多国部队(C类)和FIS(D类)已进行调查。用Western blot检测PARKIN量(E类)和免疫荧光染色(如果). TEM成像(如果)允许观察线粒体形成（用黄色箭头表示）和线粒体形态损伤（用红色箭头表示）。MP，线粒体；IM，线粒体受损。结果表示为平均值±S.D**第页< 0.01, ***第页< 0.001. 比例尺：共焦20µm，透射电镜100 nm。
Ijms 19 00165 g006a公司Ijms 19 00165 g006b
表
表1。马代谢综合征（EMS）马和健康（对照）马的特征。
表1。马代谢综合征（EMS）马和健康（对照）马的特征。
组年龄基线血清胰岛素；（mIU/mL）口服糖后60分钟胰岛素（mIU/mL）基线葡萄糖（mg/dL）口服糖后60分钟的葡萄糖（mg/dL）BCS公司中枢神经系统LEP（纳克/毫升）重量（Kg）
邮政特快专递12 ± 2180 ± 20260 ± 1172 ± 11163 ± 267.2 ± 0.23.9 ± 0.74.89 ± 1.2680 ± 30
控制11 ± 213 ± 436 ± 384886.4±0.31.9±0.61.1±0.6590 ± 20
表
表2。RT-PCR中使用的引物序列。
表2。RT-PCR中使用的引物序列。
不。基因名称引物序列放大器尺寸加入号码
1AKT公司向前5′→3′AAGGAGATCATGCAGCACCG公司180XM_014854427.1
反向5′→3′CTCCATCGTGTCGTCTTGGT公司
2行李向前5′→3′GCCAGCAATTGGTGCTCAA公司260XM_014830923.1号
反转5′→3′AGCAGTCACTCCATGGCTC公司
三Bcl-2型向前5′→3′TTCTTTGAGTTCGGTGGGGT公司164XM_014843802.1
反向5′→3′GGGCCGTACAGTCCACAA公司
4贝克林-3向前5′→3′GATGCGTATGCCAGAGCGC公司233XM_014833759.1号
反向5′→3′AACGGCAGCTCCTGAAT公司
5CHOP公司向前5′→3′AGCCAAAATCAGCGGAA公司272XM_014844003.1号
反向5′→3′GGGTCAAGAGTGGAAGG
6FIS公司向前5′→3′GGTGCAAGCAAGTACAACG公司118XM_014854003.1号
反向5′→3′GTTGCCCACAGCAGATAGA公司
7GLUT-4级向前5′→3′美国海关总署210NM_001081866.2号
反向5′→3′TGCAGCAACTGCAATGAC公司
8IL-1β向前5′→3′TATGTGGTGATGCGCGTGC公司352XM_014852743.1号
反转5′→3′GGCAAGGTATCTTGTCAGT公司
9白细胞介素-4向前5′→3′TGACTGTAGCGGATGCTTT公司129XM_014856772.1分
反向5′→3′GTCCGCTCAGGCATTCTTG公司
10白介素-10向前5′→3′TGTTGTTGAACGGGTCCTG242NM_001082490.1号
反向5′→3′ACTCTTCACCTGCTCCACTG公司
11白介素-13向前5′→3′AGCTGGTCAACATCACCAG公司150XM_014730431.1号
反向5′→3′GCATCTTCCGCGTGTTTTGG公司
12红外向前5′→3′CCGTTTGAGTCTGAGGGTC公司254XM_014862015.1号
反向5′→3′ACCGTCAATTCCCGACATC公司
13美国国税局向前5′→3′CTGCTGGGGTTGGAAT公司254XM_014862015.1号
反向5′→3′TAAATCCTCACTGGAGCGGC公司
14灯2向前5′→3′全球气候变化大会147XM_014831347.1号
反向5′→3′ATCCAGCGAACCTCTTGG公司
15生命周期3向前5′→3′TTACTGCTCTGCCAC公司213XM_014835085.1号
反向5′→3′AGCTGCTTCTCCCCCTTGTA
16mTOR公司向前5′→3′GGGCAGTATTAGAGAGTGTGTG公司221XM_005607537.2号
反转5′→3′ATGGTTGTCGGTGTCGCA公司
17多国部队向前5′→3′AAGTGGCATTTTTCGGCAGG公司217XM_014838357.1号
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20粉红色1向前5′→3′GCACAATGAGCCAGAGCTA公司298XM_014737247.1号
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AKT-RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；BAX-Bcl-2-相关X蛋白；Bcl-2-B细胞淋巴瘤2例；贝克林-3；CHOP-C/EBP同源蛋白；FIS-线粒体裂变1蛋白；GLUT-4-葡萄糖转运蛋白4；白介素-1β-白介素1β；白细胞介素-4；白细胞介素-10；白细胞介素13；胰岛素受体；胰岛素受体底物；LAMP2-溶酶体相关膜蛋白2；LC-3-微管相关蛋白1A/1B-轻链3；mTOR——雷帕霉素的作用靶点；MNF-丝裂原融合蛋白1；PARKIN-PARKIN连接酶；PERK-真核翻译起始因子2-α激酶3；PINK1-PTEN诱导的推测激酶1；PI3K-磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶；p21-细胞周期素依赖性激酶抑制剂1；p53肿瘤蛋白p53；雷帕霉素哺乳动物靶点的RICTOR-rapamycin不敏感伴侣；RBP4-维生素结合蛋白4；SREBP1C-甾醇调节元件结合蛋白1c；核糖体蛋白S6激酶β-1；GAPDH-甘油醛3-磷酸脱氢酶。

分享和引用

MDPI和ACS样式

Marycz，K。；Kornicka，K。；Szlapka-Kosarzewska，J。；Weiss，C。过度内质网应激与肝脏和脂肪组织线粒体动力学、线粒体吞噬和细胞凋亡受损相关，但与EMS马的肌肉无关。国际分子科学杂志。 2018,19, 165.https://doi.org/10.3390/ijms19010165

AMA风格

Marycz K、Kornicka K、Szlapka-Kosarzewska J、Weiss C。过度内质网应激与肝脏和脂肪组织线粒体动力学、线粒体吞噬和细胞凋亡受损相关，但与EMS马的肌肉无关。国际分子科学杂志. 2018; 19(1):165.https://doi.org/10.3390/ijms19010165

芝加哥/图拉宾风格

Marycz、Krzysztof、Katarzyna Kornicka、Jolanta Szlapka-Kosarzewska和Christine Weiss。2018.“过度的内质网应激与EMS马肝脏和脂肪组织中线粒体动力学、线粒体自噬和细胞凋亡受损有关，但与肌肉中的线粒体动力学、线粒体自噬和细胞凋亡无关”国际分子科学杂志19，编号1:165。https://doi.org/10.3390/ijms19010165

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