OSBPL2系统编码一种内外毛细胞静纤毛蛋白，在常染色体显性聋中发生突变(DFNA67公司)

摘要

背景

早期听力损失大多是遗传性的。听力过程的复杂性反映在其广泛的遗传异质性上，可能还有许多致病基因尚待确定。在这里，我们旨在确定一个德国大家族中常染色体显性非综合征性耳聋（ADNSHL）的遗传基础。

方法

通过下一代测序（NGS）对一组66个已知耳聋基因进行突变分析。然后我们进行全基因组连锁分析，并对两名患者的样本进行全基因组测序。通过免疫组织化学方法测定Osbpl2在小鼠耳蜗中的表达。因为Osbpl2型已被提议作为miR-96型，我们调查了纯合子米尔96突变小鼠对其进行上调。

结果

被调查的ADNSHL家族的听力损失发生于儿童时期，最初影响高频，成年后发展为重度耳聋。然而，有相当大的家族内变异性。我们绘制了一个新的ADNSHL基因座，DFNA67公司，并随后鉴定出一个共分离杂合移码突变，c.141_142delTG（p.Arg50Alafs*103）OSBPL2系统，编码一种已知与DFNA1公司蛋白质，隔膜1。在小鼠耳蜗内外毛细胞的静纤毛中，Osbpl2显著表达。我们没有发现显著的Osbpl2型纯合子mRNA水平的上调米尔96突变小鼠。

结论

的功能OSBPL2系统听证过程中还有待确定。我们对中国ADNSHL家系鉴定中另一移码突变的研究和最新描述OSBPL2系统作为进展性耳聋的新基因。

背景

听力障碍是最常见的感觉障碍，影响大约1/500的新生儿。在发达国家，大多数病例是遗传起源的，存在广泛的等位基因和非等位基因异质性。在70%的听力受损新生儿中，感觉障碍是非综合征性的（非综合征听力损失，NSHL）。大约20%的患者患有常染色体显性遗传型（ADNSHL），通常表现为语言后进行性听力损伤。65个ADNSHL基因座已被正式指定，30个致病基因已被报道[1-三]. 由于听力损伤的广泛遗传异质性，直到最近，在单个患者中确定致病突变一直是例外。随着下一代测序（NGS）的出现，耳聋基因已经可以通过“基因面板”的靶向NGS进行全面的基因分析和常规基因检测[4].

方法

患者

本文报告的德国家庭样本（图1)获得书面知情同意书。临床研究是根据赫尔辛基宣言进行的，该研究得到科隆大学医院伦理委员会机构审查委员会的批准。受影响的受试者接受了详细的听力学评估（例如，纯音测听空气传导、骨传导、语音接收阈值、耳声发射、阻抗测听、音素辨别），但报告间歇性听力损伤（与压力有关）的IV:12受试者除外。遵循欧盟HEAR项目的建议[5]听力损失分为轻度（20–40 dB）、中度（41–70 dB）、重度（71–95 dB）或重度（>95 dB）。然而，在某些情况下，这种分类是困难的，因为至少有两名患者（V:2，V:3）在250–1000 Hz区域的听力接近正常，但在较高频率下听力损失约70–90 dB。

图1

家谱和基因型 DFNA67公司 家庭。M、，操作系统业务流程2突变；WT，野生型。蓝星，其样本接受全基因组SNP基因分型以进行连锁分析的个体。绿色恒星，其样本受WES影响的个体。

GJB2型一组耳聋基因的分析及靶向NGS

这个GJB2型直接对指标患者IV:10进行基因测序。然后对他的样本进行NGS检测，检测66个基因（1259个编码外显子），这些基因与NSHL和MiSeq系统（Illumina）上选定形式的SHL相关，如前所述[6]. 简而言之，剪切后的DNA被连接到条形码适配器上进行多路复用。外显子由溶液中定制的序列捕获库（NimbleGen）靶向。扩增的富集DNA直接受到NGS（MiSeq）的作用。使用BWA根据hg19人类参考基因组绘制读数[7]并使用SAMtools进行处理[8]、皮卡德(http://broadinstitute.github.io/picard网站/)和GATK[9]. 根据dbNSFP v2.0过滤变量[10]，dbSNP v137，人类基因突变数据库（HGMD®Professional 2013.2）[11]和我们的内部数据库。最大次要等位基因频率（MAF）的截止值设置为1%[12]. 无意义、移码和典型剪接位点变异被认为可能致病。使用SIFT评估SNV[13]、突变品尝器[14]，PolyPhen-2[15]，对齐GVGD[16,17]，铂[18]，NNSPLICE v0.9[19]和NetGene2[20,21]. SeqPilot SeqNext模块（v4.0.1，JSI医疗系统）用于SNV的可视化和最终评估。

连锁分析和轨迹设计

来自7名受影响和6名未受影响家庭成员的DNA样本（图1)使用Affymetrix基因芯片人类定位10 K SNP阵列Xba142进行基因分型。通过计算X染色体上的杂合单核苷酸多态性（SNP）来验证性别。借助关系的图形表示程序评估关系错误[22]. 假设常染色体显性遗传、完全外显率和疾病基因频率为0.0001，进行连锁分析。使用ALLEGRO程序计算多点LOD得分[23]. 单倍型用ALLEGRO重建，并用HaploPainter图形显示[24]. 使用图形用户界面ALOHOMORA执行所有数据处理[25].

在确定了OSBPL2系统,DFNA67公司被人类基因命名委员会HGNC指定为ADNSHL的新基因座命名。

全外显子组测序

对两名受累家庭成员的样本（IV:10和V:3）进行全基因组测序（WES）。使用超声波技术（Covaris）对DNA（1μg）进行片段化。使用SeqCap EZ Human Exome Library v2.0试剂盒（Roche NimbleGen）对片段进行富集，随后在Illumina HiSeq 2000测序仪上使用配对2×100-bp协议进行测序。这产生了6.1和8.2Gb的映射序列，其平均覆盖率为80倍和101倍，30倍覆盖率为89%和89%的目标序列，10倍覆盖率为96%和95%的目标序列。为了进行数据分析，使用了Varbank管道（v.2.3）和过滤器接口(https://varbank.ccg.uni-koeln.de). 通过Illumina实时分析（RTA）软件（v1.8）根据信号纯度过滤原始数据。随后，使用bwa-aln比对算法将读取结果映射到人类基因组参考构建hg19。GATK 1.6版[9]用于标记重复读取，围绕短插入和短删除执行局部重新对齐，重新校准基本质量分数，并调用SNP和短索引。CCG内部开发的脚本应用于预测会导致蛋白质变化的变体、影响供体和受体剪接位点的变体以及与已知变体重叠的变体。用最大熵模型分析受体和供体剪接位点突变，并过滤其对剪接的假定影响。特别是，我们将重点放在链接区域（chr12:49329157-52752362和chr20:52882032-61366354；hg19）上，并对其进行高质量过滤（>15倍覆盖率；质量>25；VQSR>-2），以及罕见（MAF<0.005）和杂合变体。几个全基因组数据库（dbSNP Build 135，1000 Genomes Project database Build 20110521[26]以及西雅图NHLBI的公共Exome Variant Server，建造ESP6500[27])检查是否存在已识别的变体。为了排除管线相关伪影（MAF<0.005），我们还根据包含511例癫痫患者外显子变异的内部数据库进行筛选。最后，我们筛选了两名患者中存在的变异。序列变异的验证和分离分析通过Sanger测序进行。的序列数据OSBPL2系统（MIM 606731）与参考序列NM_144498.2进行比较。

耳蜗组织RT-PCR

如前所述，分离小鼠出生后第19天（P19）和大鼠P17耳蜗的mRNA[28]. 298 bp的片段Osbpl2型使用以下引物序列扩增：5′-CCAACTCTGTCAGATGTACAAC-3′（正向）和5′-GCTGTACGCCATTACTTACA-3′（反向）。用PuReTaq进行PCR^TM（TM）准备就绪^TM（TM）PCR珠（GE Healthcare）。扩增条件包括94°C的初始变性阶段4分钟，30 s变性（94°C）、30 s退火（58°C）、30 s延伸（72°C）的35个循环，以及72°C下5分钟的最终延伸阶段。PCR产物在溴化乙锭琼脂糖凝胶上进行分析。使用QIAquick凝胶提取试剂盒（Qiagen）提取片段，克隆并测序。

组织制备和免疫组织化学

使用成年小鼠（年龄在P20至6个月）的耳蜗制备免疫荧光显微镜冷冻切片。为了在冰冻切片上进行免疫组化，在冰上解剖成熟小鼠的颞骨，并立即使用Zamboni的固定剂固定[29]通过圆形和椭圆形窗口注入苦味酸，在冰上培养15分钟，然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗，并在快速骨脱钙器中脱钙（Eurobio，Fisher-Scific）。在PBS中注射25%蔗糖（pH 7.4）后，耳蜗被植入O.C.T.复合物中（Miles Laboratories，Elkhart，in）。然后将组织冷冻切片至10μm厚，安装在SuperFrost*/plus显微镜载玻片上，干燥1h，并在使用前储存在-20°C下。冷冻切片在室温下用0.1%Triton X-100（Sigma-Aldrich）解冻并渗透3分钟，用PBS中的1%BSA封闭，并在+4°C下与PBS中0.5%BSA中的一级抗体孵育过夜。对于双标记研究，标本与两种抗体同时孵育相同的时间段。作为主要抗体，我们使用了：抗ORP-2（OSBPL2）抗体（山羊，Santa Cruz Biotechnology，Inc.，sc-66570，稀释度1:50）、抗prestin抗体（兔子[30]，稀释度1:5000）和抗耳铁蛋白抗体（兔[31]，稀释度为1:10000）。用Cy3-（Jackson Immunoresearch Laboratories）和Alexa488-（Invitrogen，Life Technologies GmbH）结合二级抗体检测一级抗体。嵌入Vectashield安装介质的截面，包含核标记DAPI（Vector Laboratories）。使用配备有电动z轴和落射荧光照明的Olympus BX61显微镜观察切片。为了提高显示分辨率，在图像堆栈中沿z轴（z-stack）在数微米（30×0,27μm，~8μm）的距离上对耳蜗切片进行成像，然后使用cellSens Dimension模块和先进的最大似然估计算法（ADVMLE；OSIS）进行三维反褶积。使用CCD摄像机采集图像，并使用cellSens软件（Olympus Soft Imaging Solutions，OSIS）进行分析。图像是用Photoshop处理的。

的比较Osbpl2型野生型和纯合型之间的mRNA水平米尔96突变体渐弱(米尔96 ^Dmdo公司)老鼠

如前所述，进行皮层器官解剖、RNA提取和cDNA生成[32]. 引物购自Applied Biosystems(Hprt1（小时）：Mm01318747_g1，Jag1型：Mm01270190_m1，Osbpl2型：Mm01210488_m1）。Hprt1型被用作内部控制，并且Jag1型，在支持细胞中表达[32-34]，用于控制存在的感觉组织的数量。配对仅在以下情况下使用Jag1型野生型和纯合子同窝者的水平无显著差异（p>0.05）。对三只动物进行基因分型，每对动物至少进行三次技术复制。反应在CFX Connect机器上进行，使用Bio-Rad SsoFast和SsoAdvanced Master混合物（Bio-RadLaboratories，目录号1725232、1725281）。

结果

临床特征DFNA67公司患者

在大多数受累家庭成员中，首次发现双侧感音神经性非综合征性听力损失是在生命的第二个十年早期，最初影响高频。然而，发病年龄在10岁（IV:7，V:6）和30岁（III:9）之间变化。在许多情况下，真正的发病时间可能更早：回顾过去，患者V:3的父母假设听力已经在2岁左右受损。听力损失的进展也有很大差异。年轻人的症状轻微，但在后期严重到严重（图2)要求5名家庭成员在27至50岁之间植入耳蜗。轻度的IV:10患者在22岁时出现听力损失，34岁时开始使用助听器。没有关于IV:12的听力数据，这是一名39岁的OSBPL2系统突变，不使用助听器，但声称在压力情况下听力较差。三： 7和V:2报告了怀孕和分娩期间听力损失的进展（见表1临床数据摘要）。前庭症状未见报道。

图2

来自 DFNA67公司 家庭。听力阈值显示为受影响较严重的一侧。

表1临床数据汇总

染色体候选基因座的定位

使用ALLEGRO，我们确定了两个基因组区域，最大LOD评分为2.7。获得的LOD得分是该家族中可能的最大LOD得分。我们发现12号染色体上的SNPs rs1316607和rs725029之间存在3.4 Mb的连锁（49329157–52752362），20号染色体上rs2065042和rs720607之间存在8.4 Mb的关联（52882032–61366354）（图三A） ●●●●。

图3

德国人的遗传学 DFNA67公司 家庭。A类全基因组SNP图谱LOD评分计算的图形视图。第12染色体上的3.4 Mb区域和第20染色体上的8.4 Mb区域显示出与表型的潜在联系。B类第20号染色体的象形字，位置为OSBPL2系统指示（红色条）。用可视化的映射序列读取（正向链）的示意图集成基因组查看器（IGV）对于IV号患者：10。中的c.141_142delTG（p.Arg50Alafs*103）突变OSBPL2系统在覆盖该基因区域的一半读取中存在。C类杂合子载体的电泳图OSBPL2系统外显子3突变（缺失的核苷酸被装箱）。突变的定位在操作系统业务流程2基因。D类RT-PCR证明Osbpl2型在小鼠（lane 2）和大鼠（lane3）耳蜗中的转录水平表达。通道1，没有cDNA作为阴性对照。

目标NGS、WES和已识别候选变体的分离分析

在中未发现突变GJB2型以及66个已知耳聋基因的后续靶向NGS。在严格过滤WES数据后，只有两个杂合变异体定位于12号染色体候选区域：c.1516C>G（p.Arg506Gly）变异体SLC11A2型已在dbSNP中注释（rs199589052），但没有MAF可用。双等位基因突变SLC11A2型导致常染色体隐性低色素性小细胞贫血伴铁超载，但未提及任何听力损伤[35]. 因此，杂合子不太可能SLC11A2型突变导致ADNSHL。一种错义变体，c.53G>A（p.Arg18His），在CELA1公司（糜蛋白酶样弹性蛋白酶家族，成员1）。因为它在皮肤组织中表达，CELA1公司被认为是皮肤病的候选者。然而，一个常见的移码多态性质疑该基因的重要性[36]. 此外，p.Arg18His变异体的MAF为0.28%，与导致罕见常染色体显性遗传病的突变不相容。

在20号染色体候选区域中包含的基因中有两个杂合错义变异体：变异体c.1202G>c（p.Arg401Pro）GTPBP5号机组影响进化上非服务的残基，并被注释为多态性rs200118420，MAF为0.04%。中的变体DIDO1型（c.1738A>c；p.Thr580Pro）也会影响未经处理的残留物。突变体迪多-/-+/-小鼠表现基本正常。随着时间的推移，一些杂合小鼠的脾脏、骨髓和外周血出现异常，与骨髓发育不良或骨髓增生的症状重叠[37]. 综上所述，这三个错义变异体似乎都不是ADNSHL-causing突变的候选基因。

在两名患者中均发现无义突变，c.287C>G（p.Ser96*）SLC17A9型，一个与20号染色体位点的端粒边界直接相邻的基因（61583999–61599949）。根据Exome Variant ServerSLC17A9型无义变异体的MAF为0.06%，与候选位点外的基因定位相一致，由该家族的三名健康个体携带（II:5，II:10，IV:13）。此外，p.Ser96* _SLC17A9型 在我们内部数据库的三个样本中也以杂合状态存在：一名癫痫患者、一名肌萎缩侧索硬化患者和该患者的健康母亲。这三个人都没有听力损失。

我们在一个映射的候选区域中只发现了一个基因截短变体：两名患者都携带移码突变c.141_142delTG（p.Arg50Alafs*103）OSBPL2系统（图三B、 C），一个来自20号染色体区域的基因。这种变异在上述任何数据库中都没有注释，也没有可用的等位基因频率，并且它与家族中的听力损失完全分离。

的表达式Osbpl2型在小鼠耳蜗中

我们分析了Osbpl2型在听力后动物的转录水平上，使用RT-PCR和来自整个小鼠（P19）和大鼠（P17）耳蜗的mRNA。放大倍数Osbpl2型在两只小鼠中都发现了适当大小的（298 bp）（图三D、 通道2）和大鼠耳蜗（图三D类；车道3）。接下来，我们使用抗Osbpl2抗体结合用作外毛细胞（OHC）标记的抗prestin抗体或用作内毛细胞（IHC）标记的抗体，在蛋白质水平上分析了小鼠Corti器官中Osbpl 2的表达。在两个OHC的静纤毛中检测到Osbpl2（图4A、 B）和IHC（图4C、 D）。我们发现P20和6个月大的小鼠（未显示）之间Osbpl2的表达没有差异。

图4

OSBPL2在小鼠耳蜗内外毛细胞静纤毛中的表达。A类,B类OSBPL2（绿色）在耳蜗外毛细胞（OHC）的静纤毛中表达，与成熟（P20）小鼠的抗prestin抗体（红色）联合免疫染色证明。遗漏一级抗体后，未发现免疫染色，这表明OSBPL2抗体的特异性（插图）。C类,D类OSBPL2（绿色）也在耳蜗内毛细胞（IHC）的静纤毛中表达，与抗耳蜗费林抗体（红色）联合免疫染色证实。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺，10μm。

的比较Osbpl2型野生型和纯合型之间的mRNA水平米尔96突变小鼠

野生型和纯合子水平之间未观察到显著差异Osbpl2型Corti器官中的mRNA（附加文件1).

讨论

ADNSHL涉及大约30个基因的突变（有各种证据）[2]. 各自的基因产物可分为许多不同类别，包括离子通道和转运体、运动分子、细胞外基质成分、细胞骨架、粘附复合物等[1].

在我们家族12号和20号染色体上定位候选区域的基因中发现的五种杂合变体中OSBPL2系统移码突变代表ADNSHL-causing突变的合理候选（见结果部分）。OSBPL2不属于上述任何蛋白质类。它是脂结合/转移蛋白、氧化甾醇结合蛋白（OSBP）和相关蛋白（OSBPL）的一个12成员进化高度保守家族的一部分，这些蛋白具有OSBP特征，即EQVSHHPP[38]. OSBPL蛋白在脂质的非泡状细胞内运输中起着重要作用，尤其是胆固醇衍生物氧甾醇。OSBPL作为固醇传感器和转运体，调节细胞器膜的脂质组成和蛋白质复合物的组装，从而影响信号传导、小泡运输和脂质代谢[39].

Osbpl2型是132个具有3′UTR的mRNAs中的一个，预测其含有潜在的靶位点miR-96型[32]一种微RNA，其突变会导致小鼠和人类的渐进性听力损失[32,40]，但我们没有发现Osbpl2型在里面米尔96突变小鼠(渐弱)（附加文件1). 然而，除了先前报道的在小鼠听觉开始时Corti器官中的表达外[41]，有几条证据表明OSBPL2系统是本文描述的家族中ADNSHL的潜在基因：移码突变c.141_142delTG很可能代表导致功能丧失的等位基因操作系统业务流程2单倍不足。它要么导致151个残基（野生型：480个残位）的截短非功能蛋白，包括102个无关氨基酸（p.Arg50Alafs*103），要么导致不稳定的mRNA经历非传感介导的衰变。OSBPL2与透明同源物1（隔膜1）相互作用[42]，人类ADNSHL 1型中突变的基因(DFNA1公司) [43]. DIAPH1是一种Rho效应蛋白，通过与肌动蛋白、微管和其他与细胞骨架功能相关的蛋白质相互作用来调节细胞骨架动力学[44,45]. 中的突变隔膜1被认为会损害毛细胞的静纤毛（强烈依赖于其肌动蛋白细胞骨架）和激毛细胞体（围绕微管骨架构建）的结构完整性。正如对DIAPH1的假设一样，OSBPL2可以在毛细胞细胞骨架的维持中发挥作用，这与静纤毛中显著存在的OSBPL2蛋白相兼容（图4). OSBPL2结合磷脂酰肌醇（3,4,5）-三磷酸（PtdIns（3,4，5））P（P） _三) [46]，一种质膜磷脂，对确定神经元极性至关重要[47,48]，这可能暗示OSBPL2可能是建立和维持毛细胞极性所必需的。这两种蛋白质的相互作用是否反映在（至少部分）细胞共定位中，还有待确定。

值得注意的是OSBPL2系统最近，在一个中国大家族中，与受本文报道的突变影响的核苷酸位置非常接近的移码突变被描述为与ADNSHL共分离[49]. 类似于德国DFNA67公司发病年龄可变（5至32岁），听力损失呈进行性，从轻度到重度不等。这个额外的DFNA67公司家人强烈支持OSBPL2系统ADNSHL突变。

紧邻20号染色体候选位点的基因中的截断变体，是一种无义突变SLC17A9型p.Ser96*不太可能导致听力损失，因为它存在于我们家庭的健康个体和我们511个癫痫外显子的内部数据库中，也存在于普通人群中。SLC17A9型编码囊泡核苷酸转运体[50]最近有报道称，该基因的杂合突变可导致播散性浅表光化性汗孔角化症[51]. 我们的12名员工中没有一人DFNA67公司携带p.Ser96的家人* _SLC17A9型 突变有任何皮肤异常。总之，SLC17A9型不仅与这个家庭的听力损失无关；它的单倍体不足似乎也不会导致DSAP。因此，DSAP的表现可能仅由具有显性负效应的错义突变引起。另一方面，我们的数据挑战了以下假设：SLC17A9型突变导致DSAP，似乎有必要进行额外的研究来验证SLC17A9型皮肤病。

结论

协会OSBPL2系统ADNSHL突变表明脂质代谢在毛细胞功能中的作用，定义了另一类与听力损失有关的蛋白质功能。然而，需要进一步研究来阐明OSBPL2缺陷是如何导致听力损失的。OSBPL家族的其他成员应被视为未来旨在鉴定新耳聋基因的潜在候选基因。