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第11卷
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10.3390/发电机11060663
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第条

热应激对人类α卫星DNA重复序列中H3K9me3水平的影响

通过
伊西多罗·费利西洛
1,2,*,
安东尼奥·塞尔梅克
1,
朱·埃尔杰卡·佩泽尔
1,
马贾·马图利奇
三和
Đur dadica Ugarković
1,*
1
克罗地亚萨格勒布HR-10000 Bijenićka 54 Ruder BoškovićInstitute分子生物学系
2
意大利那不勒斯费德里科第二大学医学与手科学研究所，经由意大利那不利斯I-80131 Pansini 5
三
克罗地亚萨格勒布HR-10000萨格勒伯大学科学院生物系
*
应向其发送信件的作者。
基因 2020,11(6), 663;https://doi.org/10.3390/genes11060663
收到的提交文件：2020年5月26日/修订日期：2020年6月10日/接受日期：2020年6月16日/发布日期：2020年6月18日
（本文属于特刊核苷酸序列与基因组组织)
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摘要

:
卫星DNA是一系列串联重复序列，优先组装成结构异染色质内的大阵列，其转录通常被应激条件激活，尤其是热应激。然而，对已测序基因组的生物信息学分析显示，常染色质基因附近散布着单个重复序列或短排列的卫星DNA。在这里，我们分析了人类主要α卫星DNA在热应激下的转录，并在分散的常色和串联的异色α重复序列中遵循“沉默”H3K9me3和“活性”H3K4me2/3组蛋白标记的动力学。结果表明，热应激时H3K9me3在α重复序列中富集，这与α卫星DNA转录激活动力学有关，而H3K4me2/3水平没有变化。检测到H3K9me3从常染色α重复序列的插入位点扩散到1–2kb，表明α重复序列是局部染色质结构的调节剂。此外，内含子内含有α重复序列的基因以及与基因间α重复序列最接近的基因的表达在热应激时下调。有必要进行进一步研究，以揭示富含H3K9me3的α重复序列，尤其是位于内含子内的重复序列对其相关基因沉默的可能贡献。

1.简介

卫星DNA是在着丝粒周围和近着丝粒区域组成异染色质内组装的串联重复序列[1]. 然而，一些卫星DNA不仅以长阵列的形式聚集在异染色质内，而且以短阵列的形式分散在常染色质内的内含子区和基因间区[2,三,4,5,6]. 虽然卫星DNA优先嵌入被认为具有转录惰性的组成异染色质中，但它们的转录在脊椎动物、无脊椎动物和植物中都有报道[7]. 组成异染色质对温度波动很敏感，并根据环境刺激进行动态调节[8,9]. 温度介导的异染色质断裂似乎是一种表观遗传事件，包括参与异染色素组装的应激反应转录因子。在人类细胞中，热应激激活热休克转录因子1（HSF1），该因子将主要细胞乙酰转移酶招募到着丝粒周围异染色质，从而导致靶向乙酰化过度[10]，特别促进卫星III DNA的转录[11,12]. 在果蝇属在标准条件下，调节应激反应基因表达的转录因子dATF-2将异染色质蛋白1（HP1）征募到着丝粒周围异染色素，而在热应激下，激活MAP激酶，如异染色蛋白释放的p38磷酸化dATF-2，导致HP1的废除和异染色质的破坏[13]. 昆虫体内研究栗Tribolium castaneum揭示了热应激诱导异染色质失稳，并伴随着主要异染色色卫星DNA TCAST1的过度表达，随后将卫星转录物加工成siRNA[14]. 卫星DNA衍生的小干扰RNA通过RNA干扰机制（RNAi）参与不同生物体异染色质形成的表观遗传学过程[15,16,17]. 在锥栗木霉TCAST1卫星DNA的热应激诱导转录与抑制性异染色质标记H3K9me2/3水平的增加相关，不仅在组成异染色素的卫星重复上，而且在分散的TCAST1卫星元件及其常染色质内的近端区域上，都会影响附近基因的表达[18].
α卫星DNA占人类基因组的10%，位于所有染色体的着丝粒和着丝粒周围区域[19]. 人类α卫星DNA的基本单位是基于发散的171 bp单体，这些单体通常以复杂的高阶重复序列组织[20]. 除了它们的（近）着丝粒位置外，对人类基因组的生物信息学搜索还显示，存在133个位于着丝粒>5 Mb的α卫星区块[21]. α卫星DNA转录活跃，转录物有助于基本的染色体功能，如着丝粒、动粒组装和异染色质形成[19]而SUV39H1组蛋白甲基转移酶和着丝粒周围α卫星DNA转录物之间的相互作用对于人类适当的异染色质沉默是必要的[22].
本文以不同的人类细胞系为模型系统，分析了热应激对α卫星DNA转录的影响。此外，我们跟踪组蛋白的表观遗传变化，特别是在常染色质、内含子和基因间区域以及异染色质特征的串联排列的α卫星上分散的α重复序列上的“沉默”H3K9me3和“活跃”H3K4me2/3标记。结果表明，在α重复序列中H3K9me3水平增加，并且从常染色重复序列的插入位点向侧翼区域扩散高达1-2 kb。α重复序列中H3K9me3富集的动力学与热应激时α卫星DNA转录激活的动力学相关，在热应激后最为显著。在异色或常色α卫星重复序列中均未检测到H3K4me2/3水平的变化。我们还跟踪了内含子内含有α重复序列的基因以及与基因间α重复序列最接近的基因在热应激时的表达动态。基因表达下调，与相关α重复序列的H3K9me3水平呈负相关。为了揭示富含H3K9me3的α重复序列，特别是位于内含子内的重复序列对其相关基因沉默的可能贡献，有必要进行进一步的研究。

2.材料和方法

2.1. 生物信息分析

人类基因组组合GRCh17.hg19中注释的α卫星重复序列是从UCSC表浏览器中的rmsk表中提取的。通过UCSC基因组浏览器分析由RepeatMasker在分散的α重复序列附近区域鉴定的重复序列的组织。

2.2. 人类细胞系

实验中使用了以下人类细胞系：MJ90 hTERT（永生皮肤成纤维细胞）、697（人类Pre-B白血病）、MCF-7（人类乳腺癌）、HT29（结肠癌腺癌）、Cal 27（口腔癌腺鳞癌）、HeLa（人类宫颈癌）、Hep2（人类子宫颈癌HeLa衍生物）、SW620（结肠癌）、，SW48（大肠腺癌）、DLD1（大肠腺瘤）、HCT116（结肠癌）、ZR75（乳腺癌）、HepG2（肝细胞癌）、A431（鳞癌）、293T（人胚胎肾）和OV-90（卵巢腺癌）。细胞在适当的培养基（DMEM或RPMI1640）中培养，添加10%FBS和5%CO237°C时。对于热休克实验，细胞在42°C的完全培养基中培养1或2小时，然后在37°C下恢复。来自Abcam的毛霉素被用作人类组蛋白甲基转移酶Suv39H1的特异性抑制剂。

2.3. 细胞培养中的DNA提取和PCR分析

使用“GenElute哺乳动物基因组DNA Miniprep试剂盒”Sigma-Life Science制备基因组DNA。使用2×DreamTaq Green PCR Master Mix（发酵剂）进行PCR反应，最终反应体积为20μL，包含0.2μM每个引物和50 ng基因组DNA。使用Primer3Plus软件按照插入物周围的独特序列设计用于分析分散α-卫星重复序列插入多态性的引物。底漆列于表S1用于扩增的反应条件为：94°C 1 min，94°C 10次循环30 s，60°C 30 s（每个循环中退火温度下降0.25°C），72°C 1分钟，然后在94°C 20次循环30秒，55°C 30秒，72℃90秒。PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，使用QIAquick凝胶提取试剂盒从凝胶中分离，并使用ABI Prism 310（Applied Biosystems）进行测序。

2.4. RNA的分离与逆转录

为了从细胞培养物中分离RNA，在PBS洗涤步骤后直接添加裂解缓冲液，避免胰蛋白酶处理。另外用Turbo DNase（Ambion）消化RNA，并使用Qubit荧光计（Invitrogen）用Quant-IT RNA测定试剂盒定量。用凝胶电泳检查RNA的完整性，用PCR检查是否存在DNA污染。使用PrimeScript RT试剂盒和gDNA橡皮擦（完美实时，Takara），使用随机和寡核苷酸dT引物混合物，在10μL反应中逆转录约1μg RNA。所有样本均使用无逆转录酶的阴性对照。

2.5. 定量实时PCR（qPCR）分析

根据先前公布的方案进行qPCR分析[18]. 人类α卫星DNA和与α重复序列相关基因表达分析的引物列于表S2.葡萄糖醛酸酶β（GUSB) [23]用作人体样本归一化的内生控制。GUSB公司热应激后，该基因（gene ID:2990）在样品间稳定表达，无任何变异。使用了以下热循环条件：50°C 2 min，95°C 7 min，95℃15 s，60°C 1 min，40个循环，然后是解离阶段：95°C 15 s，6 0°C 1 min.，95℃15s，60℃15s。分离曲线分析证实了扩增的特异性，并在琼脂糖凝胶上测试了扩增产物的特异性。每次运行中都包含无模板控件（NTC）。使用LinRegPCR软件v.11.1分析跑步后数据。[24,25]可计算放大器的起始浓度（“无值”）。没有任何值以任意荧光单位表示，并通过考虑PCR效率和基线荧光进行计算。对每个技术复制确定的“No value”进行平均，并用内生对照的“No values”除以平均值“No values”。使用GraphPad v.6.01对qPCR数据进行统计分析，并使用未配对t检验对归一化的无值进行比较，该检验比较了两个不匹配组的平均值。

2.6. 染色质免疫沉淀

将MJ90 hTERT、Cal 27、HepG2和OV-90细胞培养至亚融合状态，在PBS中洗涤，用蛋白酶抑制剂鸡尾酒CompleteMini（Roche）在核隔离缓冲液（10 mM MOPS；5 mM KCl；10 mM EDTA；0.6%Triton X-100）中刮除，并根据公布的方案进行染色质免疫沉淀[18]. 使用的抗体为H3K9me3（Abcam，ab8898）、H3K4二+三甲基（Abcam，ab6000）和IgG（Santa Cruz Biotechnology，sc2027）。使用SYBR Green PCR Master混合物通过qPCR监测沉淀目标的结合。多态性分析引物列于表S1用于在上述反应条件下检查α重复序列的H3K9me3水平。在远离α重复序列的区域用于H3K9me3水平分析的引物也列于表S1而α卫星、NR3C1-HepG2+和NR3C1-HepG2-的引物列于表S2。使用输入分数的No值对No值进行规范化。

3.结果

3.1. 分散α卫星重复序列的色散剖面和多态性

使用UCSC表格浏览器下载人类基因组中注释的阿尔法卫星重复序列（AR）。人类参考基因组GRCh38.hg38也通过比对程序BLASTN版本2.3.1+进行搜索，使用来自293个广泛染色体起源的克隆单体的人类alphoid 171 bp重复一致序列的二聚体作为查询[26]. 分析表明，α卫星DNA在由串联重复序列组成的簇内优先组织，最大的簇位于所有染色体的着丝粒和着丝粒周围区域。对（围）着丝粒外染色体区域的α重复序列的研究表明，它们不仅以长簇的形式存在，而且以1-4个单体的短阵列形式存在，位于基因间区域或内含子内。仅考虑了171 bp单体序列长度至少为50%的点击进行进一步分析。我们总共检测到31个短分散的α卫星DNA元素，大多数是部分或全尺寸单体(表S3). 其中10个元素位于内含子内，其余21个位于基因间区域，最接近5′和3′位点基因间α重复序列的基因列在表S3一些α重复序列位于相同的基因之间（11号和12号、22号和23号、26号和27号），与内含子或基因间α重复序列相关的基因总数为46个(表S3).
我们首先决定分析16个不同人类细胞系中短分散α卫星的插入多态性。几乎所有分散的alpha重复序列附近都有其他重复元素，例如Alu公司、L1或LTR，并且对于某些重复序列侧翼的α重复序列，阻止了单基因座特异性引物的构建。最后对位于内含子内的所有10个α卫星元件以及基因间区域的10个元件进行插入多态性分析(表S3). 在20个测试的分散α卫星元件中，只有两个显示出插入多态性：29号元件位于锌指蛋白675基因(ZNF675型)和位于核受体亚家族3 C组成员1个基因(NR3C1号机组)(表S3). 第29号元素对应于α卫星单体长度的0.6，在所有受试细胞系中都是纯合的，Cal 27和OV-90除外，在这两个等位基因中都没有该元素(图S1A、B). 测序显示，10号α元素对应1.1个卫星单体，在HepG2细胞系中杂合，一个等位基因缺失(图S1C)而在所有其他测试的细胞系中，它是纯合的。

3.2. HS后α卫星DNA转录

为了研究热应激（HS）是否影响α卫星DNA的转录，我们在标准和热应激条件下通过RT-qPCR跟踪了其在人类细胞系中的转录动力学。用于转录分析的引物是基于来自广泛染色体起源的克隆α卫星单体的一致序列构建的[26]并且只能扩增串联重复序列(图S2). 因为在人类着丝粒周围异染色质α卫星DNA是以串联排列的单体组织的[19]可以预期，引物优先识别来自着丝粒周围区域的转录物。对于热休克实验，细胞在42°C的完全培养基中培养1或2小时，然后在37°C的恢复期。在热应激后以及30分钟和1小时的恢复期后立即检查α卫星DNA的转录，并与未受到热应激的对照组进行比较。在永生化成纤维细胞（MJ90 hTERT）、口腔癌腺鳞癌细胞系（Cal 27）、卵巢腺癌细胞株（OV-90）和肝细胞癌细胞（HepG2）中监测α卫星DNA的转录。转录分析揭示了在标准条件下细胞系之间αRNA水平的差异。然而，HS后的转录动力学在所有细胞系中都是相似的(图1). α卫星RNA水平从OV-90细胞的2.0倍增加到MJ90 hTERT细胞的2.4倍(对HS 2小时后，立即与对照组（无HS）相比（<0.05）。在37°C下30分钟的恢复期内，α-RNA水平下降，而在恢复1小时后，它下降到对照水平(图1).

3.3. HS后H3K9me3在Alpha卫星重复发射的动力学

甲虫HS发生后，主要卫星DNA及其邻近区域的分散重复序列中抑制性组蛋白标记的富集先前在甲虫中得到证实锥栗木霉[18]. 在这里，我们分析了在标准条件下和热应激后，沉默组蛋白标记H3K9me3在分散的α卫星重复序列和侧翼区域的分布。我们使用特异性引物进行染色质免疫沉淀（ChIP）结合定量实时PCR(表S1). 在18个分散的α卫星元件及其侧翼区域分析了H3K9me3水平，其中10个位于内含子内，8个位于基因间区域。使用相同的方法，我们还分析了距离每个AR 0.5–6 kb范围内区域的H3K9me3水平。对从MJ90 hTERT、Cal 27、OV-90或HepG2细胞中分离的染色质进行ChIP分析，这些细胞在42°C下受到2小时的热冲击。在HS后立即和37°C下恢复后30分钟测量H3K9me3的水平，并使用未配对的t吨-测试。此外，我们跟踪了IgG与分散的α-卫星重复序列和串联重复的卫星阵列的结合动力学，结合的IgG量非常低，导致信号低于qPCR阈值。
首次使用特异性引物在MJ90hTERT细胞中的10号内含子ARs（1.1单体）、19号内含子AR（2.4单体）和29号内含子ARs（0.6单体）检测了HS后H3K9me3在α重复序列及其邻近区域的分布。引物使用了包含AR的扩增区域以及几个大约200 bp长的区域，这些区域距离相应的AR 0.5–6 kb（表示为图S3). HS后即刻AR 10处H3K9me3水平增加2.1倍，恢复30分钟后仍增加1.5倍(图2A） ●●●●。在位于AR 10的656 bp 3′的区域，1.7×(对=0.011）HS后即刻检测到H3K9me3增加，而在AR10的1.8 kb 5′、1.9 kb 3′和6 kb 5’区域未检测到H3 K9Me3水平的显著变化(图2A） ●●●●。由于距离AR 10 6 kb的区域包含L1重复的一部分，而距离5′端的1.8 kb区域侧翼为Alu公司重复(图S3)，这些区域H3K9me3水平不变，表明L1和Alu公司重复。AR29处H3K9me3分布的特征是，HS后即刻和恢复30分钟时，与对照组相比，分别增加1.9倍和1.3倍(图2B） ●●●●。在625 bp 3′至AR 29的区域，H3K9me3水平增加1.6倍(对=0.009），而在距离AR较远的区域（1.8 kb 5′和1.9 kb 3′），观察到H3K9me3水平在统计学上无显著增加，而在6 kb距离处无变化(图2B） ●●●●。在AR 19，HS后即刻H3K9me3的增加为3.6倍，而在0.5 kb和1.2 kb的距离下，H3K9 me3的水平分别增加了2.7倍和2倍，在2.4 kb的间距下，水平接近于对照(图2C） ●●●●。结果表明，H3K9me3剖面的特征是AR最大增加，H3K9me3向附近地区扩散约1–2kb(图2A–C）。
HS后的H3K9me3水平也在基因内含子内剩余的7个α卫星重复序列中进行检测：ARs No.1、14、18、21、25、28和31(图2D） ●●●●。H3K9me3标记也在距每个AR 2-6 kb的内含子区域进行了检测(图2D） ●●●●。预计其他AR也会向邻近区域传播高达1–2 kb的H3K9me3，因此2–6 kb AR的偏远区域适合作为阴性对照。同样，我们检测了3、4、15、16、17、20和30号基因间AR以及每个基因间AR的2-6 kb区域的H3K9me3水平(图2E） ●●●●。对于由3.4 mer组成的基因间AR 5(表S3)由于其大小无法通过qPCR有效扩增，我们分别在AR的1 kb 5′和2.4 kb 3′区域检测了H3K9me3水平(图2E） ●●●●。所有AR的H3K9me3水平，无论是基因间的还是内含子的，其特征是在HS发生后，相对于对照组，基因间AR编号30的H3K9me3含量增加了1.7倍，内含子AR编号18的H3K 9me3浓度增加了4.3倍(对< 0.05;图2D、 E；表1)而恢复30分钟后，所有AR的H3K9me3水平均降低。HS后1 kb 5′至AR 5号区域的H3K9me3水平立即增加1.8倍(图2E） ●●●●。基因间或内含子AR的大小与其在热应激下的H3K9me3富集之间没有显著相关性(表1)找到。在离AR 2-6 kb的区域，热应激后H3K9me3水平没有显著变化(图2D、 E），证实H3K9me3在HS后从所有AR向附近区域的传播相似，最大可达2kb。我们还跟踪了异染色质的垂直排列α-卫星重复序列的H3K9me3水平(图2F） ●●●●。在MJ90 hTERT细胞中，H3K9me3水平增加3.2倍(对=0.009）在HS后立即，在恢复30分钟时，水平下降，并在恢复1小时时降至对照水平(图2F） ●●●●。除了MJ90hTERT细胞外，我们还检测了HepG2细胞系内含子AR的H3K9me3水平，结果显示H3K9 me3显著增加2–3.4倍(对<0.05）HS后，所有AR均无明显变化，但与作为阴性对照的AR相距2-6 kb的区域无明显变化(图S4).
对于表现出插入多态性的两个内含子AR 10和29(图S1)我们分析了缺乏这些AR的细胞系中相应内含子区域的H3K9me3水平。在HepG2细胞中，第10号α重复序列是杂合的，为了分别跟踪每个等位基因的H3K9me3水平，我们使用了等位基因特异性引物（参见图S1C). 在AR编号为10的等位基因中，在HS后和恢复30分钟时，AR及其附近区域的H3K9me3水平分别增加了3.2倍和1.9倍，而在没有α重复序列编号为10等位基因上，我们没有检测到相应内含子区的H3K9me3的变化NR3C1号机组基因(图2G） ●●●●。HS后Cal 27（2.1×）和OV-90（1.7×）细胞中第10α重复序列的H3K9me3水平也立即升高(图2G） ●●●●。HS后HepG2细胞α-重复序列No29处的H3K9me3水平立即增加2.1倍，而Cal 27和OV-90细胞中锌f675基因不包含α重复序列(图S1B)，在相应内含子区域检测到HS后H3K9me3水平没有显著变化(图2H） ●●●●。自从Alu公司嵌入AR 29的重复序列保留在Cal 27和OV-90细胞中(图S1B)，在相应区域没有H3K9me3变化，没有AR 29，表明α重复而不是Alu公司负责HS时H3K9me3的富集。最后，我们追踪了HS上“活性”组蛋白标记物H3K4me2/3在垂直排列和分散的AR中的水平。HS后和恢复30分钟后H3K4me2/3水平没有明显变化(对> 0.05;图S5).
结果表明，在不同的人类细胞暴露于热休克后，H3K9me3在分散的AR处富集，并扩散至侧翼区域达1–2kb，而在没有AR的情况下，在相应区域未观察到H3K9 me3水平的变化。此外，HS后着丝粒周围α卫星DNA转录的动力学(图1)与分散和垂直排列的卫星重复序列中H3K9me3的增加相关(图2)，表明α卫星DNA转录物在卫星重复序列中抑制组蛋白标记的富集中起作用，这与之前关于TCAST1卫星DNA的研究一致[14,18].

3.4. HS后α重复相关基因的表达

在与20个分散的α卫星重复序列相关的基因中，先前检测了插入多态性(表S3)，我们选择那些通过qPCR在至少一个细胞系中显示可靠表达水平的细胞。在内含子中含有α卫星元件的基因中，有三个基因(PLA2G12B、DLG2、MAP7D2)表达水平很低，而其余七个基因适合进行表达研究：NR3C1号机组,ZNF675型,VAV1、SLC30A6、PRIM、STAM、，和肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红肌红最后，我们还测试了14个与基因间α重复序列最接近的基因的表达，这些基因距离基因间AR高达50kb(表S2和S3)，其中8个适合进行表达研究(SLC40A1、ASNSD1、ST6GAL1、HTRA3、ACOX3、INTS1、PHF20L1、，和DIP2C型).
我们首先测试了与显示插入多态性的AR相关的基因的表达，如ZNF675型和NR3C1号机组基因。The dynamics of expression of theZNF675型MJ90 hTERT成纤维细胞和HepG2细胞中的基因在两种细胞系HS作用2小时后立即下调1.7倍，而在Cal 27和OV-90细胞系中ZNF675型与α卫星重复序列无关，表达不受HS影响(图3A） ●●●●。最大下调NR3C1号机组在MJ90 hTERT（3.5×）、Cal 27（3.7×）和OV-90（2.7×）细胞中，HS作用2 h后立即观察到与对照组相关的表达，随后分别在30 min和1 h恢复期后表达增加(图3B） ●●●●。由于在HepG2细胞中NR3C1号机组基因是杂合的，我们使用了等位基因特异性引物(图S1C)用于表达式分析。NR3C1号机组HS后，含有α重复序列的等位基因的表达立即下调2.7倍，随后在恢复30分钟后表达增加，而NR3C1号机组HS不影响无α重复的等位基因的表达(图3C） ●●●●。
结果显示NR3C1号机组和ZNF675型在不同的细胞系中，HS后与α重复相关的基因，而在没有α重复的情况下，这些基因的表达没有受到影响。HS后ARs 10和29的H3K9me3积累动态(图2A、 B、G、H）与AR 10和AR 29相关基因的抑制相关NR3C1号机组和ZNF675型分别在HS之后(图3A–C），表明ARs富集H3K9me3可能影响基因表达下调。
基因表达分析SLC30A6、PRIM2、STAM、，和MYO1E公司在MJ90 hTERT细胞系中，在42°C下HS 2 h后，立即测量含有内含子的α卫星元件以及与基因间α卫星元件相关的8个基因(图3D） ●●●●。The expression of theVAV1型该基因在697人癌前B白血病细胞系中被追踪，因为在MJ90 hTERT成纤维细胞中该基因的表达水平很低(图S6). 由于697个细胞不能完全存活更长时间的HS，因此HS进行了1小时。所有测试基因在HS后均出现基因表达下降(图3D和图S6). 通过非配对t检验计算出的具有统计学意义的下调水平（以P值表示）如下所示表1对于所有测试基因，以及基因相关α卫星元件的大小和位置，它们与转录起始点（TSS）的距离以及用于表达分析的细胞系。α-重复相关基因的抑制水平在1.7×范围内ZNF675型和环氧乙烷3至5.6倍HTRA3型分散的α卫星元件与基因TSS的距离以及基因间重复序列分别与5′或3′基因末端的距离与基因抑制水平无显著相关性(对值>0.05）。

3.5。抑制Suv39H1对HS后α-重复相关基因表达的影响

为了研究组蛋白沉默修饰H3K9me3对α-重复相关基因抑制的可能作用，我们使用了毛霉素，一种组蛋白甲基转移酶SU（VAR）3-9的特异性抑制剂黑腹果蝇及其人类直系同源物Suv39H1[27]. Suv39H1是通过组蛋白H3的Lys9特异性二甲基化和三甲基化建立浓缩异染色质的关键酶，毛霉素对该酶的特异性使该化合物成为研究异染色素介导的基因抑制的极好工具。
MJ90 hTERT细胞在完全培养基中培养，并添加浓度为150µM的毛霉素[28]在HS之前。为了检查毛霉素在这种条件下是否影响AR的H3K9me3水平，我们在有毛霉素存在和无毛霉素的情况下，在HS 2小时后立即检测内含子AR的H3 K9Me3水平(图4A） ●●●●。作为对照，我们检测了位于AR 2-6 kb区域的H3K9me3水平。结果显示，所有AR的H3K9me3水平均显著降低，从第14号AR的1.6倍到第25号AR的3.9倍不等(对< 0.05). 在距AR 2–6 kb的区域未检测到H3K9me3水平的显著变化(图4A；对> 0.05). 以同样的方式，我们分别在Cal 27、OV-90和HepG2细胞的ARs 10和29中测试了毛霉素对H3K9me3水平的影响，其中这些AR表现出插入多态性。在没有相应AR（AR 10-、AR 29-）的情况下，未观察到H3K9me3水平的变化(图4A） ●●●●。
我们有兴趣检查在AR中观察到的H3K9me3减少是否反映了其相关基因的表达。6个内含子AR基因的表达(SLC30A6、NR3C1、PRIM2 STAM、MYO1E、，和ZNF675型)和8个与基因间AR相关的基因(SLC40A1、ASNSD1、ST6GAL1、HTRA3、ACOX3、INTS1、PHF20L1、，和DIP2C型)在有毛霉素和无毛霉素的HS后通过qRT-PCR进行测量(图4B） ●●●●。与未经毛霉素治疗的对照组相比，用毛霉素处理的MJ90 hTERT细胞中所有基因的表达增加(图4B类；表S4). 使用相同的条件，我们监测基因的表达锌f675和NR3C1号机组分别与Cal 27、OV-90和HepG2细胞系中的多态性AR 29和10相关。的表达式ZNF675型在缺乏AR 29的细胞系Cal 27和OV-90中，该基因不受毛霉素的影响。NR3C1号机组AR 10等位基因的表达增加，而NR3C1号机组在HepG2细胞中，无α重复序列的等位基因的表达不受毛霉素的影响(图4B类；表S4).
结果表明，ARs中H3K9me3水平的降低与α-重复相关基因的表达增强有关。在没有AR的情况下，其中两个基因的表达，ZNF675型和NR3C1号机组不受毛霉素的影响，表明ARs中H3K9me3的富集可能有助于HS后这两个基因的表达下调。

4.讨论

异色卫星DNA的转录被来自植物的不同生物体的热应激激活[29,30]和昆虫[14,31]给人类[11,12]. 特别是，HSF1结合的人类着丝粒旁卫星III的转录在HS期间和之后急剧增加，超过对照10–40倍[32]. 另一方面，如之前在一些细胞系中观察到的，HS对α卫星DNA转录的诱导比卫星III低得多[32]. 与此一致，我们检测到不同细胞系在热应激后立即出现2倍的α卫星DNA过度表达，超出了控制范围。应激诱导的卫星DNA转录的潜在功能是什么？研究表明，人类卫星III转录物在剪接调控水平上介导参与前mRNA处理的许多RNA结合蛋白的募集，并参与热应激时基因表达的控制[33]. 许多卫星DNA的转录本是异染色质建立所必需的[34]热应激后卫星转录的增加与H3K9me3在串联排列的卫星重复序列中的富集有关，如前面所示的主要TCAST1卫星DNA[13]这里是一个主要的人类α卫星DNA。有人提出，TCAST1卫星转录增加会加强“异染色质化”，并有助于异染色素在热应激时的恢复[14]. 由于异染色质对基因组稳定性和完整性很重要，卫星DNA转录物可能对应激细胞/生物体具有保护作用。着丝粒卫星DNA转录物在包括人类和甲虫在内的许多物种的着丝粒或动粒完整性中也发挥着结构作用[35,36]它们在应激条件下的积累似乎是细胞应激反应的一个保守特征[37]. 除了H3K9me3在异染色质中富集外，常染色质中分散的卫星重复序列也发生了副作用“异染色化”，如之前TCAST1卫星和人类α卫星DNA所示。除了卫星DNA，植物中的一些转座子[38],果蝇属[39,40]和哺乳动物[41,42]富含抑制性表观遗传标记，并显示从插入位点传播异染色质标记H3K9me2/3。
考虑到分散的常染色α重复序列对邻近基因表达的影响，观察到的所有ARs相关基因在热应激时的下调以及与多态性α卫星重复序列相关的两个基因表达的差异表明，富含H3K9me3的α重复序列可能对基因沉默有贡献。众所周知，哺乳动物对热休克的全基因组转录反应通过增加或减少RNA聚合酶的释放，在启动子近端停顿处进行调节，从而导致许多基因的上调或下调[43]. 我们可以排除这种热应激反应的基因调控机制对NR3C1型和ZNF675型在缺乏相关α重复序列的情况下，其表达不受HS影响的基因。然而，对于其他测试基因，它们的下调可能列在表1结果不仅来自富含H3K9me3的α重复序列，也来自对热休克的一般转录反应。需要进一步研究以解决H3K9me3在α重复序列富集对这些基因下调的贡献。比较在相同遗传背景（同一细胞系）中具有和不具有特定内含子α重复序列的基因的表达，有助于解决α重复序列在热应激时调节基因表达的潜力。然而，丰富的重复元素(Alu公司和大多数基因间AR相邻的内含子AR和基因间AR阻止了使用CRISPR/Cas9消除α重复和创建适合进一步研究的修饰细胞系。对于基因间α重复序列，我们假设它们与最近的5′和3′定位基因相关，然而，由于基因组的三维结构，一些基因间重复序列可能与更遥远的基因相关，这只能根据高分辨率染色质相互作用图进行分配。与分散的α重复序列相关的基因数量很少（46），基因本体分析显示该基因集中没有显著丰富的路径或分子功能。然而有趣的是，一些α-重复相关基因与压力或疾病相关：NR3C1号机组应激激素结合后参与基因表达调控的糖皮质激素受体编码[44],HTRA3型在一些癌症中显示出显著下调的表达，它被认为是一种肿瘤抑制基因[45,46]同时VAV1型和PHF20L1型具有致癌性[47,48]. 此外，ZNF675型基因编码KRAB锌指蛋白，该蛋白特异性靶向LTR逆转录转座子的一个亚家族，并负责其沉默[49].
卫星DNA重复序列在整个基因组中的分散很可能是卫星DNA进化的分子机制的结果，这还需要更深入的研究才能完全阐明[2,50,51]. 我们认为，一些卫星重复序列的插入可能通过影响适当的基因表达或诱导基因突变而导致疾病，正如在跨膜丝氨酸蛋白酶基因的剪接受体位点插入人类β卫星重复序列所证明的那样[52]. 分散的卫星重复序列也可能通过这些高度同源元素之间的诱变重组导致基因组不稳定，如在Alu公司导致包括癌症在内的人类遗传病的重复性元素[53,54]. 此外，常染色卫星重复序列调节基因表达，在热应激时充当局部染色质结构的调节剂[18]或作为小RNA的来源，参与早期胚胎发育期间母体遗传转录物的降解[55]. 卫星DNA在物种进化中的相关作用已经被提出[56,57,58]但是，为了阐明分散的常染色卫星重复序列在基因表达调控和适应性进化中的作用，以及它们对疾病的潜在影响，还需要进一步的研究。

补充资料

以下内容可在线获取，网址为https://www.mdpi.com/2073-4425/11/66/663/s1图S1A:AR 29的多态性位于ZNF675型人类细胞系间基因；图S1B：。第29号AR基因内含子内短扩增子的序列ZNF675型基因；图S1C：的内含子的一部分序列NR3C1号机组包含杂合AR No10的HepG2细胞基因；图S2:171 bpα卫星单体的一致序列和qPCR中使用的引物的位置；图S3：RepeatMasker在基因内含子区域识别的重复序列的组织NR3C1号机组,ZNF675、，和PLA2G12型B类；图S4:HepG2细胞中分散AR的H3K9me3水平；图S5:H3K4me2/3水平，垂直排列和分散的α卫星重复序列；图S6：表达动力学VAV1型697细胞株中与分散AR 28相关的基因；表S1：用于α-重复序列插入多态性分析和ChIP-qPCR实验的引物列表；表S2：用于表达α-重复相关基因和α-卫星DNA的引物列表；表S3：散布在人类染色体上的α卫星重复序列列表；表S4：在存在和不存在催产素的情况下，HS后与分散的α卫星重复序列相关的基因的表达。

作者贡献

I.F.和Đ。美国构思了这项研究；I.F.、A.S.和M.M.进行了实验；Ž.P.进行生物信息学分析；I.F.和Đ。美国参与数据分析和解释；Đ.联合国和I.F.撰写了这篇论文。所有作者都阅读并批准了手稿。

基金

这项工作得到了克罗地亚科学基金会IP-2014-09-3733和IP-2019-04-6915的资助，“Adris”基金会向Đ捐款。Ugarković，意大利教育、大学和研究部（MIUR），基础研究投资基金（FIRB）和那不勒斯大学Federico II至I.Feliciello的国际工作人员流动计划。

致谢

我们感谢Ivica Rubelj、Koraljka Gall Trošelj和Renata Novak Kujundć提供细胞培养和细胞培养设施。我们感谢Mariastefania Antica、Sanja Kapitanovć、Andreja AmbriovićRistov、Anamaria Brozovć和Silva Katu-shićHećimoviá提供细胞培养，并感谢Mary Sopta批判性阅读手稿。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

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基因11 00663 g001 550
图1。分别在42°C下热应激2 h（0 min）、30 min和37°C下恢复1 h后，在标准条件下（无HS），α卫星DNA在细胞系OV-90、MJ90 hTERT、HepG2和Cal 27中的转录动力学。在每个细胞系上进行了两个实验。No表示标准化平均值No值。柱显示两个不同RT-qPCR实验的平均值，一式三份，误差条表示标准偏差。
图1。在标准条件下（无HS），在42°C下热应激2小时后（0分钟），在37°C下恢复30分钟和1小时，OV-90、MJ90 hTERT、HepG2和Cal 27细胞系中α卫星DNA的转录动力学。在每个细胞系上进行了两个实验。No表示标准化平均值No值。柱显示两个不同RT-qPCR实验的平均值，一式三份，误差条表示标准偏差。
基因11 00663 g001
基因11 00663 g002 550
图2。α卫星重复序列（AR）及其近端区域的H3K9me3水平。(A类)在α重复序列10，H3K9me3在MJ90 hTERT细胞中的分布情况(B类)α重复29(C)alpha重复序列19，并在其相邻区域定位到每个AR的0.5–6 kb(D类)内含子α卫星重复序列1、14、18、25、21、28、31和(E类)基因间α卫星重复序列No3、4、15、16、17、20和30，以及在1 kb 5′到基因间AR No5的区域。此外，还显示了位于每个α重复序列2–6 kb的区域的H3K9me3水平，无论是在5′还是3′位点。(F类)异染色质和(G公司)的内含子中的AR 10NR3C公司Cal 27和OV-90细胞以及HepG2细胞中的1个基因，其等位基因有（HepG2+）和无AR（HepG2-）(H（H）)在的内含子中的AR 29ZNF675型在Cal 27和OV-90细胞中，HepG2细胞以及相应的内含子区域中的基因没有α卫星重复。在标准条件下（无HS）、HS 2 h（0 min）、30 min（30 min）和1 h恢复后立即用ChIP耦合定量实时PCR测定H3K9me3水平。使用输入分数的无值对无值进行归一化，并表示H3K9me3水平。列显示三个独立实验的平均值，误差条表示标准偏差。
图2。α卫星重复序列（AR）及其近端区域的H3K9me3水平。(A类)在α重复序列10，H3K9me3在MJ90 hTERT细胞中的分布情况(B类)α重复29(C)alpha重复序列19，并在其相邻区域定位到每个AR的0.5–6 kb(D类)内含子α卫星重复序列1、14、18、25、21、28、31和(E类)基因间α卫星重复序列No3、4、15、16、17、20和30，以及在1 kb 5′到基因间AR No5的区域。此外，还显示了位于每个α重复序列2–6 kb的区域的H3K9me3水平，无论是在5′还是3′位点。(F类)异染色质和(G公司)的内含子中的AR 10NR3C公司1基因在Cal 27和OV-90细胞中以及在具有（HepG2+）和不具有AR（HepG2-）的等位基因的HepG2细胞中(H（H）)的内含子中的AR 29ZNF675型在Cal 27和OV-90细胞中，HepG2细胞以及相应的内含子区域中的基因没有α卫星重复。在标准条件下（无HS）、HS 2 h（0 min）、30 min（30 min）和1 h恢复后立即用ChIP耦合定量实时PCR测定H3K9me3水平。使用输入分数的无值对无值进行归一化，并表示H3K9me3水平。列显示三个独立实验的平均值，误差条表示标准偏差。
基因11 00663 g002
基因11 00663 g003 550
图3。HS后与分散α卫星重复序列相关的基因表达动力学。的表达式：(A类)ZNF675型与多态性α卫星重复序列29相关，该重复序列存在于MJ90 hTERT和HepG2细胞系中，在标准条件下（无HS），HS 2小时（0分钟）和恢复30分钟后立即在Cal 27和OV-90中缺失(B类)NR3C1号机组在两个等位基因都存在α重复序列10的MJ90 hTERT、Cal 27和OV-90细胞系中，以及(C)NR3C1号机组在标准条件下（无HS）、热应激2小时（0分钟）、恢复30分钟和1小时后，有（HepG2+）和无（HepG2-）α重复序列10的等位基因在HepG2细胞中的等位蛋白特异性表达(D类)SLC30A6、PRIM2、STAM、，和MYO1E公司内含子和SLC40A1、ASNSD1、ST6GAL1、HTRA3、ACOX3、INTS1、PHF20L1、DIP2C与基因间α重复序列相关。在标准条件下（无HS）和在HS 2小时（0分钟）后立即在MJ90hTERT细胞系中分析表达。在(A类–C)No代表每个基因的标准化平均No值。在(D类)相对No值是通过将每个No值除以每个基因的No控制值（No-HS）得到的。柱显示两个不同RT-qPCR实验的平均值，一式三份，误差条表示标准偏差。
图3。HS后与分散α卫星重复序列相关的基因表达动力学。的表达式：(A类)ZNF675型与多态性α卫星重复序列29相关，该重复序列存在于MJ90 hTERT和HepG2细胞系中，在标准条件下（无HS），HS 2小时（0分钟）和恢复30分钟后立即在Cal 27和OV-90中缺失(B类)NR3C1号机组在两个等位基因都存在α重复序列10的MJ90 hTERT、Cal 27和OV-90细胞系中，以及(C)NR3C1号机组在标准条件下（无HS）、热应激2小时（0分钟）、恢复30分钟和1小时后，有（HepG2+）和无（HepG2-）α重复序列10的等位基因在HepG2细胞中的等位蛋白特异性表达(D类)SLC30A6、PRIM2、STAM、，和MYO1E公司内含子和SLC40A1、ASNSD1、ST6GAL1、HTRA3、ACOX3、INTS1、PHF20L1、DIP2C与基因间α重复序列相关。在标准条件下（无HS）和HS 2小时（0分钟）后立即在MJ90 hTERT细胞系中分析表达。在(A类–C)No代表每个基因的标准化平均No值。在(D类)相对No值是通过将每个No值除以每个基因的No控制值（No-HS）得到的。柱显示两个不同RT-qPCR实验的平均值，一式三份，误差条表示标准偏差。
基因11 00663 g003
基因11 00663 g004 550
图4。(A类)在组蛋白甲基转移酶抑制剂chaetocin的存在下，HS后α卫星重复序列及其邻近区域的H3K9me3水平。MJ90 hTERT细胞中的H3K9me3水平位于内含子α-卫星重复序列1、10、14、18、19、25、21、28、29、31号，以及距离每个α-重复序列2–6 kb的区域，位于5′或3′位点。在Cal 27、OV-90和HepG2细胞中，多态性AR 10和29显示出H3K9me3水平。AR 29在Cal 27和OV-90细胞中缺失（29-），而AR 10在HepG2细胞的单个等位基因中缺失（10-）。(B类)在毛霉素存在下HS后与分散α卫星重复相关的基因表达。与6个内含子AR（1、10、14、19、25和29）以及8个基因间AR相关的基因在MJ90 hTERT细胞中表达。基因的表达ZNF675型和NR3C1号机组在Cal 27（AR 29-）、OV-90（AR29-）和HepG2（AR 10-）细胞中也检测到与多态性AR 29和10相关的基因。在42°C的热应激2 h期间，用150µM毛霉素处理细胞。HS后立即测定H3K9me3水平和基因表达，并与不含毛霉素的对照组进行比较。通过ChIP-qPCR测量H3K9me3，使用输入分数的No值对No值进行归一化，并显示通过将每个No值除以对照的No值（无毛霉素）得到的相对No值。基因的表达以相对No值表示，该值是通过将每个No值除以每个基因的对照No值（无毛霉素）得到的。柱显示两个不同qRT-PCR实验的平均值，一式三份，误差条表示标准偏差。
图4。(A类)在组蛋白甲基转移酶抑制剂Suv39H1存在下，HS后α卫星重复序列及其邻近区域的H3K9me3水平。MJ90 hTERT细胞中的H3K9me3水平位于内含子α-卫星重复序列1、10、14、18、19、25、21、28、29、31号，以及距离每个α-重复序列2–6 kb的区域，位于5′或3′位点。在Cal 27、OV-90和HepG2细胞中，多态性AR 10和29显示出H3K9me3水平。AR 29在Cal 27和OV-90细胞中缺失（29-），而AR 10在HepG2细胞的单个等位基因中缺失（10-）。(B类)在毛霉素存在下HS后与分散α卫星重复相关的基因表达。与6个内含子AR（1、10、14、19、25和29）以及8个基因间AR相关的基因在MJ90 hTERT细胞中表达。基因的表达ZNF675型和NR3C1号机组在Cal 27（AR 29-）、OV-90（AR29-）和HepG2（AR 10-）细胞中也检测到与多态性AR 29和10相关的基因。在42°C的热应激2 h期间，用150µM毛霉素处理细胞。HS后立即测定H3K9me3水平和基因表达，并与不含毛霉素的对照组进行比较。通过ChIP-qPCR测量H3K9me3，使用输入分数的No值对No值进行归一化，并显示通过将每个No值除以对照的No值（无毛霉素）得到的相对No值。基因的表达以相对No值表示，该值是通过将每个No值除以每个基因的对照No值（无毛霉素）得到的。柱显示两个不同qRT-PCR实验的平均值，一式三份，误差条表示标准偏差。
基因11 00663 g004
表
表1。热应激后立即在分散的α-重复序列中H3K9me3水平的增加，以及不同人类细胞系中α-重复序列相关基因的下调水平。α-重复序列编号、重复序列中单体的数量、与α-卫星一致序列的相似性以及α-重复相对于基因的位置和距离及其与TSS的距离。这个对-使用unparied计算值t吨-测试。（-未确定；/不存在）。
表1。热应激后即刻离散α-重复序列中H3K9me3水平的增加以及不同人类细胞系中α-重复相关基因的下调水平。α-重复序列号、重复序列中单体的数量、与α-卫星共有序列的相似性，以及α-重复序列相对于基因的位置和距离及其与TSS的距离。这个对-使用unparied计算值t吨-测试。（-未确定；/不存在）。
α重复序列号/单体数量/与共识的相似性%HS和HS 2 h后H3K9me3（×）的增加对值α重复相关基因细胞系α重复序列相对于基因和距离的位置（bp）从TSS到Alpha重复的距离（bp）基因表达
1小时/2小时HS和对值
29/01.0 (0.211)ZNF675型加利福尼亚州27//-/1.0 (0.059)
29/01.0 (0.162)锌f675OV-90型//-/1.0 (0.087)
29/0.6 / 88%1.9 (0.012)ZNF675型MJ90小时内含子25,978-/1.7 (0.002)
29/0.6 / 88%2.1 (0.008)ZNF675型HepG2型内含子25,978-/1.7 (0.003)
10/1.1 / 86%2.0 (0.011)NR3C1型MJ90小时内含子125,971-/3.5 (0.002)
10/1.1 / 86%3.2（0.014）NR3C1+等位基因HepG2型内含子125,971-/2.7 (0.004)
10/01.0 (0.158)NR3C1等位基因HepG2型//-/1.0 (0.061)
10/1.1 / 86%2.1 (0.012)NR3C1号机组加利福尼亚州27内含子125,971-/3.7 (0.007)
10/1.1 / 86%1.7 (0.017)NR3C1号机组90年7月内含子125,971-/2.7 (0.012)
28/1.2 / 70%3.7 (0.006)VAV1型MJ90小时内含子25,978/
28/1.2 / 70%-VAV1型697内含子46,4922.6/- (0.001)
1/0.7 / 82%4.1 (0.009)SLC30A6型MJ90小时内含子48094个-/2.0 (0.003)
14/1.7 / 70%2.5 (0.011)PRIM2系列MJ90小时TERT内含子59,161-/2.8 (0.015)
18/0.5 / 76%4.3 (0.012)STAM公司MJ90小时内含子9163-/2.0 (0.004)
19/2.4 / 74%3.6 (0.006)PLA2G12B系列MJ90小时内含子15,104/
25/1.2 / 88%3.9 (0.018)MYO1E公司MJ90小时TERT内含子152,899-/2.3 (0.005)
21/0.7 / 85%4.0 (0.005)DLG2（数据链路2）MJ90小时内含子197,351/
31/1.3 / 71%2.8 (0.011)地图7MJ90小时内含子15,483/
3/1.4 / 77%2.1 (0.012)SLC40A1型MJ90小时5′/3888838,888-/2.0 (0.003)
3/1.4 / 77%-ASNSD1MJ90小时TERT5′ / 46,19046,190-/2.3 (0.014)
4/1.4 / 70%1.9 (0.014)ST6GAL1型MJ90小时3′ / 29,520174,981-/2.1 (0.001)
5/3.4 / 75%1.8 (0.012)HTRA3型MJ90小时3′ / 34,94272,296-/5.6（0.011）
5/3.4 / 75%-环氧乙烷3MJ90小时3′ / 24,32898,092-/1.7 (0.009)
15/2.0 / 86%2.0 (0.011)内景1MJ90小时5′ / 14,58014,850-/2.0 (0.013)
16/0.5 / 72%2.3 (0.018)PHF20L1MJ90小时3′ / 15,77289,221-/2.9 (0.010)
17/0.5/94%4.1 (0.011)DIP2C型MJ90小时5′ / 18,15818,158-/1.8 (0.010)
20/1.0 / 86%2.4 (0.014)OR6A2型MJ90小时5′/ 14,53114,531/
30/1.0 / 70%1.7 (0.012)PPP2R3B型MJ90小时5′/16060毫米16,060/

分享和引用

MDPI和ACS样式

费利西耶罗，I。；塞尔梅克，A。；佩泽尔。；Matulić，M。；Ugarković，Đ。热应激影响人类α卫星DNA重复序列的H3K9me3水平。基因 2020,11, 663.https://doi.org/10.3390/genes11060663

AMA风格

费利西耶罗一世、塞尔梅克A、佩泽尔、马图利奇M、乌加尔科维奇。热应激影响人类α卫星DNA重复序列的H3K9me3水平。基因. 2020; 11(6):663.https://doi.org/10.3390/genes11060663

芝加哥/图拉宾风格

Feliciello、Isidoro、Antonio Sermek、Zhi eljka Pezer、Maja Matulić和Ugarković。2020年，“热应激影响人类α卫星DNA重复的H3K9me3水平”基因11，编号6:663。https://doi.org/10.3390/genes11060663

请注意，从2016年第一期开始，该杂志使用文章编号而不是页码。请参阅更多详细信息在这里.

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