SS-31靶向线粒体可改善癌症和化疗所致恶病质患者的全身能量状态

简单摘要

癌症恶病质是一种衰弱综合征，由肿瘤生长和化疗引起。骨骼肌是恶病质期间受影响的主要组织之一，表现为代谢和功能改变，导致进行性组织萎缩。在目前的研究中，我们旨在通过药物改善线粒体靶向化合物SS-31的代谢功能来对抗恶病质。无论是否接受化疗（奥沙利铂加5-氟尿嘧啶），实验性癌症恶病质都是通过C26荷瘤小鼠获得的。SS-31被证明可以有效地挽救肿瘤和化疗对骨骼肌和肝脏造成的一些代谢损伤，改善全身能量控制。不幸的是，当顽固性恶病质继发时，这种影响在疾病晚期不再存在。总之，我们提供了针对线粒体功能的潜在新治疗方法的证据，以对抗或延缓癌症恶病质。

摘要

目标：恶病质是一种复杂的代谢综合征，经常发生在癌症患者中，并因化疗而加剧。在癌症宿主的骨骼肌中，线粒体功能异常导致氧化能力降低和细胞内ATP含量降低。方法：本研究旨在评估线粒体靶向化合物SS-31在接受或不接受化疗（OXFU：奥沙利铂加5-氟尿嘧啶）的C26荷瘤小鼠中对抗肌肉萎缩和代谢改变的能力。结果：与心磷脂脂肪酸链改变相关的C26小鼠线粒体功能障碍。SS-31选择性靶向心磷脂部分抵消了身体消耗，并阻止了糖酵解肌纤维面积的减少。SS-31促进了肌肉线粒体琥珀酸脱氢酶（SDH）的活性，并挽救了细胞内ATP水平，尽管它不能抵消线粒体蛋白质的损失。逐渐增加的SS-31给C26 OXFU小鼠的剂量表明，在难治性终末期疾病发作之前（28天），SS-31对体重和肌肉重量的减轻具有短暂（21天）的有益影响。第21天，SS-31阻止线粒体丢失和异常自噬/有丝分裂。对骨骼肌、肝脏和血浆代谢组进行了分析，显示肿瘤宿主的能量和蛋白质代谢发生了显著变化。SS-31部分调节骨骼肌和肝脏代谢组，可能反映了系统能量稳态的改善。结论结果表明，在预防癌症恶病质方面，靶向线粒体功能可能与靶向蛋白质合成代谢/分解代谢一样重要。考虑到这一点，包括SS-31在内的前瞻性多模式治疗是有保证的。

1.简介

恶病质是一种经常与癌症相关的复杂疾病，是一种以骨骼肌和脂肪组织的高分解代谢为特征的消瘦综合征，它使患者的管理极为复杂，降低了抗癌治疗的耐受性和有效性，最终导致多达30%的癌症患者死亡[1]. 尽管癌症恶病质与患者的生活质量和生存相关，但仍缺乏有效的治疗方法。迄今为止，大多数旨在对抗恶病质的努力都集中在保留骨骼肌上，以保持患者良好的身体形态，从而采取尽可能有效的抗癌治疗方案。

肌肉蛋白质高分解代谢被认为是肿瘤衍生信号因子和宿主驱动炎症反应的直接作用的结果[2]. 相反，由于恶病质是一种系统性疾病，包括厌食和静息能量消耗增加，肌肉和全身水平的能量代谢改变可能是组织高分解代谢的主要间接原因[三]，可能代表未来干预的理想目标。除了能量摄入和消耗之间的不平衡外，恶病质的能量不足可能是组织代谢障碍的结果。这一假设得到了几份显示肿瘤宿主骨骼肌线粒体改变的报告的支持（综述于[4])。从代谢角度来看，恶病质动物的骨骼肌中发现氧化能力降低和细胞内ATP含量低[5]. 除了肿瘤引起的改变外，化疗还对肌肉质量和功能产生负面影响，严重影响肌肉和全身能量代谢[6]. 我们最近报道，至少在实验性癌症恶病质中，肌肉线粒体功能障碍与蛋白质高分解代谢有关，过度自噬和有丝分裂与线粒体呼吸受损有关[7]. 在荷瘤小鼠中，线粒体改变先于肌肉高分解代谢和质量损失的实验证明[8]促进以线粒体为靶点的前瞻性治疗方法的优化。在这方面，最近在实验性癌症恶病质中测试了几种旨在通过不同机制作用并主要间接靶向线粒体来改善能量状态的化合物，这些化合物支持这一假设（综述于[4,9])。尽管这些分子具有部分有益作用，但没有一种直接提高线粒体效率。事实证明，Szeto-Schiller肽（SS-31）通过靶向心磷脂，可以有效对抗衰老和几种疾病中观察到的线粒体功能障碍[10,11,12,13,14,15,16]是嵴结构和线粒体整体功能所必需的磷脂[17,18].

本研究旨在测试通过全身给药SS-31增强线粒体功能是否可以通过改善线粒体功能和影响全身代谢组，对荷瘤小鼠（无论是未经治疗的还是长期暴露于化疗的）的肌肉萎缩产生益处。结果表明，SS-31对荷瘤动物具有有益作用，与化疗暴露无关。这种效应似乎主要是通过作用于全身代谢而不是针对肌肉特定的分子改变来实现的。

2.结果

2.1. SS-31靶向心磷脂对恶病质的部分缓解作用不影响肿瘤生长

初步观察显示，与对照动物相比，从C26宿主腓肠肌分离的线粒体中，心磷脂和磷脂酰甘油（心磷脂前体）脂肪酸链发生变化，即含有油酸（18:1）链的物种减少(图S1)，支持肿瘤生长引发肌肉线粒体内在改变的观点。

为了靶向肌肉线粒体，每天给C26荷瘤（C26）小鼠或化疗（OXFU）治疗的C26小鼠服用SS-31（参见图S2a用于实验设计），目的是在接近接受化疗的癌症患者的实验环境中了解药物的效果。

SS-31首先在C26细胞培养物中进行测试，单独或与奥沙利铂或5-氟尿嘧啶联合使用，以排除对化疗诱导的细胞毒性的任何干扰。SS-31处理不影响细胞增殖、凋亡和细胞周期分布(图S3).

正如预期的那样，奥沙利铂和5-氟尿嘧啶降低了C26细胞（G₂/M和S，分别用于奥沙利铂和5-氟尿嘧啶），与SS-31暴露无关(图S3).

转入体内研究，与对照组相比，C26肿瘤在小鼠体内生长14天，体重减轻了26%(图1a） 与双侧胫骨前下部质量相关（TA；−36%；图1b） 和腓肠肌（GSN；−36%；图1c） 。如前所述[5]C26宿主（C26 OXFU）服用OXFU后，生存期延长（100%生存至肿瘤植入后第28天），尽管诱发了严重的身体症状（与对照组相比，为-23%；图1a） 和肌肉重量减轻（TA：-51%；GSN：-44%；图1b、 c）。SS-31给药（2 mg/kg）部分缓解了C26小鼠的体重减轻（与未治疗的C26相比增加11%；图1a） 但它并没有纠正肌肉萎缩(图1b、 c）。SS-31不能阻止C26 OXFU小鼠的体重和肌肉重量减轻(图1a–c）。在对照组小鼠中，肌肉力量在实验期间增加，早期服用SS-31可增强这种增加(图1d） ●●●●。C26诱导的肌肉萎缩与C26和C26 OXFU小鼠的肌肉力量损失相关。与对照小鼠类似，SS-31仅在14天后改善C26 OXFU小鼠的肌肉力量，但在C26小鼠中无效(图1d） ●●●●。C26和C26 OXFU小鼠的糖酵解和氧化肌纤维横截面积（CSA）均较低，这与肌肉质量和强度受损一致(图1e） ●●●●。值得注意的是，SS-31保留了C26宿主糖酵解纤维的大小。另一方面，SS-31没有改善C26 OXFU小鼠的糖酵解或氧化纤维CSA(图1e） ●●●●。

与肌肉质量类似，C26宿主性腺白脂肪组织（WAT）重量显著低于对照组（-94%），在C26 OXFU小鼠中几乎检测不到(图S4a). SS-31在对照小鼠中诱导了更大的WAT重量（+25%），在C26宿主中也观察到类似的趋势（+9%；图S4a). 至于其他组织，心脏重量不受肿瘤生长的影响，而肝脏重量比对照组大32%，SS-31给药无法挽救(图S4b). 与我们之前的发现一致[5]，肿瘤对OXFU给药产生耐药性，而与我们的体外实验相似(图S3)，SS-31对肿瘤大小没有影响(图S4c).

2.2。SS-31改善肌肉能量，而不是线粒体数量

为了了解SS-31对肌肉线粒体状态的影响，对未经治疗或化疗的C26小鼠GSN肌肉中琥珀酸脱氢酶（SDH）活性、ATP水平以及线粒体生物发生和数量的标记进行了评估。C26和C26 OXFU小鼠均表现出SDH活性受损，后者也表现出细胞内ATP水平下降(图2a、 b）。在C26和C26 OXFU小鼠中，SS-31将SDH活性恢复到控制水平，尽管后者与未经治疗的C26 OXFU小鼠没有统计学差异(图2a） ●●●●。SS-31给药对ATP含量没有显著影响(图2b） ●●●●。C26和C26 OXU小鼠的线粒体功能改变与分子变化相关，包括线粒体生物发生主调节因子PGC-1α水平降低，SDHA和细胞色素降低c（c）含量，这两个线粒体丰度的标志(图2c） 。SS-31无法阻止任何这些改变，这表明其作用机制是基于线粒体功能的改善，而不是线粒体丰度的转录控制(图2c） ●●●●。

一贯地，线粒体功能障碍和负能量平衡与蛋白质合成代谢降低有关，正如C26小鼠蛋白质合成严重受损所证实的那样(图S5). SS-31虽然能够恢复SDH活性，但无法显著挽救蛋白质合成代谢。

2.3. 在顽固性恶病质发作前的中间时间点增加SS-31剂量更有效

SS-31在改善癌性恶病质方面的部分鼓励作用，特别是在短期实验环境中（即在未治疗的C26宿主中14天或OXFU治疗的中间时间点），与28天时C26 OXFU小鼠的晚期难治状态相比，促使我们调查逐渐增加的SS-31给药（每周2-5-10毫克/千克；图S2b)在C26 OXFU小鼠中，也在中间时间点（即肿瘤注射后第14天和第21天）收集组织。在肿瘤植入后第21天，通过SS-31（与未治疗组相比增加16%），C26 OXFU小鼠的预期体重逐渐减轻（与对照组相比减少-40%）(图3a） ●●●●。TA肌肉也观察到类似的保护作用（与未治疗相比增加21%；图3b） 而该药物对腓肠肌没有任何显著影响(图3c） 。与对照组和基线相比，C26 OXFU小鼠的肌肉功能逐渐下降(图3d） ●●●●。注射肿瘤后14天和28天，SS-31治疗的C26 OXFU动物的肌肉力量与第0天相当，并且显著高于未治疗的肿瘤宿主(图3d） ●●●●。

C26 OXFU小鼠的体重减轻和肌肉萎缩与WAT重量的逐渐减轻平行，在肿瘤注射后第21天和第28天，WAT重量完全耗尽，而与SS-31治疗无关(图S6a). 在第14天和第28天，C26 OXFU小鼠的心脏重量较低，而肝脏质量没有受到影响(图S6b、c). 在第28天观察到的C26 OXFU小鼠的心脏重量损失在SS-31处理的小鼠中无法评估(图S6b). 此外，无论SS-31给药情况如何，肿瘤大小在不同实验点逐渐增大(图S6d).

为了了解SS-31诱导的身体和肌肉消瘦的改善是否是由线粒体内环境平衡的改变触发的，我们评估了线粒体蛋白质和自噬/有丝分裂标记物的水平(图4). 在C26 OXFU小鼠的肌肉线粒体中，细胞色素c（c）降低，而COX IV没有显著影响(图4a） ●●●●。细胞色素c（c）减少与自噬相关蛋白LC3 II增加、线粒体标记物BNIP3（线粒体定位的BNIP3同二聚体；60 kDa）、PINK1和parkin增加相关，因此表明线粒体降解机制与对照动物相比过度激活(图4a） ●●●●。细胞溶质部分的LC3 II和BNIP3（细胞溶质单体；30 KDa）水平也增加，而PGC-1α水平下降(图4b） ●●●●。SS-31部分阻止了线粒体富集部分LC3 II和PINK1的增加(图4a） ●●●●。此外，在经SS-31处理的C26 OXFU小鼠中未检测到PGC-1α水平的改变(图4b） ●●●●。上述C26 OXFU小鼠肌肉中的分子改变导致ADP和琥珀酸偶联的离体线粒体最大呼吸均严重降低。SS-31没有纠正这种损伤，这表明尽管抵消了上述一些改变，SS-31仍不能有效恢复离体肌肉线粒体呼吸(图4c） ●●●●。

在终止时间点（肿瘤注射后第28天；图S7). 在富含线粒体的部分，COX IV和细胞色素c（c）水平下降，而LC3 II、PINK1和parkin增加(图S7a). 在细胞溶质部分，PGC-1α的减少与LC3 II和BNIP3的积累平行(图S7a、b). 与第21天相似，线粒体蛋白和自噬/有丝分裂标记物的改变与线粒体呼吸能力下降相关(图S7c). 与难治性恶病质的概念一致，SS-31给药对线粒体呼吸没有显著影响。至于与线粒体内稳态有关的分子，SS-31只能阻止帕金积聚(图S7a).

2.4. 肌肉、肝脏和血浆代谢组显示SS-31改善了系统能量状态

为了了解SS-31靶向线粒体如何影响癌症和化疗诱导的恶病质中的局部和全身能量代谢，我们使用基于NMR的方法分析了肿瘤注射后第21天C26 OXFU小鼠骨骼肌、肝脏和血浆的代谢组学特征，如[6]. 与肌肉线粒体功能的显著变化一致，一些代谢物受到严重影响(图5a） ●●●●。在C26 OXFU小鼠中观察到肌肉NADH减少(第页-值=0.051），支持癌症诱导氧化还原代谢紊乱的新概念[19]也与降低的琥珀酸水平一致。在C26 OXFU小鼠中观察到氨基酸谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸的增加，表明蛋白质降解增加。这些代谢组变化均未受到SS-31的影响。有趣的是，代谢产物、丙氨酸和ATP是唯一明显受到SS-31治疗影响的物质，这两种物质在C26 OXFU组之上都显著增加。

肝脏代谢组显示出组间最大数量的代谢差异(图5b） ●●●●。其中一些显著差异的箱线图如所示图S8。

C26 OXFU组的血糖水平显著降低，SS-31治疗使血糖水平显著恢复到对照水平。为了进一步研究肝脏中的碳水化合物代谢，我们测量了糖原水平，发现C26 OXFU组的糖原水平下降更为显著，而SS-31组的糖元水平恢复更为显著。与肌肉一致，支链氨基酸在C26 OXFU组中增加，SS-31对支链氨基酸没有显著影响。C26 OXFU组的肝脏谷胱甘肽水平下降，SS-31治疗导致显著恢复，表明对肝脏氧化应激反应的影响。C26 OXFU组胆碱水平显著升高，可能表明SS-31缓解了脂肪酸代谢的失调。

还观察到血浆代谢组的显著变化（参见图S9). 与肝脏结果一致，SS-31显著降低并部分缓解了血糖水平。在C26 OXFU中观察到包括天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸在内的氨基酸的减少。在氨基酸中，只有谷氨酰胺被SS-31改变，使其恢复到控制水平。

3.讨论

本研究旨在测试增强线粒体功能以抵消C26肿瘤生长和化疗诱导的代谢变化的有效性，以最终改善恶病质。该结果综合了未经治疗或SS-31治疗动物的组织和系统水平的数据，强调了癌症恶病质应被视为一种系统性能量消耗障碍[20]. 根据这一点，目前主要基于体重减轻和炎症的诊断标准没有考虑代谢改变的循环标志物。能量代谢障碍可以很容易地被非侵入性检测出来，并可能从系统的角度监测恶病质的发生和发展，尤其是为了监测抗恶病质治疗的反应。

迄今为止，肿瘤衍生因子和全身炎症被认为是恶病质的主要驱动因素[2]尽管细胞因子靶向或作为生物标记物的使用因癌症患者中观察到的高度异质性而失败。本研究报告的结果推动了线粒体效率的提高，将其作为改善肌肉和全身能量代谢的工具。沿着这一思路，目前的数据集指出能量稳态是一个可能的治疗目标，也有助于监测治疗效果和预测生存率。事实上，考虑到：a）肌肉质量和功能的丧失与癌症恶病质发病率/死亡率之间的联系[21]以及b）骨骼肌与维持全身能量稳态的相关性[22]能量衰竭与患者死亡的因果关系是可以想象的。

SS-31治疗线粒体功能障碍相关疾病的有效性被归因于其促进氧化代谢或对抗氧化应激的能力[18]. 在实验性癌症和化疗诱导的恶病质中，观察到的导致底物氧化受损的线粒体改变可能依赖于内在和外在机制。至于内在的，磷脂酰甘油和心磷脂的改变部分解释了电子传递链（SDH）活性和耗氧量降低的原因。线粒体磷脂的改变与先前报道的癌细胞中心磷脂链的显著组成变化一致[23]. 先前有人认为，当细胞仅依赖脂肪酸的从头生物合成时，心磷脂库主要由棕榈油酸和油酸组成[24]. 磷脂中油酸链的减少（参见图S1)可能是由于脂肪酸从头合成受损，支持了这样的观点，即在荷瘤小鼠中观察到的代谢变化是由具有功能性后果的肌肉线粒体膜的修饰触发的。SS-31对SDH活性的拯救与它通过与富含心磷脂的膜结合介导的“有丝分裂保护”作用相一致[25]. 事实上，SDH功能以前被证明是心磷脂依赖性的[26]最近的一项研究表明，SS-31通过与心磷脂结合，与参与ATP生成的12种蛋白质相互作用[27]. 此外，在实验性炉缸衰竭中，长期SS-31治疗可以抵消疾病进展，甚至可以恢复心磷脂含量和线粒体动力学[14,28]. 相比之下，SS-31不能改善呼吸测定可能表明线粒体损伤严重到足以超过药物产生的潜在益处，尽管需要对线粒体动力学和超微结构进行更深入的分析来澄清这一点。此外，应考虑到晚期恶病质肿瘤荷瘤小鼠和化疗治疗小鼠的药物代谢动力学较差，如其他药物类别的癌症患者所示，这可能限制SS-31的分布[29]. 一直以来，将SS-31直接添加到健康和恶病质小鼠的分离肌肉线粒体中获得的初步结果（未显示）显示耗氧量增加，表明线粒体仍可能从SS-31治疗中受益。

在接受化疗的荷瘤小鼠中，参与氧化代谢的线粒体蛋白逐渐减少，这是由线粒体吞噬增加和生物发生受损触发的，这与SS-31的有限疗效相一致，在恶病质更严重的阶段，这种改变加剧时，这种作用将变得无效[5]. 这些观察结果表明，SS-31可能能够提高中度受损线粒体的线粒体效率，但它不能促进线粒体的生物生成，只能部分抵消线粒体吞噬的过度处置。有丝分裂增加可能是由于内在线粒体损伤或外在现象，如自噬流量增加和有丝分裂基因诱导。这两种外源性事件都发生在接受化疗或不接受化疗的荷瘤小鼠的骨骼肌中[5,7,30]. 在C26 OXFU小鼠中观察到的有限的SS-31效应与骨骼肌PGC-1α过度表达在相同的严重实验条件下的无效性一致[5]. 尽管在不同的背景下，PGC-1α的过度表达被证明能有效对抗Lewis肺脏荷瘤小鼠的肌肉萎缩，这是一种温和而缓慢的癌症恶病质模型[31].

线粒体功能的改善是耐力运动对抗癌症恶病质患者肌肉质量和功能丧失的主要机制，上述线粒体靶向方法可视为运动模拟物[32]. 考虑到肿瘤患者锻炼的可行性有限，因为有几个问题与癌症本身或其他共病相关，使得患者不合格，甚至不能耐受锻炼[33]SS-31模拟了运动的一些有益效果，可以通过提高运动耐受性和提高体力活动的有效性来扩大基于运动干预的目标受众，正如之前在肌肉减少衰老小鼠中所报道的那样[15]. 针对SS-31治疗和运动训练之间的相似性，本研究获得的结果证实了肌肉质量和肌肉力量之间的部分脱节。事实上，目前大多数针对恶病质的临床试验的主要终点是保持或增加瘦体重，但很少注意肌肉功能，这对患者的生活质量有相关影响。一直以来，ROMANA试验是最大的癌症恶病质3期临床试验之一，该试验测试了ghrelin类似物的效果，结果表明该药物在增加瘦体重方面具有有益作用，但不会提高肌肉力量[34]. 在基于ghrelin类似物的多模式治疗方案中加入SS-31或其他线粒体靶向化合物可分别改善肌肉功能和质量，从而更有效地惠及恶病质癌症患者。

随意性骨骼肌的消耗被认为是癌症恶病质的主要标志；然而，心脏和呼吸肌功能障碍已被证明同时发生[35,36]可能导致系统性能源浪费。最近发表的一篇论文表明，SS-31能够对抗C26肿瘤小鼠的心肺肌无力，缓解心脏和呼吸肌病[37]. 这项研究与目前的研究相比有几个不同之处，包括动物性别，这可能会影响恶病质敏感性和线粒体特征[38]，使用一个独特的C26克隆，缓慢诱导恶病质，最后小鼠不接受化疗。该结果有效地补充了当前的数据集，该数据集显示SS-31靶向不同的肌肉区室，在荷瘤小鼠中产生有益的效果。与目前的结果类似，Smuder及其合作者的研究表明，SS-31无法挽救肌肉质量，但可以有效改善肌肉功能。该机制主要依赖于氧化应激的预防，如其他病理条件如衰老性肌减少症所示[15]和神经毒性[39,40]. 抗氧化剂在癌症恶病质治疗中的应用仍然存在争议，目前不被认为是优先考虑的，而结合抗氧化活性和代谢改善的分子更有可能被证明是有效的[4]. 即使抗氧化剂SS-31的作用在理论上也可能被视为一把双刃剑，因为它不仅对肿瘤宿主有益，还可能有利于肿瘤生长和/或损害化疗效果。当前体外和体内结果似乎抛弃了这两个假设。更重要的是，考虑到肿瘤在宿主免疫细胞中引起的代谢改变和能量衰竭，从而产生癌症免疫逃逸，可以想象SS-31可能在提高肌肉功能的同时维持肿瘤免疫，正如使用免疫调节饮食的其他干预所建议的那样[41].

氧化应激对癌症恶病质的影响可被视为复杂系统性改变的一部分，其中心是线粒体功能障碍和氧化代谢降低。在携带C26的小鼠或接受化疗的动物中，有证据证实了这一假设，其中氧化应激与受损的TCA循环和β-氧化结合，从而尽可能长时间地增加肝脏的葡萄糖动员[6]. 按照这一思路，维持线粒体质量和功能听起来是一个很好的选择，以防止系统性的“生物能量灾难”，这可能导致癌症患者死亡。为了了解局部变化的重要性和SS-31给药的总体效果，当前的研究结果强调了关注肿瘤生长和化疗（因此包括肝脏）引起的全身代谢变化的重要性，而不仅仅关注骨骼肌。在不同组织间代谢串扰的更引人注目的例子中，SS-31诱导的肝脏葡萄糖和糖原的保留与肌肉ATP水平的维持平行，在能量可用性的系统控制和肌肉能量学之间提供了联系。同样，SS-31对肝脏的正常化作用明显强于肌肉代谢组，这并不意味着该药物的主要靶点是肝脏而不是肌肉。事实上，正如我们的研究和线粒体疾病所表明的那样，肌肉线粒体的“健康”对肝脏代谢组有显著影响[42]. 另一方面，临床前恶病质模型中已报道肝线粒体的改变[43,44]以及肝心磷脂调节异常[45]这表明只有在不同组织和循环中的综合分析才能解释这种复杂的背景。

4.材料和方法

4.1. 试剂

除非另有规定，否则所有使用的材料均来自默克-西格玛-奥尔德里奇公司（德国达姆施塔特）。

4.2. 动物与实验设计

所有动物实验均按照意大利卫生部指南和《实验动物人道护理和使用政策》（NRC 2011）进行护理。实验方案得到了都灵大学（意大利都灵）生物伦理委员会和意大利卫生部（Aut.Nr.579/2018-PR）的批准。在整个实验期间，将6周大的雌性BALB/c小鼠（Charles River，Calco，Italy）维持在12:12小时的暗-光循环中，控制温度（22°c），并自由获取食物（2018年全球饮食，Mucedola，Settimo Milanese，Italia）和水。

肿瘤宿主皮下注射5×10⁵如前所述的C26结肠癌细胞[46]. C26细胞在37°C、5%CO的湿润环境中，在体外保存在补充有10%FBS、100 U/mL青霉素、100µg/mL链霉素、100μg/mL丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺的DMEM中₂在空中。肿瘤植入当天，用胰蛋白酶分离C26细胞，将其重新悬浮在无菌盐水中并植入动物背部。从肿瘤植入当天开始，每隔一天记录一次小鼠的体重和进食量，尽管进食量是共用同一笼子的小鼠的平均进食量(n个=6–8），不能用于统计分析。在异氟烷麻醉下，在以下和中规定的不同时间点对动物实施安乐死图S2。快速切除几块肌肉和组织，称重，在液氮中冷冻，并储存在−80°C下以供进一步分析。无限制肿瘤生长或化疗的实验方案A.SS-31(图S2a).

将动物随机分为四组：对照组(n个=7），SS-31(n个=6）每日2 mg/kg腹腔注射溶于无菌盐水的SS-31，C26结肠癌携带者（C26，n个=16）和C26接受化疗（C26 OXFU，n个= 16). 化疗包括每周，从肿瘤生长的第7天开始，静脉注射奥沙利铂（6 mg/kg；意大利米兰雅阁医疗公司），然后（2小时后）注射5-氟尿嘧啶（50 mg/kg；雅阁医疗），并根据实际体重调整剂量。C26和C26-OXFU均被分为两个子组(n个=8个）接受生理盐水或2 mg/kg SS-31。在C26和C26 OXFU中，SS-31治疗分别在第4天或第7天开始。在达到人类终点或动物死亡之前，C26小鼠在第14天终止实验，C26 OXFU小鼠在第28天终止实验。实验方案B.SS-31增加C26 OXFU小鼠的剂量(图S2b).

将动物（69只）随机分为三组，每组23只，每组又分为三个组，即对照组(n个=7），C26 OXFU（与协议1相同；n个=8）和C26 OXFU接收SS-31(n个= 8). SS-31在肿瘤生长第7天至第13天以2 mg/kg的剂量给药，第14天至第20天以5 mg/mL的剂量给药剂，第21天至第27天以10 mg/mL的浓度给药剂。这三组动物分别在第14天、第21天或第28天处死。

4.3. 质谱脂质分析

采用“双层”沉积法将腓肠肌完整的线粒体富集组分沉积在MALDI靶上，如下所示：将浓度为0.4 mg/mL的线粒体浓缩组分悬浮液的1μL液滴沉积在MADDI靶上并在冷气流下干燥（第一层）；然后用9-AA基质溶液（20 mg/mL，2-丙醇-乙腈，60:40，v（v）/v（v）). 溶剂蒸发后，对样品进行分析。MS设置：在Microflex LRF质谱仪上获得MALDI-TOF质谱（德国汉堡Bruker Daltonics）。该系统采用脉冲氮激光器，发射波长为337nm；提取电压为20kV，采用门控矩阵抑制以防止探测器饱和。激光注量保持在阈值以上10%左右，以获得良好的信噪比。所有光谱都是在反射器模式下通过延迟脉冲提取获得的；本研究显示了在负离子模式下获得的光谱。光谱质量分辨率和信噪比由仪器软件“Flex Analysis 3.3”（Bruker Daltonics）确定。

4.4. 流式细胞术

C26电池（40000/cm²)用奥沙利铂（10µM）或5-氟尿嘧啶（1µM。H（H）₂O（运行）₂（10µM）作为应激诱导细胞死亡的阳性对照。将上述所有条件与2 h SS-31（10µM）预处理结合或不结合。处理48小时后，收集细胞（上清液和胰蛋白酶单层），使用50µL等分试样进行细胞计数，剩余部分离心，在磷酸盐缓冲液（PBS）中清洗，并在冰镇70%乙醇中固定。为了进行细胞毒性和细胞周期评估，细胞在RT下在含有0.4 mg/mL无DNA RNase和10μg/mL碘化丙啶的PBS中培养。死亡细胞根据DNA含量<2n进行测量。针对每种情况，实验一式三份。使用BD-Accuri C6流式细胞仪（美国新泽西州富兰克林湖BD Bioscences）收集数据，并使用C6分析软件（BD Biocenses）或FCS Express 4（美国加利福尼亚州帕萨迪纳De Novo软件）进行分析。

4.5。抓取测试

使用Panlab-Harvard仪器设备（西班牙巴塞罗那Panlab）评估肌肉力量。将小鼠的前肢和后肢放在连接到测力计的网格上，并在拉动动物的尾巴后记录力的测量结果。每只老鼠重复10次，休息30到60秒，其中最好的3次被记录下来。根据所考虑的实验方案，在肿瘤植入前、肿瘤生长第14天、21天和28天、动物处死前上午8点进行分析。

4.6. 组织学和琥珀酸脱氢酶（SDH）染色和酶活性

尸检期间，将一块胫骨前肌置于OCT中，并在融化的异戊烷中冷冻以进行组织学检查。横切面（10μM）在低温恒温器上切割并染色，以便SDH在37°C下与1 mg/mL NTB（硝基四氮唑蓝氯化物）和27 mg/mL琥珀酸钠在PBS中孵育30分钟。拍摄了几张照片，并对整个TA切面进行了数字重建。使用Image J软件（可在https://imagej.nih.gov/ij/，于2021年1月20日访问）。三位不同的研究人员对这些图像进行了分析。三名研究人员通过分析每组一块肌肉来验证个体间的可靠性。研究人员在进行分析时并没有对各组盲视。至于总SDH活性，将肌肉在150 mM冰镇NaCl、10 mM KH2PO4、0.1 mM EGTA中均质（5%wt/vol），并在800×g下离心5 min，收集上清液。将50µL蛋白质匀浆与含有10 mM琥珀酸钠、50μg/mL DCPIP、10 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、2 mM KCN、10 mM-CaCl2、0.05%BSA的200μL反应缓冲液孵育。针对蛋白质载量校正3至20分钟之间600 nm处的吸光度下降率，并用于计算相对SDH活性。

4.7. ATP细胞内含量

细胞内ATP浓度通过使用商用试剂盒（ATP生物发光检测试剂盒CLS II；瑞士巴塞尔罗氏）的生物发光测定。将来自腓肠肌的约50mg在PBS（10%wt/vol）中匀浆。然后将肌肉匀浆在100 mM Tris、4 mM EDTA（pH 7.75）中稀释10倍，在100°C下培养2分钟，并在1000×克收集上清液。将等分样品（50μL）添加到50μL荧光素酶试剂中的多孔黑板中（96孔-荷兰格罗宁根帕卡德）。在562 nm处测量发光，积分时间为3 s。从标准曲线数据的对数图中获得ATP浓度。

4.8. 西方印迹法

一半腓肠肌用于总蛋白提取物或富含线粒体的部分。通过在RIPA缓冲液中均质，然后在15000×克通过在冷线粒体分离缓冲液70 mM蔗糖、210 mM甘露醇、5 mM HEPES、1 mM EGTA、0.5%BSA（pH 7.2）中均质，然后在740×克为了去除不溶性部分。线粒体通过两个离心步骤在9000×克和10000×克收集上清液作为细胞质组分。在样品加载缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 6.8，100 mM DTT，2%SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油）中对等量的总蛋白提取物（30µg）或上清液（30μg）或线粒体蛋白（10µg。用含有0.05%吐温和5%非脂肪干乳（NFDM）的Tris缓冲盐水（TBS）封闭过滤器，然后用针对BNIP3（ab38621；英国剑桥Abcam）、COX IV（ab14744；Abcam，细胞色素c（556433；BD Bioscences）、LC3B（L7583）、PGC-1α（AB3242；Millipore，Darmstadt，Germany）、PINK-1（SAB2500794）、嘌呤霉素（3RH11；Kerafast，Boston，MA，USA）、SDHA（sc-377302；Santa Cruz Biotechnology）。过氧化物酶结合IgG（Bio-Rad）用作二级抗体。通过增强化学发光系统（Clarity Western ECL Blotting Substrates，Bio-Rad）在光敏膜（Hyperfilm ECL）上检测膜结合免疫复合物。根据GAPDH（G8795）表达或Ponceau-S染色标准化蛋白质负荷。使用TotalLab软件（英国泰恩河畔纽卡斯尔非线性动力学）通过密度分析对谱带进行量化。

4.9. 肌肉蛋白质合成：体内翻译表面传感

使用表面传感翻译（SUnSET）方法分析肌肉蛋白质合成[47]. 肿瘤移植后14天，保持自由进食状态的动物接受腹腔注射0.04μmol嘌呤霉素（每克实际体重溶解于200μL PBS中）。给药25分钟后，将小鼠麻醉，收集血液，并通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。在嘌呤霉素给药后30分钟，分离、称重并在液氮中快速冷冻胫骨和腓肠肌。如上所述，通过蛋白质总提取物的western blotting评估肌肉中嘌呤霉素结合的新生肽。

4.10. 体外线粒体呼吸试验

使用Seahorse XFe96细胞外通量分析仪（美国加利福尼亚州圣克拉拉安捷伦科技公司）评估线粒体耗氧量（OCR）。线粒体富集和处理方案根据制造商的说明书改编，用于分离线粒体的呼吸分析。简单地说，线粒体富集部分是从新鲜提取的腓肠肌中获得的，如western blotting部分所述。在9000×克和10000倍克，将颗粒重新悬浮在由70 mM蔗糖、220 mM甘露醇、10 mM KH组成的冷线粒体分析溶液中₂人事军官₄，5 mM氯化镁₂，2 mM HEPES，1 mM EGTA（不含BSA；pH 7.2）。蛋白质定量后，将0.2%BSA添加到线粒体中，并在Seahorse XF 96-well细胞培养微板中每孔镀4µg。线粒体呼吸分析开始于与10 mM谷氨酸/苹果酸的耦合状态；通过Seahorse FluxPak药盒将4 mM ADP和10 mM琥珀酸依次注入线粒体。通过添加1µM鱼藤酮/抗霉素A测量非线粒体呼吸。通过将非线粒体呼吸减去ADP或琥珀酸偶联呼吸值，获得OCR值。实验是为每个样品加载四个重复。

4.11. 核磁共振代谢组学分析

通过用500μL氘化磷酸盐缓冲液（pH 7.4）稀释100μL血浆制备血浆样品，该缓冲液含有（DSS；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA），最终浓度为0.5 mM，用作化学位移和定量参考。溶液通过10 kDa分子量截止过滤器（Millipore）过滤，以去除大蛋白。然后将样品置于5 mm核磁共振管中进行分析。按照前面描述的甲醇/氯仿水提取程序制备肌肉和肝脏组织以进行核磁共振分析[48]. 使用约100 mg的组织样本，并记录实际重量，以使数据正常化。核磁共振谱是在配备有TXI三重共振探针的Avance III 700 MHz核磁共振光谱仪（德国汉堡布鲁克）上获得的，该探针在25°C下工作。通过覆盖12 ppm的1D NOESY脉冲序列收集光谱。在3.9秒的采集时间内，用32768个点对光谱进行数字化。混合时间设置为100 ms，扫描之间的松弛延迟设置为2.0 s。最终使用Spectrus Processor软件（2016年1月版，加拿大安大略省多伦多市高级化学开发）处理所有数据。将光谱零点填充至65536点，并使用0.3-Hz衰减指数函数切趾，然后进行快速傅里叶变换。对所有样本进行自动相位校正和一阶基线校正。代谢物浓度使用Chenomx NMR Suite（8.2版，加拿大爱德蒙顿Chenomx）进行量化。DSS-d6用作所有光谱的化学位移和量化参考，并设置为0.00的化学位移以及500μM的浓度。在批处理模式下对每个光谱进行定量拟合，然后进行手动调整，以纠正光谱重叠引起的错误。

4.12. 糖原测定

使用商用系统（MAK016糖原检测试剂盒，Merck-Sigma Aldrich）评估肝糖原浓度。简单地说，大约50 mg的肝脏碎片在水中（10%w/vol）用珠状匀浆器冷均质，煮沸5′，在13000×克收集上清液并稀释100倍，然后将10μL加入96孔板中。按照制造商的说明并使用糖原滴定曲线进行分析，以推断定量数据。

4.13条。统计分析

所有结果均表示为平均值±SD或SEM，如图图例所示。使用SPSS软件（IBM、Armonk、NY、USA）分析差异的显著性，并由未配对学生的吨-当分布是正态分布（夏皮罗·威尔克正态性检验）且方差是均匀分布（勒文检验）时，使用Tukey的事后检验进行检验或方差分析。当分布不正态时，用非参数方差分析（Kruskal-Wallis检验和Bonferroni校正）分析数据。当方差不均匀时，采用Brown-Forsythe程序和Games-Howell事后检验，通过异方差方差分析对数据进行分析。对于实验方案A，通过方差分析进行成对比较，将SS-31与C26和C26 SS-31或C26 OXFU和C26 OXFU SS-31进行分组控制和比较。对于握力测试和比较第14、21和28天的数据（实验方案B），对重复测量进行方差分析，然后进行Bonferroni校正。差异被认为对第页< 0.05. 研究人员没有对实验组视而不见。

5.结论

总之，针对药理学肌肉线粒体获得的结果指向了一个明确的有效窗口，强化了早期干预是强制性的概念，以便在难治性恶病质发生之前获得切实的临床益处。总的来说，我们的数据支持未来的治疗干预，旨在测试SS-31改善的线粒体功能，以抵消肿瘤生长和化疗引起的恶病质能量浪费。随着以肿瘤细胞代谢为目标的抗癌治疗成为现实，以肿瘤和宿主代谢为目标改善癌症患者状况是提高患者生活质量和生存率的新挑战。