通过糖基化终产物的作用增强中性粒细胞呼吸爆发:血管氧化应激的潜在促因

比斯-N个-甲基硝酸cridinium（Lucigenin）、二苯基碘鎓（DPI）、甲酰基甲基亮氨酸苯丙氨酸（fMLP）、葡萄糖、血小板活化因子（PAF）、percoll、组织培养基199（TC199）和肿瘤坏死因子-α（TNFα人重组体）均购自Sigma-Aldrich，20%无内毒素人血清白蛋白（HSA）从生物制品实验室获得。

通过将无内毒素HSA（20%）分别与1或30 mmol/l葡萄糖在37°下预培养12周，在100 mmol/l磷酸盐（pH 7.4）中制备AGE-白蛋白和最小修饰白蛋白（MM-白蛋白）。孵育结束时，用PBS透析AGE-白蛋白/MM-白蛋白24小时，用0.9%氯化钠透析12小时。用非糖化HSA作为阴性对照。

根据Baron等人的方法制备中性粒细胞(13). 在获得知情同意后，从健康成人志愿者处获取20 ml新鲜柠檬酸血，并将其添加到右旋糖酐溶液中（300 mg加入含有140 mmol/l NaCl、4 mmol/l-NaHCO的5 ml Hank’s平衡盐溶液[HBSS]中_三，0.3 mmol/l钠₂高性能操作₄[无水]，5 mmol/l KCl，0.4 mmol/lKH₂人事军官₄[无水]，5.5 mmol/l葡萄糖，0.4 mmol/l MgSO₄和4.7 mmol/l H₂O） ，并让其沉淀30分钟。取下血浆（含血小板和白细胞），在482下离心10分钟克用稀释的HBSS使细胞颗粒旋转10 s，以溶解污染的红细胞，然后通过添加过量的HBSS恢复渗透压。然后在482下进一步离心获得混合白细胞颗粒克放置10分钟，然后分层到准备好的Percoll连续密度梯度上（65%Percoll，10%10×TC199，1.6%1 mol/l HEPES，0.4%5 mol/l NaCl，23%无菌水，pH 7.4，在21982下离心克在4°下保持15分钟）。恢复中性粒细胞带，在TC199中清洗，并在使用前在37°下培养20分钟。通过台盼蓝染料排斥试验测定，用这种方法分离的中性粒细胞的存活率为95%。

ROS检测基于Liu等人描述的化学发光技术(14)，在EG&G Berthold微板光度计LB96V上记录化学发光。所有实验均在37°下进行。在含有140 mmol/l NaCl、15 mmol/lHEPES、5 mmol/lKCl、5 mmol/l葡萄糖、1.8 mmol/l CaCl的平衡盐溶液中制备Lucigenin（50μmol/l₂.2小时₂0和0.8 mmol/l MgSO₄0.7小时₂O（pH 7.4）。所有实验均一式三份，共10份⁵每个孔的细胞数。

中性粒细胞的机械刺激是通过标准的1毫升移液管尖端的多次传代进行的。每个实验的传代次数和强度都是相等的，尽管发现在多个传代中，无论实际传代次数或强度如何，都会诱导中性粒细胞产生相同幅度的ROS（数据未显示）。以前曾观察到剪切应力对中性粒细胞活化参数的这种平台效应(15)当中性粒细胞受到一定范围的剪切应力时。本研究中使用的化学刺激物是fMLP（100 nmol/l），这是一种细菌细胞球肽，通过特定的G蛋白偶联细胞表面受体激活中性粒细胞(16).

将含有500μg AGE-白蛋白/白蛋白的100μl PBS填充到Microlite-2微孔（Dynex）中，盖上盖子，放置在摇床上过夜。然后用PBS清洗三次，并在使用前晾干。

化学发光值表示为每分钟的相对光单位（RLU）和平均值±SE。为了分析总ROS生成（RLU。我们用的是双尾t吨两组比较测试和单向方差分析与Tukey的事后分析，用于两组以上的组间分析（SPSS）。

通过在5×10⁵中性粒细胞被允许沉积在微孔板上。测量了15分钟后的综合活性氧生成量，并将其与基线活性氧生成（也超过15分钟）进行了比较，如用Lucigenin增强化学发光法测量的那样。尽管AGE-白蛋白和白蛋白的添加导致中性粒细胞ROS生成量在基础水平上略有增加，但两者之间没有显著差异（在给定剂量范围内比较两组，P（P）= 0.774).

然而，在AGE-白蛋白存在的情况下，中性粒细胞受到二次刺激（机械或化学）时，会产生呼吸爆发，与对照白蛋白存在时的激活相比，呼吸爆发明显增强，增强的程度取决于AGE浓度。机械刺激和fMLP刺激均导致两阶段中性粒细胞ROS爆发、一次峰值和二次谷相，AGE-白蛋白能够增强这两方面。本研究中使用的白蛋白和AGE修饰的白蛋白样品的荧光光谱强度为这些实体的AGE修饰相对程度提供了一些定量概念(图1). MM-白蛋白能够增加中性粒细胞ROS的释放，但与AGE-白蛋白相比，增加的幅度大大降低(图2A和B). 当浓度为400μg/ml（MM-白蛋白作用的最佳剂量）时，AGE-白蛋白和MM-白蛋白对机械刺激的反应使峰值ROS生成平均增加362%(P（P）<0.001）和157%(P（P）=0.011），ROS总产量平均为282%(P（P）<0.001）和169%(P（P）=0.009）(P（P）在两种情况下，各组之间均<0.001）(图2C和D). 在fMLP刺激下，AGE-白蛋白和MM-白蛋白使ROS峰值平均增加177%(P（P）<0.001）和119%(P（P）=0.021），但只有AGE-白蛋白提高了总ROS的生成（平均145%，P（P）< 0.001).

即使在每类AGE修饰中也存在剂量-反应关系。对于AGE白蛋白，在AGE白蛋白浓度≥200μg/ml时，机械刺激和fMLP刺激均达到最佳反应(图3A和B)（对于两种形式的刺激，P（P）组间<0.001）。在逐渐增加的AGE-白蛋白剂量下，这种相对差异保持不变，尽管样品的绝对化学发光强度降低，可能是由于较高的蛋白质浓度阻碍了光传输(17). MM-白蛋白的剂量反应要小得多，尽管对两种形式的刺激仍然显著(图3C和D)（对于两者，P（P）组间<0.001）。白蛋白浓度低于400μg/ml时几乎没有反应，但在较高浓度（800μg/ml及以上）时，由于高蛋白负载导致化学发光猝灭增加，也不可能检测到ROS产生的任何微小差异(图3C和D). 中性粒细胞与AGE-白蛋白的显著预孵育似乎不需要引起这种反应；刺激前立即将细胞悬浮在AGE-白蛋白中与与AGE-蛋白预孵育更长时间一样有效（数据未显示）。

我们还研究了在时间上逆转AGE白蛋白添加和机械刺激这两个过程的效果。当中性粒细胞首先受到机械刺激时，在随后添加AGE-白蛋白或对照之前，接触AGE-蛋白的细胞中ROS生成（总量或峰值）没有差异性增强(图4A) (P（P）=0.603，比较ROS总产量）。同样，机械刺激中性粒细胞，然后将其释放到AGE-白蛋白或白蛋白涂层微孔板上，也不会导致中性粒细胞ROS产生的任何重大差异（总量或峰值）(图4B) (P（P）=0.319，比较ROS总产量）。因此，在机械刺激之前或同时，在直接中性粒细胞环境中出现AGEs似乎是一个先决条件，以便中性粒细胞ROS爆发增强。

众所周知，细胞酶NADPH氧化酶负责吞噬细胞产生ROS(12)可以推断，中性粒细胞ROS输出量的增加可归因于NADPH氧化酶活性的增加。作为证实，中性粒细胞预先与黄素蛋白抑制剂DPI孵育(18)在添加AGE-白蛋白/白蛋白（200μg/ml）和应用机械或化学刺激之前，以不同浓度持续30分钟，所有这些都是在DPI持续存在的情况下进行的。结果是，尽管实验组和对照组之间的ROS生成相对差异保持不变，但ROS的释放仍呈剂量依赖性(图5A和B)（对于两者，P（P）组间<0.001）。相反，在这种情况下，特异性线粒体黄素蛋白抑制剂鱼藤酮（100 nmol/l，10μmol/l）对中性粒细胞ROS输出几乎没有影响（数据未显示）。因此，AGEs对中性粒细胞的作用似乎需要一个功能正常的NADPH氧化酶，最可能的作用机制涉及NADPH酶活性的上调。

我们检查了AGE对中性粒细胞作用的可逆性，这是AGE必须与另一刺激物同时存在以产生增强的中性粒细胞ROS的概念的延伸。中性粒细胞在洗涤前在AGE-白蛋白或对照白蛋白（均为200μg/ml）中培养30分钟，然后立即用机械或化学（fMLP）刺激激活。在这两种刺激下，先前由AGE-白蛋白诱导的ROS生成的差异性增强被消除(P（P）=0.71和P（P）分别=0.12，对于总ROS产量；数据未显示）。因此，很明显，AGE对中性粒细胞的影响是一种可逆现象，对细胞记忆和反应没有任何先前的相互作用。

各种其他药剂也被证明具有增加中性粒细胞ROS产生的能力。其中一组药剂，统称为“中性粒细胞启动剂”(19)并且包括两种研究充分的药物，TNF-α和PAF，与AGE-白蛋白不同的是，为了达到效果，需要与细胞进行显著的预培养时间。在研究AGEs和启动剂之间共享细胞上调机制的可能性时，我们研究了联合接触这些药物的影响。将中性粒细胞与TNF-α、PAF或对照载体预孵育至所需的启动时间（30 min），随后添加AGE-白蛋白或白蛋白（均为200μg/ml），并通过机械或fMLP进一步刺激细胞(图6A–D). TNF-α和PAF对中性粒细胞呼吸爆发的增强作用似乎比单独的AGE-白蛋白更强，当AGE-蛋白与它们结合时，这些作用似乎是互补的。对于机械刺激，当添加TNF-α时，AGE-白蛋白组和白蛋白组的总ROS生成和峰值ROS生成的绝对值增加了约10倍（数据未显示），通常将AGE-蛋白和白蛋白组之间ROS生成增加的差异保持在150-200%，无论是通过峰值还是总ROS产量进行评估(图6A). 在TNF-α启动和fMLP刺激的联合作用下，ROS峰值增加了约6倍，ROS总产量增加了11倍（数据未显示），ROS产量（峰值或总产量）的差异增加保持在150-160%之间(图6B).

与TNF-α相比，PAF引发导致ROS生成的增加较少。与机械刺激相结合，活性氧峰值大约增加了两倍，活性氧总生成量增加了1.5倍（数据未显示），与白蛋白组相比，AGE-白蛋白的活性氧峰值或总生成量保持了200-230%的差异增加(图6C). 在fMLP刺激下，峰值ROS产生仅增加1.5倍，但总ROS产生没有实际变化，主要是由PAF组次级槽期ROS产生较低引起的，否定了这些组较高峰值ROS值的影响（数据未显示）。尽管如此，与白蛋白组相比，AGE-白蛋白的峰值和总ROS生成量仍有不同程度的增加，达到130–180%的水平(图6D).

早期大血管疾病是糖尿病常见的伴发病理学(20)和肾衰竭(21)随着AGEs在这些条件下积累速度的增加，被认为是该病理学的潜在因素(22). 氧化应激可能在血管病变中起作用(23)通过中和天然血管扩张剂一氧化氮（NO）(8)以及通过低密度脂蛋白氧化增加斑块形成，使其更容易被清道夫巨噬细胞吸收(24). 本研究检测了AGEs可能对这种血管氧化负荷起重要作用的可能性。对于活性氧检测，我们使用了一种化学发光分析法，其中自由基物种与化学探针（亮精蛋白）反应产生光。该技术在本研究所涉及的生物基质中的应用已经过验证(15,25). 此外，这种分析与这种情况有关，因为它具有很高的灵敏度和实时观察活性氧生成的能力。

以前曾报道过AGEs结扎RAGE后氧化应激增加的状态(5–7,26). 大多数证据都是间接推断，通过观察通常由氧化应激调节的细胞内途径的激活，或通过抗氧化剂消除AGE/RAGE反应(6,7). 还有一份报告称，允许AGEs与内皮细胞上的RAGE受体相互作用时，直接检测到过氧化氢释放。尽管在这种情况下，过氧化物释放是一种直接反应，但在60分钟的时间内，它是一种缓慢的综合累积(26).

在目前的研究中，已概述了AGE诱导氧化应激的进一步证据。中性粒细胞作为抗菌防御中的生理活性氧产生者，被选为研究对象，因为它们也可能对血管内氧化应激起重要作用。它们在缺血事件后再灌注损伤中的作用已经得到承认(12). 证据还表明，即使控制了其他因素，血白细胞计数，尤其是粒细胞成分越高，预测未来发生血管事件的可能性越大。同样，在缺血性事件发生之前也经常发现感染(27,28). 在比较健康人和稳定型和不稳定型冠心病患者的中性粒细胞时，存在渐进性中性粒细胞激活的分级，这可能为稳定型到不稳定型冠状动脉疾病的进展提供了病理生理环境。活化的中性粒细胞释放有毒化学物质，包括活性氧和蛋白水解酶，这些化学物质会破坏内皮和基底膜。活性氧的释放也会导致脂质氧化，并引发血小板活化/聚集；因此，中性粒细胞可能参与闭塞性血管病的主要发病机制和进展(27,28).

在这项研究中，没有证据表明中性粒细胞暴露于AGE白蛋白后会直接、快速诱导氧化应激。然而，AGEs的存在允许以快速动力学发生的二次刺激（无论是机械刺激还是化学刺激）所赋予的ROS爆发的剂量依赖性增强。结合这种从中性粒细胞环境中清除AGEs的迅速可逆性，我们得出结论，AGEs可能作为中性粒细胞“协同作用者”发挥着尚未描述的作用。作为协同作用者，AGEs不同于启动剂，这也增强了细胞功能，但需要与细胞进行大量的相互作用才能产生反应(19). AGEs的协同作用与体内相关，因为白细胞通过血管系统产生足够的切应力，可能起到二级机械激动剂的作用(29). 另一方面，体内化学激动剂可能由病原体暴露提供（fMLP是一种细菌衍生物[16])一些急性血管事件已经与感染事件相关(30).

通过将AGEs与先前特征化的启动剂PAF和TNF-α结合而获得的对ROS生成的互补作用说明了潜在的体内协同作用，也进一步区分了AGEs协同作用与中性粒细胞启动剂的协同作用。互补性意味着有不同的细胞内途径控制中性粒细胞反应的上调(31)其共同终点是中性粒细胞NADPH氧化酶的激活。DPI对ROS输出的剂量依赖性抑制表明，NADPH氧化酶对中性粒细胞的基本ROS生成和AGE增强的ROS生成都至关重要。这种黄素蛋白抑制剂被有效地视为NADPH氧化酶抑制剂，特别是在中性粒细胞中，NADPH酶是主要的黄素蛋白(18); 此外，特异性线粒体黄素蛋白抑制剂鱼藤酮对抑制ROS输出的作用相对不足。

存在许多介导AGEs对中性粒细胞呼吸爆发影响的候选途径。关键触发因素可能涉及AGEs与中性粒细胞跨膜受体的相互作用，现已确定了几个候选受体(2). 事实上，最近在中性粒细胞中证实了RAGE的存在(32). 无论随后的信号转导途径如何，其最终结果都提供了一种机制，能够增强由异质刺激组触发的NADPH氧化酶活性。

本研究中的AGE剂量与先前受体结合研究中验证的剂量相似(33). 将这些与糖尿病患者的实际病理水平联系起来，我们未发表的数据显示，本研究中AGE-白蛋白的剂量比AGE荧光评估的患有大血管并发症的糖尿病患者的血清浓度高约10倍。后者已经是健康对照组血清的三倍。体外和体内强度之间的差异不一定使我们的实验剂量无关。体外药理作用的剂量通常大于体内所需的剂量，且差异仅为一个数量级。此外，体内AGE浓度在全身并不均匀。AGEs通常与动脉粥样硬化病变的位置密切相关(2,34)尽管这是原因还是结果还没有明确回答；实际上，这两种元素都可能存在。然而，在动脉粥样硬化斑块附近，与循环浓度相比，AGEs可能具有更大的局部浓度，导致局部中性粒细胞ROS生成增强。这也可能促进局部加速AGE的形成，从而进一步维持这个循环(35).

AGE在体内的这种不均匀分布可能解释了AGE介导的中性粒细胞ROS生成增加与糖尿病患者，尤其是代谢控制不良的患者，感染并发症发生率更高这一观察结果之间的明显矛盾(36). AGE效应的可逆性可能导致中性粒细胞仅在AGE大量积累的部位短暂处于激活状态，并在迁移到循环的其他部分或非血管室时恢复到更接近正常的状态。此外，高血糖本身具有细胞毒性，阻碍了有效的中性粒细胞功能(37). 因此，急性高血糖状态下的中性粒细胞功能与代谢控制更接近生理参数，但过去的代谢不谨慎导致AGE加速积累的时期不同。

因此，本研究的证据进一步揭示了AGEs在糖尿病和尿毒症等疾病中可能的致病作用。通过AGEs作为独特的中性粒细胞协同因子的作用，已经证明AGEs可以通过增加中性粒细胞ROS的生成，在诱导氧化应激增加状态中发挥关键作用，这可能是导致这些情况下血管疾病加速的部分原因。

这项研究得到了英国心脏基金会和莱斯特大学医院的研究拨款的支持。