Dapagliflozin Improves Angiogenesis after Hindlimb Ischemia through the PI3K-Akt-eNOS Pathway

Han, Li; Ye, Guoxin; Su, Wenjing; Zhu, Yuankang; Wu, Wenqi; Hao, Liangshi; Gao, Jing; Li, Zhen; Liu, Fang; Duan, Junli

doi:10.3390/biom14050592

开放式访问第条

达帕格列嗪通过PI3K-Akt-eNOS途径改善后肢缺血后的血管生成

通过

李涵

^†,

叶国欣

^†,

苏文静

,

朱元康

,

吴文奇

,

梁实浩

,

京高

,

甄莉

,

刘芳（音）

^*和

段俊丽

^*

中国上海市孔江路1665号上海交通大学医学院附属新华医院老年科，邮编200092

^*

应向其发送信件的作者。

^†

这些作者对这项工作贡献均等。

生物分子 2024,14(5), 592;https://doi.org/10.3390/biom14050592

收到的提交文件：2024年3月24日/修订日期：2024年4月29日/接受日期：2024年5月8日/发布日期：2024年5月16日

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版本注释

摘要

:

近年来，抗糖尿病药物的血管保护作用受到了广泛关注。钠-葡萄糖协同转运蛋白2（SGLT2）抑制剂已证明可减少心血管（CV）事件。然而，达帕氟嗪对周围动脉疾病血管生成的治疗作用尚不清楚。本研究旨在探讨达帕氟嗪对后肢缺血后血管生成的影响及其机制。我们首先评估了达帕氟嗪对大鼠后肢缺血后血管生成的影响。采用激光多普勒成像检测后肢血流灌注。此外，我们使用免疫组织化学检测缺血后新毛细血管的密度。通过磷酸化蛋白组学检测，筛选了达格列酮影响缺血后血管生成的相关信号通路，并从人脐静脉内皮细胞（HUVECs）水平验证了达格列酮影响缺血后血管生成的机制。切除左股动脉后，将所有大鼠随机分为两组：达格雷福林组（左股动脉切除，连续21天给予达格雷福林（1 mg/kg/d）胃内喂养）和模型组，即：，阳性对照组（左股动脉切除，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（1mg/kg/d）灌胃，连续21天）。此外，添加了对照组，即阴性对照组（不切除左股动脉，连续21天用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（1 mg/kg/d）灌胃）。在术后第21天，达格雷福林治疗组的血液灌注最大，伴有毛细血管密度升高。结果表明，达帕氟嗪能促进后肢缺血后的血管生成。然后，取模型组和达格氟嗪组三只大鼠的缺血后肢内收肌组织样本进行磷酸化蛋白组学检测。结果表明，PI3K-Akt-eNOS信号通路与达帕氟嗪对缺血后血管生成的影响密切相关。我们的研究旨在从内皮细胞的角度验证这一机制。在体外，达格利福嗪可增强缺血和缺氧条件下HUVEC的管形成、迁移和增殖。此外，在体内和体外，达加氟嗪给药上调了血管生成因子磷酸化Akt（p-Akt）和磷酸化内皮一氧化氮合酶（p-eNOS）以及血管内皮生长因子A（VEGFA）的表达。这些益处可以被磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）或eNOS抑制剂阻断。达帕氟嗪能促进缺血后血管生成。这种效应可能通过促进PI3K-Akt-eNOS信号通路的激活来实现。本研究为外周动脉疾病的治疗提供了新的视角、新的思路和理论基础。

关键词：

达格列嗪;血管生成;PI3K-Akt-eNOS公司

1.简介

外周动脉疾病（PAD）是一种常见而严重的心血管疾病，易并发肢体缺血和心血管不良事件。PAD是由四肢动脉狭窄引起的，随着人口老龄化和糖尿病的流行，PAD的发病率和患病率都在增加[1]. PAD的治疗包括降低心血管事件增加风险和帮助改善血流的药物，以及血管内或外科修复或动脉阻塞旁路术[2]. 由于各种局限性，很大一部分PAD患者没有得到有效和充分的治疗，不得不接受残酷的截肢[三]. 因此，寻找安全有效的方法促进缺血部位血管生成已成为近年来的研究热点之一[4]. 目前，尽管PAD的药物治疗、外科旁路手术和导管介入治疗有了很大的变化，但各种治疗方法都有其严格的适应症[三]. 对于有严重合并症（如糖尿病、严重肾衰竭或心力衰竭）的患者，手术或介入导管治疗往往不合适，常规药物治疗的效果也不令人满意。那么，有没有新的口服药物对外周动脉疾病有良好的疗效？近年来，钠-葡萄糖转运蛋白2抑制剂（SGLT2is）已被批准作为一类新的降糖药物用于临床，其中，SGLT2i之一的达格列酮目前被批准用于治疗非糖尿病心力衰竭患者[5]. 达格列嗪可显著降低糖尿病和慢性肾脏病患者的心血管死亡总数，并对心脑血管具有保护作用[6]. 达菲对外周动脉有保护作用吗？我们打算研究达帕氟嗪对后肢缺血后血管生成的作用机制。达帕格列嗪是一种SGLT2i，是一类新型降血糖药物，可以抑制肾脏对葡萄糖和钠的吸收[7,8]. 近年来，有证据表明，达菲能显著减少糖尿病和慢性肾脏病患者因心血管原因死亡的总人数[9]. 此外，达帕氟嗪可能对非糖尿病性心力衰竭患者有益[9]. 达帕格列嗪对心肾血管有保护作用，但其潜在机制尚未完全了解，近年来研究发现不同类型的SGLT2i对不同靶器官的作用不同[6,9]. SGLT2的心血管益处的潜在机制尚不清楚，但似乎并不是由血糖控制的不同改善所介导的[10]. 虽然降低血压、动脉僵硬度、体重、内脏肥胖和/或肾内血流动力学被认为有助于SGLT2is的心血管益处，但这些药物对血管内皮细胞功能的直接影响尚未被考虑。本研究的目的是研究达帕氟嗪对后肢缺血后血管生成的影响及其机制[11,12].

2.材料和方法

2.1. 动物

SD雄性大鼠，8周龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司（中国上海），饲养于12:12小时光暗循环的温湿度控制室，可自由饮水和进食。所有动物研究和手术程序均由上海交通大学动物护理和使用委员会批准。所有手术均在麻醉下进行，并尽一切努力减少痛苦。

2.2. 大鼠后肢缺血模型及治疗

简言之，所有大鼠均通过腹腔注射戊巴比妥钠（60 mg/kg）麻醉[13]. 如前所述，通过手术诱发单侧后肢缺血[14]. 手术是通过切除左后肢的股动脉进行的，而相应的右后肢则未经手术而留下来作为自身对照。然后将大鼠随机分组。然后，将所有大鼠分为3组：（1）达格列酮组，左股动脉切除，给予达格列汀（1 mg/kg/d）灌胃，连续21天(n个= 10); （2）模型组即阳性对照组：左股动脉切除后，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（1mg/kg/d）灌胃，连续21天(n个= 10); 对照组，即阴性对照组：不切除左股动脉，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（1mg/kg/d）灌胃，连续21天(n个= 10). 达格列酮组大鼠连续21天接受达格列汀（1 mg/kg/d）的胃内喂养。模型组和对照组大鼠同时给予等量（1mg/kg/d）的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，连续21天。所有治疗从手术后24小时开始，给药持续到实验结束。在指定的时间点，通过激光多普勒成像仪（英国德文郡阿克斯敏斯特摩尔仪器有限公司）对后肢的血液灌注进行可视化和分析。在可视化之前，对大鼠进行麻醉，并脱毛后肢区域的毛发。通过计算缺血后肢（左后肢）和相应对照（右后肢）之间的比率来获得血液灌注率[15,16,17]在六个预定的时间点（手术前后以及术后第3、7、14和21天）。大鼠后肢的激光多普勒血流显像可以观察达帕氟嗪对后肢缺血后血管生成的促进作用。CD31免疫组织化学染色可以反映达格利福在促进后肢缺血后血管生成中的作用。术后第21天完成激光多普勒扫描后，对动物实施安乐死。采集血液样本和后肢收肌组织样本用于后续实验。

2.3. 一般情况和血液分析

实验开始时，即建立后肢缺血模型的当天（d0），实验结束时，即后肢缺血手术后的第21天（d21），分别对三组大鼠称重，并采集大鼠的外周血进行血糖测量，肝肾功能、血清钠、血钾、糖化血清蛋白等指标。采用日立7600-020全自动生化分析仪测定血糖、肝肾功能、血清钠钾、糖化血清蛋白等生化指标。

2.4。免疫组织化学分析

术后第21天完成激光多普勒扫描后，对动物实施安乐死。安乐死前，从腹主动脉取血，3000 r/min离心10 min，离心半径8 cm。取上清液，置于-80°C冰箱中保存。将大腿收肌浸泡在4%甲醛中，石蜡包埋，进行免疫组织化学分析。用免疫组化染色标记每个横截面（5μm）的毛细血管密度[18]. 简单地说，抗原检索和阻断程序之后，用山羊抗CD31抗体（BD，富兰克林湖，新泽西州，美国）和二级抗体（Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国。在显微镜下收集并分析图像，并将每个视野中微血管的平均数量计算为MVD值（个/HP）。

2.5. 蛋白质印迹分析（组织蛋白）

Western blotting检测各组大鼠缺血后肢肌肉组织中PI3K/Akt/eNOS信号通路蛋白的表达。从组织中提取总蛋白后，检测浓度和纯度，然后进行电泳，并转移到膜上。脱脂奶粉在室温下密封。在2小时内，将添加的一级抗体（抗eNOS、抗p-eNOS（Ser1177）、抗Akt、抗p-Akt（Ser473）、抗血管内皮生长因子A（VEGFA）（中国海门贝约泰））和内部参照物（抗-GAPDH（Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA））分别稀释为1:1000。第二天，添加二级抗体并在室温下孵育1h，清洗膜，并进行化学发光。根据每个蛋白带的灰度比值，计算相对蛋白表达。原始西方墨迹可在补充资料.

2.6. D标签无磷化蛋白质光谱

取模型组和达帕氟嗪组三只大鼠缺血后肢内收肌组织样本进行磷酸化蛋白组学检测。本实验的主要步骤包括从原始样品中提取的蛋白质的定量和质量检测、FASP酶解和改良肽富集、最终的机器检测和质谱数据的生物信息学分析。具体来说，我们进行了以下工作：（1）我们使用均质和SDT裂解方法从原始样品中提取蛋白质。首先，我们取大鼠后肢肌肉组织样本，然后添加适量的SDT裂解液并将其转移到裂解矩阵a管中，然后使用MP均质器进行超声均质。纸浆破碎进行两次（24×2，6.0 M/S，30 S）。超声处理后，我们将样品置于沸水中，浸泡10分钟，然后在14000×克取上清液15min，用0.22µm滤膜过滤，收集滤液。我们使用BCA方法进行蛋白质定量和等分样品，其余样品可以储存在−80°C。（2）。我们取每个样品20µg，加入6X负载缓冲液，在沸水中浸泡5分钟，进行12%分离凝胶SDS-PAGE电泳（恒定电压250 V，40分钟），并用考马斯亮蓝染色以检查蛋白质丰度。（3）我们从每个样品中提取100µg蛋白质裂解物，添加DTT至最终浓度100 mM，将其置于沸水浴中5分钟，然后冷却至室温。我们添加200μL UA缓冲液，充分混合，将其转移到30kD超滤离心管中，在12500×克15分钟后，丢弃滤液（我们重复此步骤一次）。我们添加100μL IAA缓冲液（UA中100 mM IAA），在600 rpm下摇晃1分钟，在室温黑暗中反应30分钟，在12500×克15分钟。我们添加100μL UA缓冲液并在12500×克持续15分钟。我们重复了两次这个步骤。我们添加了100μL 50 mM NH₄HCO公司_三溶液，在12500×克持续15分钟，重复此步骤两次。我们用新的收集管替换了收集管，添加了40μL胰蛋白酶缓冲液（4μg胰蛋白酶在40μL 50mM NH中₄HCO公司_三溶液），在600 rpm下摇晃1分钟，然后在37°C下放置16–18小时。我们在12500×克持续15分钟；我们添加了40μL 50 mM NH₄HCO公司_三溶液，在12500×克15min，收集滤液。C18筒用于脱盐肽。在肽冻干后，添加40μL 0.1%甲酸溶液以重组肽。用紫外分光光度计（OD280）对肽进行定量。（4）使用C18 Cartridge（Waters，WAT023590）柱对肽进行脱盐、冻干，然后用磷酸化肽进行富集。（5）使用Easy NLC系统以纳米级流速分离每个样品。缓冲溶液A为0.1%甲酸水溶液，缓冲溶液B为0.1%乙酸-乙腈水溶液（乙腈为80%）。用100%A溶液平衡色谱柱，并使用自动进样器以300 nL/min的流速将样品送至分析柱（Termo Fisher Scientific，Acclaim Pepmap RSLC 50μm×15 cm，Nano Viper，P/N164943）。色谱分离后，使用timsTOF-Pro（德国不来梅布鲁克）质谱仪的PASEF模式对样品进行质谱分析。分析时间为90 min，检测方法为正离子，前体离子扫描范围为100–1700 m/z，离子迁移率1/K0范围为0.75–1.4 V·s/cm²离子积累或释放时间为100ms，离子利用率为100%，毛细管电压为1500V，干燥气体速度为3L/min，干燥温度为180℃。PASEF的设置如下：10次MS/MS扫描（总循环时间为1.16 s），电荷范围0–5，动态排除时间0.5 min，离子靶强度10000，离子强度阈值2500，CID碎片能量20–59 eV。（6）使用数据库搜索软件PaSER（版本号：2023）进行质谱文件处理。该软件的TIMScore模式引入了CCS维度，为5D蛋白质组学提供了更高的PSM（肽-谱匹配）、肽和蛋白质识别号，大大增加了蛋白质序列覆盖率。在不支持CCS值的算法中，只能使用数据的两个维度来评估FDR。在支持CCS值的TIMScore算法中，候选肽可以从三维评估FDR，这可以提高结果的准确性和精确度，并有助于验证以前在传统二维数据中得分很低的PSM。（7）本项目选择Uniprot_Attus_norvegicus_20230312_54764_10116作为蛋白质比较数据库。

2.7. 生物信息学分析

（1）我们使用Blast2GO（V1.4.4）对目标蛋白集合执行GO注释。本项目中GO数据库中使用的版本号如下：GO.obo（2019年7月1日）。（2）我们使用KOALA（KEGG Orthology And Links Annotation，V2.3）软件对KEGG GENES数据库进行比较，用KEGG通路对靶蛋白集进行注释，将靶蛋白序列分为KO类，并根据所涉及的KO分类序列通路信息自动获得靶蛋白。KEGG数据库在本项目中使用的版本号为KO_INFO_END.txt（24.03.2023）。（3） GO/KEGG通路富集分析算法是一致的，并基于Fisher精确检验，比较每个GO条目或KEGG途径在目标蛋白集和整体蛋白集中的分布，以评估项目或KEGG通路富集的GO显著性水平。（4）域注释和富集分析使用Interpo数据库对差异蛋白质进行功能域注释分析。我们基于Fisher精确检验比较了目标蛋白在总蛋白集合中的分布，以评估特定功能域富集的显著性水平。（5）亚细胞定位分析WoLF-PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)软件（2023年3月16日访问）用于预测蛋白质的亚细胞定位。（6）聚类分析将目标蛋白集的定量信息规范化，然后使用Python中的matplotlib软件（版本号：V3.3.4）包同时对样本和蛋白质表达的两个维度进行分类（距离算法：欧几里德；连接方法：平均链接），最后生成了层次聚类热图。（7）转录因子分析使用AnimalTFDB3.0（动物转录因子数据库）进行转录因子预测分析。（8）利用String数据库进行蛋白质相互作用网络分析(网址：https://www.string-db.org/（版本号：V11.5），以通过AnyChart软件（V8.11.0.1934）获得直接或间接与目标蛋白相互作用的蛋白质列表，该软件可生成相互作用网络分析结果。（9）磷酸化保守基团序列分析利用肽数据表中的磷酸化修饰信息从相应的蛋白质序列（以磷酸化位点为中心，向前和向后延伸6个氨基酸）中提取并组织预对准肽集，然后使用Motif-X（模因-5.01）分析磷酸化丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基周围保守基序的软件。GO和京都基因和基因组百科全书（KEGG）分析用于进一步了解达帕氟嗪促进后肢缺血后血管生成的信号通路。

2.8. 细胞培养

人脐静脉内皮细胞（HUVECs）购自美国类型培养库（美国弗吉尼亚州马纳萨斯），并在补充有10%胎牛血清（美国纽约州格兰德岛Gibco）和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养（5%CO）₂，95%O₂). 注：在不含10%胎牛血清的DMEM培养基（美国纽约州格兰德岛吉布科）中培养被称为HUVEC的缺血和缺氧条件，并将其置于含5%CO的缺氧培养箱（HF 212UV；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科学有限公司）中₂，1%O₂和94%N₂在37°C下定期传代。

在进行后续的细胞实验之前，我们探索了用于HUVEC的适当剂量浓度的达帕氟嗪。我们设置了4个剂量浓度（1μm、5μm、10μm和20μm），并建立了空白对照组和DMSO对照组（达帕氟嗪用于DMSO溶解），分别干预细胞24 h，然后在缺血和缺氧条件下培养48 h。然后，各组细胞分别进行CCK-8实验以评估细胞增殖能力，跨阱实验以评估其迁移能力，Matrigel实验以评估小管形成能力，Western blot实验以检测相应促血管生成因子的蛋白表达。

2.9. 缺血/缺氧（I/H）模型及治疗

对于达格利福嗪治疗，用10%二甲基亚砜（DMSO）中溶解的达格利弗嗪指示剂量处理细胞24小时。达格利福嗪处理后，用不含胎牛血清（FBS）的DMEM替换培养基，并将细胞置于上述缺氧条件下48小时。将细胞分为4组：未经任何处理（I/H组）、用达格利福嗪处理的细胞（5μm，24h，达格利福嗪组，用L-名称的达格利福林处理的细胞（达格利福林+L-名称组，在达格利福林干预前给予L-名称干预60分钟）；此外，还增加了两个对照组，即正常血氧合组和正常血氧加达菲组。

2.10. CCK-8增殖能力测定

采用CCK-8法检测细胞增殖能力。简单地说，在HUVEC接受适当的处理并接种在96 well板中后，将10μL CCK-8（Dojindo Lab，Tokyo，Japan）溶液以1/10的稀释度添加到每个孔中，然后再培养2小时。使用微孔板读卡器（ELX 800；Bio-Tek，Winooski，VT，USA）在450 nm处测量吸光度。使用不同组中四个孔的平均光密度计算细胞存活率。

2.11. Transwell迁移分析

采用二十四孔Boyden transwell小室（美国马萨诸塞州剑桥市康宁市）测定细胞迁移。简言之，将原始孵育介质（600μL）加入下腔，并将相应的预处理HUVECs（1×10⁵/well/100μL）接种在无血清培养基的上腔中。24h后，用4%多聚甲醛固定并用结晶紫染色，然后用光学显微镜（×10倍放大）计数迁移的HUVEC。

2.12. 基质小管形成试验

通过胰蛋白酶化分离HUVEC，在胰蛋白酶中和后，对其进行计数并重新悬浮。HUVEC以2×10的速度播种⁵Matrigel（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）预涂96-well板中每孔的细胞数。6-8小时后对试管形成进行量化。内皮管的数字图像是使用相控显微镜获得的（德国莱卡Wetzlar）。管状结构由独立观察员进行盲测，给出每张图像的总管长。

2.13. 蛋白质印迹分析（细胞蛋白）

Western印迹检测各组HUVECs中PI3K/Akt/eNOS信号通路蛋白的表达。从细胞中提取总蛋白后，检测浓度和纯度，进行电泳，并将其转移到膜上。在室温下用脱脂奶粉封闭2 h，分别添加一级抗体（抗eNOS、抗p-eNOS（Ser1177）、抗Akt、抗p-Akt（Ser473）、抗血管内皮生长因子A（VEGFA）（中国海门贝尤泰姆））和内部参照物（抗GAPDH（美国马萨诸塞州丹佛市细胞信号技术）），并以1:1000稀释。第二天，我们添加二级抗体，在室温下孵育1小时，清洗膜，并进行化学发光。根据每个蛋白带的灰度比值，计算相对蛋白表达。原始西方墨迹可在补充资料.

2.14条。统计分析

数据以平均值±SE表示。进行双向方差分析以评估应变和条件因素。当通过方差分析获得统计显著性时，采用Tukey的事后检验进行多重比较。第页值<0.05被认为是显著的。

3.结果

实验开始时，即建立后肢缺血模型的当天（d0），实验结束时，即后肢缺血手术后的第21天（d21），分别对三组大鼠称重，并采集大鼠的外周血进行血糖测量，肝肾功能、血清钠、血钾、糖化血清蛋白等指标(表1和表2). 在d0，我们发现三组大鼠的体重、血糖、肝功能、肾功能、血钠和血钾指标没有统计学差异。在实验结束时，即后肢缺血手术后第21天（d21），达菲组和模型组的体重与对照组相比没有统计学差异。同时，达格氟嗪组与模型组之间存在统计学上的显著差异，表明达格氟醚对大鼠有减肥作用。dapagliflozin组与对照组、模型组和对照组当天d21的血糖和糖化血清蛋白无统计学差异，而Dapagluflozin组和模型组之间有统计学差异，表明达帕氟嗪对大鼠血糖有降低作用。第21天，三组大鼠的肝功能和肾功能无统计学差异；此外，达菲组与模型组之间无统计学差异，表明达菲对肝肾功能无损害。

3.1. 达帕格列嗪增加后肢缺血大鼠模型的后肢血液灌注和血管密度

达帕格列嗪能显著增加后肢缺血大鼠的局部血流量。图1A显示了手术前、手术后以及手术后第3、7、14和21天大鼠双侧后肢的典型激光多普勒血流成像图像。记录缺血左后肢与健康右后肢的血流灌注比值，进行统计学分析。统计结果显示，两组（模型组和达格列酮组）受影响后肢的血流灌注在术后均下降到相同水平。第3天，两组均开始出现血液灌流恢复，但两组之间无显著差异；术后第7天和第14天，达菲治疗组大鼠后肢血流量恢复水平优于模型组。术后第21天，达帕氟嗪组大鼠缺血后肢的血液灌注较模型组明显改善。与模型组（左股动脉切除，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（1mg/kg/d）灌胃连续21天）相比，模型组在术后第21天实现了30%的血液灌注恢复，达格列嗪组大鼠缺血后肢的血液灌注恢复了80%(图1A、 B）。

CD31-阳性血管的定量分析发现，与对照组（2.72±0.18）相比，模型组和达格列酮治疗组大鼠缺血后肢的血管密度在3周后增加，模型组（3.44±0.35）、达格列汀治疗组（4.70±0.44）、，并且达格氟嗪治疗组的血管密度也显著高于模型组，显示出最高的血管密度。达格列酮组与模型组、达格列汀组与对照组之间均有统计学差异。结果表明，达格雷福林可诱导新生血管的形成，达格雷福林治疗21天可促进大鼠后肢缺血后的血管生成(图2).

3.2. 磷蛋白组学检测结果：PI3K-Akt-eNOS信号通路与达帕格列净对缺血后血管生成的影响密切相关

磷酸化是一种重要的翻译后蛋白质修饰，据估计，哺乳动物细胞中三分之一以上的蛋白质可以磷酸化。磷酸化蛋白在细胞功能中发挥重要作用[19,20,21,22,23]包括信号转导、分化、增殖、周期调控、代谢、转录和翻译、降解和生存。磷酸蛋白质组分析识别、分类和表征磷酸化蛋白质。由于磷酸化蛋白参与了许多生物学过程，目前的研究旨在通过检测磷酸化蛋白来进一步阐明达格列嗪影响后肢缺血后血管生成的机制，以阐明达格列嗪对后肢缺血后血管生成的影响，并从细胞水平验证其作用机制。取模型组和达帕氟嗪组大鼠的三个缺血后肢收肌组织样本进行磷酸化蛋白组学检测。结果表明，使用差异折叠（折叠变化>±1.5倍）和第页价值(第页<0.05）作为筛选差异蛋白的标准，共筛选出约376个差异表达的磷酸化蛋白。从这些差异表达的磷酸化蛋白中，我们发现Akt发生了显著变化。与模型组相比，dapagliflozin给药组的Akt上调。结合以往的相关研究，表明磷酸化Akt与缺血后血管生成有关[24,25]. KEGG通路富集分析用于研究达帕氟嗪影响后肢缺血后血管生成的不同通路(图3). 氨甲喋呤影响缺血后血管生成的主要信号通路是AMPK通路。Akt在AMPK信号通路中起着非常重要的调节作用。我们可以看到上游有PI3K，下游有eNOS。在我们之前的研究中，我们证实PI3K-Akt-eNOS与血管生成密切相关。我们的蛋白质组学结果也证实了这一点，我们接下来将在细胞水平验证这一机制[26,27].

3.3. 达帕格列嗪在后肢缺血大鼠模型中的作用机制

为了进一步探讨达格列酮促进血管生成的可能机制，基于磷酸化蛋白质组检测结果，我们评估了三组（对照组、模型组和达格列汀组）缺血肌肉组织中促血管生成因子p-Akt、p-eNOS、total-Akt、total-eNOS和VEGF蛋白的表达股动脉结扎后第21天。结果表明，达格列酮能增加磷酸化蛋白Akt、eNOS和VEGF的表达。与对照组相比，磷酸化促血管生成因子在模型组和达格列酮组均增加，而达格列汀治疗组磷酸化促进血管生成因子的表达在三组中最高。达格列酮组与对照组、达格列汀组与模型组之间存在统计学差异(图4). 与另一组相比，达格利福林组的血管生成因子表达更好。

3.4. 达帕格列嗪干扰人脐静脉内皮细胞药物浓度的选择

为了探索干预HUVECs的合适浓度达格雷福林，我们首先在缺血和缺氧条件下给HUVEC注射不同浓度的达格雷福林，然后开始细胞实验。设定的浓度梯度为1μm、5μm、10μm和20μm。此外，由于用于干扰细胞的达格列嗪试剂溶解在二甲基亚砜中，我们设立了二甲基亚砜对照组和空白对照组。将细胞干预24小时，然后在缺血和缺氧条件下培养48小时。然后，对各组细胞进行CCK-8实验以评估细胞活力，transwell实验以评估细胞迁移能力，Matrigel实验以评估小管形成能力，和Western blot实验检测相应促血管生成因子的蛋白表达水平。从CCK-8的结果可以看出，DMSO组和对照组HUVEC的细胞增殖能力没有统计学差异。细胞增殖能力与达格列酮浓度呈线性关系。干预浓度为5μm时，细胞活力最佳。干预浓度为10μm时，细胞活力开始下降，但仍高于对照组。在干预浓度为20μm时，细胞存活率继续下降，但仍高于对照组(图5). 然后，我们使用跨阱实验评估在缺血和缺氧条件下，用不同浓度的达菲干预HUVEC后细胞迁移能力的变化。结果表明，对照组和DMSO组HUVEC的细胞迁移能力无统计学差异。细胞迁移能力与达格列酮浓度呈线性关系。干预浓度为5μm时，细胞迁移能力最强。在10μm的干预浓度下，细胞迁移能力开始下降，但仍高于对照组。在20μm的干预浓度下，细胞迁移能力显著下降(图6). 小管形成实验用于评估在缺血和缺氧条件下，不同浓度的达菲干预后HUVEC小管形成能力的变化。我们观察到，在缺血和缺氧损伤后，同时，对照组HUVEC的小管形成减弱。如所示图7细胞聚集成簇或断裂，管腔样结构明显小于在正常氧条件下完全培养基中培养的细胞。DMSO组和对照组的肾小管形成相似。1μm组稍好，但与对照组相比无显著统计学差异。5μm组显著增强了小管形成能力，增加了管腔样结构。10μm和20μm组的小管形成能力显著下降(图7). 为了进一步探讨在缺血和缺氧条件下，不同浓度的达帕氟嗪干预HUVEC后血管生成因子的表达，我们提取各组的细胞蛋白并进行Western blot检测。从实验结果可以看出，各组细胞eNOS和Akt总蛋白的表达水平没有显著差异；p-eNOS的表达水平在1μm组最高；p-Akt在1μm组和5μm组的表达水平均较高。VEGF在血管生成中起着至关重要的作用，因此我们还测量了VEGF的表达水平。结果表明，1μm组和5μm组VEGF的表达水平均高于对照组，且与对照组相比均具有统计学意义(图8). 综上所述，这些结果表明，用1μm和5μm达格列酮治疗24 h可显著提高细胞活力，且呈剂量依赖性，而10μm和20μm剂量组与对照组无显著差异。高浓度达菲对细胞无明显影响，因此我们随后使用5μM达菲进行进一步的细胞实验。

3.5. 达帕格列嗪促进HUVEC体外增殖

进行CCK-8分析以评估HUVEC对达格列酮给药的增殖能力。在本研究中，我们发现，在缺血和缺氧条件下，服用达帕氟嗪（5μm）比对照组更好地促进HUVEC增殖。此外，使用eNOS抑制剂L-name或PI3K抑制剂LY-294002可以显著减弱这种益处(图9).

3.6. 达帕格列嗪增强HUVEC体外迁移

采用跨阱迁移试验评估HUVEC对服用达格列酮的迁移能力。在本研究中，我们发现，在缺血和缺氧条件下，达帕氟嗪给药（5μm）组的HUVEC迁移率高于对照组。此外，使用eNOS抑制剂L-name或PI3K抑制剂LY-294002可以显著减弱这种益处(图10).

3.7. 达帕格列嗪体外增强HUVEC导管的形成

在小管形成测定中，达格列嗪给药（5μm）增加了I/H诱导的HUVECs小管形成。此外，使用eNOS抑制剂L-name或PI3K抑制剂LY-294002可以显著减弱这种益处(图11).

3.8. 达帕格列净体外增强促血管生成因子的表达，这种作用可以被PI3K抑制剂或eNOS抑制剂阻断，证明达帕格列净通过激活PI3K-Akt-eNOS信号通路上调VEGF表达，从而促进缺血后血管生成

为了阐明达加氟嗪对缺血/缺氧处理的HUVEC中eNOS、Akt和VEGF活性的促血管生成作用，我们评估了eNOS，Akt及VEGF在处理的HU VEC中的表达。如所示图12在缺血/缺氧处理的HUVEC中，达格利福林的施用上调了eNOS的磷酸化以及Akt和VEGF的磷酸化。服用L-name和LY-294002可以抵消这些益处(图12).

4.讨论

达帕格列嗪是一种钠-葡萄糖转运蛋白2抑制剂（SGLT2i），是一种新型的降血糖药物，可以抑制肾脏对葡萄糖和钠的吸收[5]. 1835年，彼得森从苹果根皮中提取了“Phlorizin”。从此，第一个非选择性SGLT1抑制剂诞生了。其主要药理作用是阻断SGLT在肾小管和小肠中对葡萄糖的再吸收。19世纪70年代，人们在不断的研究中发现，“根皮苷”非选择性地抑制小肠上皮细胞中的SGLT1，导致“根皮素”产生渗透性腹泻、消化不良等严重不良反应，发现“树皮素”的利用率、，肠腔中的水解酶分解“根皮苷”后产生的根皮苷含量极低，因此在临床治疗中没有广泛使用[28]. 经过150多年的科学技术不断创新，SGLT2抑制剂终于通过了III期临床试验并上市。与SGLT1抑制剂相比，SGLT2抑制剂具有更强的特异性和选择性，以及更高的葡萄糖转运能力。作用部位几乎都在肾脏。这些药物包括达格利福嗪、恩培利福嗪和卡格列净，以及SGLT1/2双通道抑制剂索沙格列净。最近的研究表明，达菲有许多与降血糖作用无关的作用。不同的SGLT2抑制剂对不同靶器官的作用不同。一些SGLT2抑制剂可以促进靶器官的血管生成，而一些SGLT1抑制剂可以抑制靶器官血管生成。我们的研究主要是研究口服达菲对后肢缺血后血管生成的影响及其作用机制。首先，我们在动物水平上观察了达菲对缺血后大鼠后肢缺血后新生血管形成的影响。可以看出，给药21天后，大鼠缺血后肢的血液灌流恢复了约80%，同时，给药组大鼠缺血后肢体的毛细血管密度显著增加，表明给药可促进缺血后血管生成。在动物实验中，由于我们采用了胃内给药，因此需要观察药物的肝肾副作用。发件人表1和表2，我们得出以下结论：第21天，三组大鼠的肝功能和肾功能没有统计学差异，并且达格利福嗪组与模型组之间也没有统计学意义上的差异，表明达格利福嗪没有损害肝肾功能。目前，对达格利福嗪的作用机制有很多研究，包括抗炎、抗纤维化、减少凋亡、表达血管生成因子等。Elkazzaz，S.K.等人的研究表明，与糖尿病肾病大鼠组相比，组织学检查、，达格氟嗪治疗组的炎症和凋亡标记物随着剂量的增加而改善，血管生成因子VEGF的表达也得到改善[24]. 此外，有研究表明，达格列酮在内皮功能障碍中具有调节作用。Zhang，W.等人的研究表明，载达菲的外体模拟物可以通过HIF-1α介导的血管生成增强促进糖尿病创面愈合[25]. 血管内皮损伤是外周动脉疾病发生的首要因素。我们的研究已经证实，达格利福嗪可以保护血管内皮细胞的功能，但达格利福嗪通过哪种信号通路促进后肢缺血后的血管生成？因此，我们对模型组和达格氟嗪组大鼠缺血左下肢内收肌组织进行了磷酸蛋白质组学检测。磷酸化是一种重要的翻译后蛋白质修饰，据估计，哺乳动物细胞中三分之一以上的蛋白质可以磷酸化。磷酸化蛋白在细胞功能中发挥重要作用[19,20,21,22,23]包括信号转导、分化、增殖、周期调控、代谢、转录和翻译、降解和生存。磷酸蛋白质组分析识别、分类和表征磷酸化蛋白质[29]. 由于磷酸化蛋白参与了许多生物过程，在我们的研究中，磷酰蛋白质组学被用于进一步阐明达帕氟嗪促进后肢缺血后血管生成的可能信号通路。

基于差异磷酸化蛋白的表达，我们选择了PI3K-Akt-eNOS信号通路，该通路参与多种细胞功能的调节，如增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运。然后，我们直接在内皮细胞水平上验证了这一机制。

PI3K AKT eNOS是人体内的一种重要信号通路，参与多种生理和病理过程，包括细胞粘附、生长、存活、分化和蛋白质合成[30]. PI3K、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、钙调蛋白（CaM）等生长因子可激活PI3K通路[31]. 该通路不仅参与肿瘤的发生发展，而且在正常组织细胞中发挥重要作用。PI3K通路在发育过程中对正常血管的形成起着至关重要的作用。PI3K的p110α催化亚基突变导致胚胎发育期间严重的血管缺陷，表明PI3K对内皮细胞迁移和血管生成至关重要。同样的研究表明，p110α亚单位也调节内皮细胞迁移、屏障功能和连接形态[32]. PI3K通路还通过调节内皮细胞中的NO信号参与血管生成。使用eNOS基因敲除小鼠进行的研究表明，eNOS在VEGF诱导的血管生成和血管通透性中起着关键作用，而早期的报告发现，VEGF可以诱导NO生成，而PI3K抑制剂可以减弱NO生成。一般情况下[31]，这种调节可能通过AKT在丝氨酸1177残基上的eNOS磷酸化发生[33]. VEGF诱导的内皮细胞迁移需要这种磷酸化[34]. VEGF是一种有效的血管生成因子。VEGF通过直接刺激体内内皮细胞的增殖和迁移，以增加循环为重点，改善缺血组织的血管收缩功能[35]. VEGF还刺激内皮细胞以PI3K依赖的方式迁移这些细胞并形成毛细血管样结构[36]. 低氧还可以通过HSP9O与eNOS的结合和PI3K通路的激活增强eNOS磷酸化[37].

我们之前的研究表明，与正常毒性的HUVEC相比，缺血-低氧HUVECs在体外早期表现出更强的迁移和血管生成能力，但长期缺血-缺氧降低了内皮细胞管长和HUVEC-迁移能力。本实验还评估了缺血和缺氧对HUVEC的影响，并观察到将HUVECs暴露于缺血和缺氧48小时会显著降低HUVEC-体外增殖、迁移和管形成能力。缺血缺氧对细胞造成巨大损伤(图9,图10和图11). 此外，缺血缺氧降低了HUVEC中p-Akt、p-eNOS和VEGF的水平(图12). 在缺血和缺氧条件下，给HUVEC注射达格氟嗪（5μm）后，细胞增殖、迁移和小管形成能力显著恢复。然后，我们证明，在缺血和缺氧条件下，达格利福嗪通过作用于内皮细胞的PI3K-Akt-eNOS-VEGF通路，促进内皮细胞增殖、管形成和迁移，从而促进缺血血管生成。我们评估了eNOS、Akt和VEGF在治疗的HUVEC中的表达。如所示图12在缺血/低氧处理的HUVEC中，给予达加氟嗪上调eNOS Ser1177磷酸化、Akt Ser473磷酸化和VEGF。使用L-name和LY-294002可以抵消这些好处。结果表明，达加氟嗪通过激活PI3K-Akt-eNOS信号通路和上调VEGF表达，促进缺血后血管生成。

综上所述，达帕氟嗪可促进大鼠后肢缺血后的血管生成。达帕格列嗪对血管内皮功能损伤起保护作用。达帕利福嗪可促进缺血后血管生成。这种效应可能通过促进PI3K-Akt-eNOS信号通路的激活来实现。本研究为外周动脉疾病的治疗提供了新的视角、新的思路和理论基础。这项研究也有许多局限性，例如，达帕氟嗪促进缺血后血管生成还有其他途径和机制。我们还没有探索这一部分，其他与血管生成相关的机制（如抗炎和抗纤维化作用）也可能有助于达菲促进缺血后血管生成，这需要进一步研究。

补充资料

以下支持信息可从以下网址下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/biom14050592/s1.

作者贡献

概念化，J.D.和F.L。；方法论，L.H.（李翰）；软件，G.Y。；验证、W.S.、Y.Z.和W.W。；形式分析，L.H.（郝良实）；调查，J.G。；资源，Z.L。；数据管理，L.H.（李翰）；编写原稿，L.H.（李翰）和L.H；写作审查和编辑，G.Y。；可视化，W.S。；监督，Z.L。；项目管理，F.L。；资金收购，J.D.所有作者都阅读并同意手稿的出版版本。

基金

本研究由中国自然科学基金（12074253）和上海市卫生委员会临床研究专项（20234Y0050）资助。APC由上海交通大学医学院附属新华医院资助。

机构审查委员会声明

动物研究方案由上海交通大学医学院附属新华医院伦理委员会批准（XHEC-D-2024-0582024年3月28日）。

数据可用性声明

根据合理要求，可从相应作者处获得当前研究中的数据集。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

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图1。达帕氟嗪对后肢缺血后血流恢复的影响。(A类)后肢激光多普勒灌注测试的代表性图像。(B类)显示肢体灌注率的折线图（激光多普勒图像指数）。数据表示为平均值±标准误差(n个= 3). **第页< 0.01, ***第页与模型组相比<0.001。

图2。达格列酮治疗对后肢缺血后后肢毛细血管密度的影响。(A类)缺血干预后第21天后肢肌肉CD31免疫组织化学染色示意图。(B类)CD31-阳性血管定量分析统计图。数据表示为平均值±标准误差(n个= 10). *第页< 0.05, ***第页< 0.001. 比例尺指示100μm。

图2。达格列酮治疗对后肢缺血后后肢毛细血管密度的影响。(A类)缺血干预后第21天后肢肌肉CD31免疫组织化学染色示意图。(B类)CD31-阳性血管定量分析统计图。数据表示为平均值±标准误差(n个= 10). *第页< 0.05, ***第页< 0.001. 比例尺表示100μm。

图3。KEGG通路数据库确定的基因富集结果。

图4。达加氟嗪对缺血后肢中促血管生成因子p-eNOS、p-Akt、eNOS，Akt和VEGF蛋白表达的影响。在后肢缺血手术后第21天，用Western blot检测缺血肌肉组织中p-eNOS、p-Akt、eNOS，Akt和VEGF的含量，以评价促血管生成作用。数据表示为平均值±标准误差*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001****第页< 0.0001.

图4。达加氟嗪对缺血后肢中促血管生成因子p-eNOS、p-Akt、eNOS，Akt和VEGF蛋白表达的影响。在后肢缺血手术后第21天，用Western blot检测缺血肌肉组织中p-eNOS、p-Akt、eNOS，Akt和VEGF的含量，以评价促血管生成作用。数据表示为平均值±标准误差*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001, ****第页< 0.0001.

图5。不同浓度达格列酮干扰HUVEC对细胞增殖的影响。数据表示为平均值±标准误差(n个= 5). ***第页< 0.001, ****第页与对照组相比<0.0001；NS表示与对照组相比“非统计”。

图5。不同浓度达格利福辛干扰HUVEC对细胞增殖的影响。数据表示为平均值±标准误差(n个= 5). ***第页< 0.001, ****第页与对照组相比<0.0001；NS表示与对照组相比“非统计”。

图6。不同浓度达格利福嗪干扰HUVEC对细胞迁移能力的影响。(A类)Transwell图。(B类)Transwell分析图。数据表示为平均值±SE(n个=3）*第页< 0.05, **第页< 0.01, ****第页与对照组相比<0.0001；NS表示与对照组相比“无统计学意义”。比例尺指示100μm。

图6。不同浓度达格利福嗪干扰HUVEC对细胞迁移能力的影响。(A类)Transwell图。(B类)Transwell分析图。数据表示为平均值±SE(n个= 3). *第页<0.05时**第页< 0.01, ****第页与对照组相比<0.0001；NS表示与对照组相比“无统计学意义”。比例尺指示100μm。

图7。不同浓度达格列酮干扰HUVEC对其小管形成能力的影响。(A类)管道生成示意图。(B类)管子生成分析图。数据表示为平均值±SE*第页< 0.05, **第页与对照组相比<0.01；NS表示与对照组相比“无统计学意义”。比例尺指示200μm。

图7。不同浓度达格列酮干扰HUVEC对其小管形成能力的影响。(A类)管子生成示意图。(B类)管子生成分析图。数据表示为平均值±SE*第页< 0.05, **第页与对照组相比<0.01；NS表示与对照组相比“无统计学意义”。比例尺指示200μm。

图8。不同浓度达帕氟嗪干预后HUVEC中血管生成因子的表达。蛋白质印迹示意图和条带定量分析图*第页<0.05时**第页< 0.01, ***第页与对照组相比<0.001；NS表示与对照组相比“无统计学意义”。

图8。不同浓度达帕氟嗪干预后HUVEC中血管生成因子的表达。蛋白质印迹示意图和条带定量分析图*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页与对照组相比<0.001；NS表示与对照组相比“无统计学意义”。

图9。达帕氟嗪对HUVEC增殖的影响。与正常血液和供氧组相比，缺血缺氧组的细胞增殖能力显著降低。达格氟嗪干预后缺血缺氧细胞增殖能力恢复良好。达帕格列嗪干预促进HUVEC增殖。L-name或LY294002可以阻止这种效果。数据表示为平均值±SE****第页<0.0001 vs.I/H组；NS表示与I/H组相比“无统计学意义”。

图10。达格列酮干预对HUVEC迁移的影响。迁移细胞染色(A类)并对迁移的细胞进行了定量分析(B类). 数值为平均值±SE**第页< 0.01, ***第页与I/H组相比<0.001；NS表示与I/H组相比“无统计学意义”。比例尺表示100μm。

图10。达格列嗪干预对HUVEC迁移的影响。迁移细胞染色(A类)并对迁移的细胞进行了定量分析(B类). 数值为平均值±SE**第页< 0.01, ***第页与I/H组相比<0.001；NS表示与I/H组相比“无统计学意义”。比例尺指示100μm。

图11。通过Matrigel分析评估试管形成能力。(A类)HUVECs中导管形成的代表性图像。(B类)管总长度的定量分析。数值为平均值±SE*第页< 0.05, **第页与I/H组相比<0.01；NS表示与I/H组相比“无统计学意义”。比例尺指示200μm。

图11。通过Matrigel分析评估试管形成能力。(A类)HUVEC中管子形成的代表性图像。(B类)管总长度的定量分析。数值为平均值±SE*第页< 0.05, **第页与I/H组相比<0.01；NS表示与I/H组相比“无统计学意义”。比例尺指示200μm。

图12。达格列酮干预对促血管生成因子表达的影响。Dapagliflozin干预导致I/H HUVEC中p-eNOS、p-AKT和VEGF的上调。L-name或LY294002可以阻断这种作用。数据表示为平均值±标准误差*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001, ****第页<0.0001 vs.I/H组；NS与I/H组相比表示“非统计”。

图12。达格列酮干预对促血管生成因子表达的影响。达格列嗪干预导致I/H中HUVECs中p-eNOS、p-AKT和VEGF的上调。L-name或LY294002可以阻断这种作用。数据表示为平均值±标准误差*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001, ****第页<0.0001 vs.I/H组；NS与I/H组相比表示“非统计”。

表1。对照组、模型组和达菲组大鼠的基线特征（d0）。

特征（平均值±SE）	控制组(n个=10）	模型组(n个= 10)	Dapagliflozin-组(n个= 10)	P（模型与控制组）	P（Dapa vs.控制组）	P（Dapa与模型组）
重量（g）	265.80 ± 4.51	264.80 ± 5.02	264.60 ± 4.43	0.88	0.85	0.98
葡萄糖（毫摩尔/升）	13.33 ± 0.24	13.29 ± 0.25	13.11 ± 0.20	0.92	0.49	0.57
GPT（单位/升）	56.87 ± 3.69	58.86 ± 5.05	56.42 ± 2.81	0.75	0.92	0.68
GOT（单价）	150.40 ± 25.90	142.50 ± 24.22	131.70 ± 8.43	0.83	0.50	0.68
血清肌酐（umol/L）	33.80 ± 1.40	33.92 ± 1.35	31.18 ± 0.84	0.95	0.13	0.10
血尿素氮（mg/dL）	15.50 ± 0.98	14.85 ± 1.07	15.54 ± 1.12	0.66	0.98	0.66
血清钠（mmol/L）	151.00 ± 3.96	151.30±3.12	153.60 ± 1.27	0.95	0.54	0.50
血清钾（mmol/L）	5.89 ± 0.22	5.75 ± 0.15	5.91 ± 0.15	0.60	0.95	0.46

注：数据以平均值±SE表示。缩写：GPT，谷丙转氨酶；谷氨酸-草酰乙酸转氨酶；达帕（Dapa）、达帕氟嗪（dapagliflozin）。

表2。对照组、模型组和达加氟嗪组大鼠（d21）的基本指标。

特征（平均值±SE）	控制组(n个= 10)	模型组(n个= 10)	Dapagliflozin-组(n个= 10)	P（模型与控制组）	P（Dapa vs.控制组）	P（Dapa与模型组）
重量（g）	415.60 ± 13.32	402.50 ± 7.52	362.60 ± 10.10	0.40	0.01	0.01
葡萄糖（mmol/L）	12.27±0.51	12.26 ± 0.58	10.52 ± 0.48	0.99	0.02	0.03
GPT（单位/升）	56.22 ± 3.92	51.67 ± 4.57	49.93 ± 3.65	0.46	0.26	0.77
GOT（单价）	133.20 ± 27.09	132.00 ± 25.41	119.30 ± 9.73	0.98	0.64	0.65
血清肌酐（umol/L）	35.99 ± 1.00	35.23 ± 1.32	32.68 ± 1.10	0.65	0.04	0.16
血尿素氮（mg/dL）	15.79 ± 1.02	14.56 ± 1.12	13.98 ± 1.05	0.43	0.23	0.71
GSP（毫摩尔/升）	1.47 ± 0.09	1.52 ± 0.10	1.15 ± 0.08	0.71	0.01	0.01

注：数据以平均值±SE表示。缩写：GPT，谷丙转氨酶；谷氨酸-草酰乙酸转氨酶；糖化血清蛋白；达帕（Dapa）、达帕氟嗪（dapagliflozin）。

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Han，L。；Ye，G。；苏·W。；Zhu，Y。；吴，W。；Hao，L。；高杰。；李，Z。；刘，F。；段，J。达帕格列嗪通过PI3K-Akt-eNOS途径改善后肢缺血后的血管生成。生物分子 2024,14, 592.https://doi.org/10.3390/biom14050592

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韩磊、叶庚、苏伟、朱毅、吴伟、郝立、高杰、李Z、刘发、段杰。达帕格列嗪通过PI3K-Akt-eNOS途径改善后肢缺血后的血管生成。生物分子2024年；14（5）:592。https://doi.org/10.3390/biom14050592

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韩、李、叶国欣、苏文静、朱元康、吴文琪、郝良实、高静、李震、刘芳和段俊丽。2024.“达帕格列嗪通过PI3K-Akt-eNOS途径改善后肢缺血后的血管生成”生物分子14，5号：592。https://doi.org/10.3390/biom14050592

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