瑞士法郎8抑制组蛋白H3赖氨酸36三甲基化并改变RNA选择性剪接

摘要

色域解旋酶DNA-结合蛋白8基因的破坏性突变(瑞士法郎8)反复与自闭症谱系障碍（ASD）相关。在这里，我们研究了染色质如何与瑞士法郎8通过分析诱导的多能干细胞衍生神经祖细胞中的组蛋白修饰来抑制。瑞士法郎8抑制导致基因体组蛋白H3K36me3峰值显著降低（47.82%），特别是对转录伸长染色质状态的影响。H3K36me3的减少特别影响高表达的CHD8-结合基因，并与462个涉及“RNA剪接调控”和“mRNA分解代谢过程”的基因的选择性剪接模式改变相关。质谱分析揭示了CHD8与剪接调控因子异质核核糖核蛋白L（hnRNPL）之间的一种新的相互作用，为解释CHD8和剪接调控蛋白L之间的相互作用提供了第一个机制性见解瑞士法郎8抑制衍生剪接表型，部分涉及SETD2，一种H3K36me3甲基转移酶。总之，我们的研究结果表明瑞士法郎8抑制、导致组蛋白沉积/维持改变和RNA加工调控是ASD的重要调控过程。

引言

从头开始色域解旋酶DNA-结合蛋白8基因的截断突变(瑞士法郎8)已被报道并独立验证为孤独症谱系障碍（ASD）的一个强烈危险因素(1–7).瑞士法郎8在西蒙斯基金会自闭症研究倡议（SFARI）中被归类为高置信度自闭症谱系障碍候选风险因素（得分1）[网址：https://gene.sfari.org(8)]. 超过50%的报告瑞士法郎8与疾病相关的变异可分为假定的功能丧失突变（拷贝数丢失、移码变异、停止获得和易位）（59.18%ClinVar数据库https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar网站/;56.36%SFARI数据库网址：https://gene.sfari.org/)更可能导致蛋白质单倍体不足。瑞士法郎8定义了ASD患者的一个亚类，表现出明显的大头畸形、明显的面部特征、睡眠问题和胃肠道不适(9,10). 大多数这些表型特征在冠心病8击倒斑马鱼(9,11)最近，在第8章抑制小鼠模型(12–15). 的确，冠心病8-吗啉斑马鱼和第8章杂合小鼠表现出大脑增大，这可能是由发育中大脑区域的基因表达改变引起的(11,14). 值得注意的是，还检测到影响ASD相关基因的全基因组转录组变化在体外，在人类神经前体细胞（hNPC）中瑞士法郎8表达式(11). 综上所述，这些观察结果表明，导致大脑发育改变的异常全基因组转录与CHD8功能水平降低密切相关。然而，CHD8调节这一过程的详细分子机制仍不清楚。

由于CHD8能够在hNPC、小鼠胎儿中脑和胚胎皮层的启动子和增强子区域结合DNA，因此可以提出直接作用(11,16). 然而，由于其他不受CHD8约束的基因似乎在以下情况下转录失调，因此也可以推测间接机制瑞士法郎8抑制(11). 染色质结构与转录和基因表达密切相关(17). CHD8与MLL和CoREST、SWI/SNF和NuRD ATP依赖性重塑复合物的成分共同纯化，支持其在转录起始中的可能作用(18). 另一方面，CHD1（CHD蛋白家族的另一个成员）的减少改变了H3K4me3和H3K36me3模式，表明其在建立/维持这些相互排斥的组蛋白标记边界方面的作用(19). SETD2和SETD5组蛋白H3、Lys36甲基转移酶通常与RNA聚合酶II（RNAPII）相关，其活性导致H3K36me3向活性基因3′端增加(20,21). 基于其在系统发育树上的位置和ATP酶域的存在(18)CHD8很可能是ATP依赖的染色质重塑因子；因此，与CHD1类似，CHD8缺失可能导致核小体周转增加和共转录过程的改变，例如基因体内的隐性转录和选择性剪接（as）(22,23). 除了一般的剪接机制外，许多RNA结合蛋白（RBPs），如富含丝氨酸的蛋白（SR蛋白）和异质核核糖核蛋白（hnRNPs），也起到剪接增强子和消音器的作用(24–26). 广泛的染色质构象和转录动力学也起作用：染色质松弛加速RNAPII处理，通常与选择性外显子跳跃相关；相反，堆积的核小体减慢了RNAPII的进展，导致转录暂停和包含非构成性弱外显子(27–34). 反过来，异常剪接可能导致神经元发育和功能障碍的改变(35–38). 因此，由于实验证据表明染色质调节失调是ASD发病机制中的一个关键特征，因此很容易假设CHD蛋白的染色质功能，尤其是CHD8，可能会调节RNA转录、延伸和加工，从而对ASD中观察到的典型神经发育效应负责。

为了剖析这种机制，我们描述了瑞士法郎8抑制染色质景观，使用染色质免疫沉淀和测序（ChIP-seq）分析不同组蛋白修饰。具体而言，我们询问了对照诱导多能干细胞（iPSC）中转录活性（H3K4me2、H3K4me3、H3K27ac和H3K36me3）和抑制区域（H3k17me3）以及活性/平衡增强子（H3K 4me1和H3K 27ac）的组蛋白标记特征-衍生的神经元前体细胞和先前特征的细胞系中瑞士法郎8通过慢病毒传递短发夹RNA（shRNAs）获得(11). 我们发现了影响高转录基因体内H3K36me3组蛋白标记的变化，这些变化并不主要影响RNA转录，而是改变与“mRNA分解代谢过程”、“RNA剪接调控”和“翻译起始”相关的基因的AS。引人注目的是，通过对人类神经祖细胞的质谱（MS）分析，我们确定并验证了CHD8和hnRNPL之间的一种新的直接蛋白-蛋白质相互作用。据报道，该剪接调节器是H3 Lys36三甲基化活性所需的人类KMT3a/SET2复合物的一部分(39,40)，代表了一种新的连接染色质与RNA加工调控之间的桥梁，可能对ASD和其他目前无法治愈的大脑疾病具有重要意义。

材料和方法

蜂窝模型

人iPSC衍生NPC株GM8330-8(41)由Stephen Haggarty博士（美国马萨诸塞州波士顿马萨诸塞总医院和哈佛医学院）实验室提供。第1页-瑞士法郎8，第2页-瑞士法郎8，第4页-瑞士法郎8和Sh-GFP公司（绿色荧光蛋白）系以前是通过慢病毒传递靶向shRNAs产生的瑞士法郎8和GFP公司编码序列，分别(11).

细胞在聚乳酸上培养-我-氢溴酸鸟氨酸（20μg/ml，Sigma）/层粘连蛋白我-谷氨酰胺（康宁）和补充表皮生长因子（EGF；20 ng/ml，西格玛）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF；20 ng/ml，研发）和肝素（5μg/ml，西格玛）]。hiNPC的半融合单层保持在5%的CO中₂，37°C增湿培养箱。

染色质免疫沉淀和测序（ChIP-seq）

使用以下描述的协议执行ChIP(42)，稍作修改。简言之，～25×10⁶iPSC衍生NPC、控制和Shs-瑞士法郎8用1%甲醛固定，室温下旋转培养10min。通过加入1.1ml 2.5M甘氨酸并在室温下旋转孵育5分钟来终止交联。细胞以1000 rpm的速度造粒，再悬浮在冰镇磷酸盐缓冲液（PBS）/蛋白酶抑制剂（PI）中，以1000 rpm旋转5 min，用冰镇PBS洗涤两次，收获、造粒并直接再悬浮在300μl裂解缓冲液/PI中[50 mM Tris–HCl（pH 8.1），1%十二烷基硫酸钠（SDS），10 mM EDTA]，在冰上保持10分钟，偶尔旋转，每3分钟剧烈旋转15秒。使用生物破坏者声波仪（Diagenode）对200–700 bp样本涂片进行声波处理，在满功率条件下进行总共45分钟的声波处理，声波处理周期为30 s开/30 s关。样品在4°C下以最大速度离心10分钟。然后，将剪切的染色质在补充有PI的ChIP稀释缓冲液【16.7 mM Tris–HCl（pH 8.1）、167 mM NaCl、0.01%SDS、1.1%Triton X-100、1.2 mM EDTA】中稀释10倍。取出50μl等分的剪切染色质，作为对照等分（INPUT）保存在4°C下。将每个样品与感兴趣的抗体（20μg/ChIP）在4°C下孵育过夜。使用了以下主要抗体：H3K27me3（07-449，Millipore）、H3K4me3（Ab8580，Abcam）、H3 K36me3（Ab9050，Abcam）、H4K4me2（Ab7766，Abcan）、H3+4me1（Ab8895，Abca姆）和H3K17ac（Ab4729，Abcam.）。用Dynabeads蛋白A珠（Invitrogen）沉淀染色质-抗体复合物，并依次用低盐[20 mM Tris–HCl（pH 8.1）、150 mM NaCl、0.1%SDS、1%Triton X-100、2 mM EDTA]、高盐[20 m M Tris-HCl（PH8.1）、500 mM NaC1、0.1%十二烷基硫酸钠、1%Trion X-100、2mM EDTA]、LiCl[10 mM Tris-HCl（pH 8.1）、0.25 M氯化锂、1%NP-40、1%去氧胆酸钠、1 mM EDTA]和TE洗涤缓冲液[10 mM Tris–HCl（pH 8.0）、1 mM-EDTA]。然后在洗脱缓冲液[TE加1%SDS、150 mM NaCl、5 mM二硫苏糖醇（DTT）]中洗脱免疫沉淀染色质和INPUT样品，在65°C下脱交联过夜，并用蛋白酶K处理。使用苯酚：氯仿：异戊醇进行DNA分离。用200 mM NaCl沉淀DNA，补充30μg糖原，用乙醇洗涤，然后用RNase I（Invitrogen）处理。最后，用MinElute试剂盒（Qiagen）纯化DNA。使用Qubit 2.0荧光计系统（Invitrogen）对ChIP和INPUT DNA进行定量。按照制造商的说明，使用NEBNext UltraII DNA文库制备试剂盒（Illumina）从5 ng片段DNA开始制备ChIP-seq文库，无需修改。为了获得足够的材料进行测序，对适配器样片段进行了八次聚合酶链反应（PCR）扩增。

组蛋白标记的ChIP-seq分析

使用BWA（版本0.7.15）在人类基因组参考组件GRCh38上对齐ChIP-seq读数(43). 对对齐读取进行过滤，以丢弃未映射、多重映射、PCR重复读取（Picard tools MarkDuplicates版本：2.3.0，Picard Toolkit.2019）。GitHub知识库Broad Institutehttp://broadinstitute.github.io/picard网站/)以及低质量对齐（samtools视图-q 1，samtoolsversion 1.71.7）(44). MACS2（版本2.1.0）使用最小FDR（错误发现率；Benjamini–Hochberg调整P（P）-值）阈值为0.00001。H3K27me3和H3K36me3标记使用了相同的设置，并添加了-宽选项(45). 局限于黑名单地区的峰值(http://mitra.stanford.edu/kundaje/akundaje/release/blacklists/)或未定位的挫伤被过滤掉。小于350 bp的窄峰（对于H3K27ac、H3K4me1、H3K4me2和H3K4me3组蛋白标记）合并为一个单一峰[BEDTools merge（版本2.25.0）]。如果峰重叠了最短峰长度的至少50%[BEDTools intersect（版本2.25.0）]，则认为重复之间的峰是常见的，然后保持扩展坐标并用于下游分析。CHD8 ChIP-seq读取自(11)将[BWA（版本0.7.15）]重新对准参考GRCh38，并使用与窄组蛋白标记相同的程序调用峰，默认的FDR阈值为0.05，因为只保留了所有三种抗体识别的峰。GENCODE v.26用于峰值注释(46). 丢失H3K4me1、H3K27ac和H3K36me3的基因在瑞士法郎8利用clusterProfiler[版本3.10.1(47)]Benjamini–Hochberg调整后P（P）-值截止值为0.05。2019年9月9日，从Ensemb BioMart下载了使用的slimGO术语的完整列表。使用单尾Fisher精确检验在自定义基因集上评估相同基因列表的富集度。自定义基因集来自公共数据库和感兴趣的出版物(补充表S1). 只有非冗余基因列表在P（P）-值<0.01如图所示1G个; 完整的浓缩结果可在补充表S1结合基因组上的组蛋白标记富集模式，确定了10种染色质状态作为对照（Sh-GFP公司和Sh-GFP公司2） 使用ChromHMM（版本1.14）(48). 根据文献手动注释状态。使用BEDTools intersect（版本2.25.0）计算每个组蛋白标记在两个重复中这些区域中调用的峰数(49)，以及控制和瑞士法郎8计算击倒率。每个组蛋白标记的总峰数（以百分比表示）绘制为对照细胞中的热图（图1B年，左）；差异（图1B年，右）是指控制峰值的百分比-瑞士法郎8KD峰值。每个标记在每个染色质状态下的峰数用双面测试吨-测试（python 3.6 scipy.stats.ttest_ind），考虑控件和瑞士法郎8击倒。对三个样品进行了H3K36me3的差异富集分析瑞士法郎8击倒样品（Sh1-瑞士法郎8，第2页-瑞士法郎8和Sh4-瑞士法郎8)和两个控件（Sh-GFP公司和Sh-GFP2公司)带有DiffBind[版本2.14(50,51)]和DESeq2用于差分分析，使用MACS2之前称为的峰，存在于至少两个样品中。FDR<0.05的峰值被视为差异富集。图中的火山图1用ggplot2绘制[版本3.3.2(52)]. 要使用deepTools 3.2.1版生成元基因配置文件(53)，使用SES方法将ChIP-seq样本归一化为INPUT(54). 在基因体上方的10 bp箱子中计算富集度，缩放到基因上游和下游的5 kbp和2 kbp。为了最大限度地减少元基因图谱中的噪声，在绘制之前，对蛋白质编码基因应用了一组严格的过滤器：最小长度为2kbp，与其他基因的最小距离为4kbp，并且在相反链上没有其他特征，从而产生了一组9442个蛋白质编码基因。对于每个组蛋白标记，只绘制了富集的基因（至少一个非零bin）。基于CHD8结合富集模式，通过k-means和deepTools plotProfile命令将这些基因分为三组。为了补充统计假设检验，计算了整个区域各组之间的成对Cohen d效应大小统计(55). 99%的同时置信区间是在控制FWER（Bonferroni校正）的情况下构建的。使用deepTools computeMatrix参考点计算CHD8-结合位点剖面，并使用deep工具plotProfile绘制。染色质富集轨迹的可视化使用综合基因组查看器[IGV，2.4.9版(56)].

RNA-seq和AS数据分析

从Sugathan获取的原始读取等。(11)对于相应的样本（Sh-GFP公司，Sh-GFP2公司，第1页-瑞士法郎8，第2页-瑞士法郎8和Sh4-瑞士法郎8)被kallisto用来计算转录物丰度（版本0.44.00）(57)GENCODE v.26抄本。来自sh的RNA-seq的超脚本RSEM标准化读取计数-hnRNPL公司HepG2和K562人类细胞系中的对照样品来自ENCODE（ID:ENCSR155BMF和ENCSR563YIS）。百万分转录本（TPM）用于绘制表达水平。RNA-seq库来自hnRNPL公司小干扰RNA（siRNA）处理样品（si-hnRNPL公司-C） 用TRIZOL（Invitrogen）分离的总RNA经DNase（AMBION）处理后，获得si-scrambled control（si-SCR）。用安捷伦生物分析仪评估RNA质量（RNA完整性数从7.8到9.2）。根据Illumina stranded mRNA Prep制造商的方案，从100ng纯化的总RNA开始制备Illumina文库。使用Illumina RNA UD Indexes的IDT，配体试剂盒（Illumina）对样品进行条形码。文库质量通过DNA 1000试剂盒和2100生物分析仪（安捷伦科技公司）进行检查。100 bp配对测序由Novaseq 6000系统（Illumina）在意大利理工学院（IIT，Genova，Italy）基因组学设施进行，每个样本获得约5000万到6000万个读数。SUPPA（2.3版）用于通过经验方法计算每个剪接事件的拼接百分比（PSI）值(58). 为P（P）-值<0.05且ΔPSI>0.2。Sugathan的原始读数相同等。(11)与STAR（版本2.6）一致(59)使用GRCh38参考上的默认参数，使用rMATS[版本3.1.0]分析AS(60)]. 由于这两种As分析方法是互补的(https://github.com/comprna/SUPPA/issues/47)，这两项都包括在分析中。为了检查剪接事件与染色质标记的重叠，剪接的进出外显子坐标与组蛋白标记峰的坐标相交。AS事件通过ggsashimi（版本0.4.0）在生鱼片图中表示(61)使用GENCODE注释v.33作为参考(46).

苏特林原始读取等。(14)来源于P5小鼠皮层（GSE81103；样品P5HET 1、P5HET2、P5WT 1和P5WT2），以及Sood的读数等。(62)按照前面的描述处理分化的小鼠NPC（GSE155217；样品RNA_WT_NPC_rep1、RNA_VT_NPC_rep2、RNA_CHD8_Het_NPC_rep1和RNA_CHD8_Het-NPC_ref2），并用于验证分析(补充图S10). 通过使用从BioMart获得的转换表（包含两个物种的集合ID），将来自这两个数据集的小鼠基因转换为相应的人类同源基因(http://www.ensembl.org（英语）)：GRCh38.p13和GRCm39数据集（103版）用于转换(63).

RBP图案匹配

匹配来自CISBP-RNA数据库的人类RBP的已知图案(64)，通过Biopython软件包v1.78获得(65)以95%的相似度和0.001的假阳性率作为阈值。通过考虑剪接事件中涉及的外显子的100 nt上游和下游，通过BioMart biomRt R包提取，获得进行匹配的序列(66).

ChIP qPCR

在显示H3K36me3富集显著缺失和至少一个显著差异剪接事件（SUPPA v2.3 RNA-seq分析结果，0.30ΔPSI阈值）的基因组区域上选择了用于ChIP定量PCR（qPCR）实验验证的候选基因。ChIP-seq和RNA-seq中信号变异最大的基因被优先排序。检索显示显著H3K36me3峰值丢失的基因组区域的FASTA序列，并将其作为模板，用于使用NCBI primer-BLAST工具设计ChIP qPCR引物(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast网站/)，和生物信息学用NCBI BLAST进行特异性筛选(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi网站)和UCSC In-Silico PCR工具(https://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr). 扩增子大小通过电泳凝胶运行测试，序列特异性通过Sanger测序（Eurofins）验证。使用200 pg ChIP DNA和等量未富集的INPUT DNA进行qPCR分析，反应体积为10μl，与iTaq™Universal SYBR®Green Supermix（Biorad）使用Thermal Cycler C1000 CFX384或CFX96（Biorad）上的推荐热循环参数。用CFX Manager v3.1软件进行qPCR分析。至少分析了两个qPCR技术复制品，其内变异<0.5 Cq。两个基因沙漠地区hGD12（chr12:61273372–61273435）和hGD4（chr4:187946873–187946954）被用作阴性对照。使用2计算INPUT上的折叠富集^–ΔΔCq方法。根据条件，分析每个细胞克隆的两个或三个生物复制品。图中的误差条表示平均值的标准误差（SEM）。

RNA提取、反转录和半定量PCR

如上所述，差异剪接实验验证的候选基因在ChIP qPCR目标中优先排序。对于外显子跳过事件（SE），利用IGV（2.4.9版）从GENCODE注释v.33中检索到不变上游和下游外显子的FASTA序列（相对于差异事件中涉及的外显子），并分别用作正向和反向引物设计的模板，为了扩增“剪接入”和“剪接出”转录亚型。按照制造商的指示，使用TRIZOL试剂（Invitrogen）从iPSC-derived NPC株系中提取总RNA。通过在37°C下用DNase I（Invitrogen）和RNase抑制剂SUPERase（Invit罗gen）处理样品30分钟，然后用RNase Mini Kit（Qiagen）纯化，去除DNA污染。通过琼脂糖凝胶电泳运行和安捷伦2100生物分析仪评估RNA质量。使用SensiFAST cDNA合成试剂盒（Bioline）逆转录1μg等分RNA。通过使用Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix（Thermo Scientific），使用得到的cDNA进行半定量PCR。TATA-结合蛋白（TBP）作为参考基因。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳分离。使用ImageJ软件（版本1.46r）通过密度分析评估靶转录物的ΔPSI，并与Sh相对-GFP公司行作为参考样本。数据表示为每个拼接事件计算PSI值的平均值±SEM。单侧吨-使用Excel进行测试；显著性水平报告为不显著（NS）P（P） >0.05, *P（P） ≤0.05, **P（P） ≤0.01, ***P（P） ≤0.001, ****P（P） ≤0.0001.

酸性萃取和western印迹分析

用PBS清洗hiNPC，并将其重新悬浮在100μl提取缓冲液中[10 mM HEPES pH 8，10 mM MgCl₂、0.1 mM EDTA pH值8、0.1 mM DTT和停止蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（生命科技）]。样品在4°C下以5000 rpm离心10分钟，以去除细胞溶质部分。将核芯块重新悬浮在0.2 N HCl中，并在4°C下旋转过夜。在4°C下以4000 rpm离心10分钟后，回收含有核蛋白的上清液。蛋白质通过Bradford蛋白质检测试剂盒（Sigma-Aldrich）定量。蛋白质样品由4–12%Bis–Tris蛋白凝胶（Thermo Fisher）分离，并转移到Amersham™Protran™0.45μm硝化纤维素（GE-Healthcare）膜上。用5%w/v无脂奶粉封闭膜，并用以下主要抗体培养：抗CHD8（NB100-60417，Novus Biologicals）（1:1000）、抗HSP90（4874S，细胞信号技术）（1:5000）、抗组蛋白H3（1:1.000）（4499，细胞信号技术）和抗组蛋白H3K36me3（1:1.00）（Ab9050，Abcam）。使用辣根过氧化物酶缀合的第二抗体抗兔IgG 1:7500（GTX213110-01，GeneTex）检测蛋白质，并按照制造商的说明通过ECL Select WB检测试剂（GE Healthcare）进行可视化。使用Imagelab软件（BIORAD，5.2.1版）进行信号量化。

统计分析

蛋白质印迹实验中的目标蛋白差异分析通过执行非配对、单尾吨-测试。总共吨-经检验，显著性水平设为0.05。数据以平均值±标准差（SD）表示。显著性水平报告为：NSP（P） >0.05, *P（P） ≤0.05, **P（P） ≤0.01, ***P（P） ≤0.001.

细胞分馏

使用中描述的方案进行细胞分馏(67)稍作修改。简言之，50×10⁶将细胞重新悬浮在5 ml低渗裂解缓冲液中[HLB最终成分浓度：10 mM Tris（pH 7.5）、10 mM NaCl、3 mM MgCl₂，0.3%（v/v）NP-40和10%（v/v）甘油]补充PI和磷酸酶抑制剂（PhI）。悬浮液在冰上孵育8分钟，然后在4°C下在800℃下离心10分钟克.将含有细胞质部分的上清液与含有原始核部分（RNF）的颗粒分离。然后用HLB清洗RNF三次，并在800℃下离心2分钟克温度为4°C。将颗粒重新悬浮在2.5 ml核溶解缓冲液中[NLB，最终成分浓度：20 mM Tris（pH 7.5），150 mM KCl，3 mM MgCl₂0.3%（v/v）NP-40和10%（v/v）甘油]补充PI和PhI。在18000离心之前，使用Q700（Qsonica）对样品进行超声波处理克在4°C下保持30分钟。收集上清液作为核组分（NF）用于免疫沉淀和western blot分析。采用Pierce BCA蛋白检测试剂盒（生命技术），以牛血清白蛋白为标准曲线（Sigma），对NF蛋白浓度进行定量。对于western blot分析，使用含有5%Bolt样品还原剂（Life Technologies）的SDS-loading缓冲液LDS样品缓冲液（Invitrogen）在92°C下加热NF蛋白10分钟。将样品加载到带有蛋白质标记（Euroclone）的4–12%Bis–Tris蛋白凝胶（Thermo Fisher）上，并通过电泳分离样品。电泳后，将蛋白质转移到硝化纤维素膜（GE-Healthcare）。用一级抗体[CHD8 NB100-60417（Novus Biotechnology）、hnRNPL D-5（sc-48391，Santacruz）、SETD2（38633，SAB）、PARP1（9542，Cell Signaling Tech.）、Lamin A/C（sc-376248，Santarcuz），GAPDH（ABS16，Merck）、HSP90 3C9（BSM-51215M，Bioss）组蛋白H3（三甲基K36）（Ab9050，Abcam）隔夜孵育吸膜组蛋白H3（4499S，细胞信号技术）]，然后用含0.1%吐温的PBS洗涤三次，并用特异性二级抗体在4℃孵育1小时。

免疫沉淀和western印迹分析

对于每个免疫沉淀，将核部分中的1 mg总蛋白与1μg靶蛋白特异性一级抗体在4°C下旋转培养过夜。对于CHD8免疫沉淀，使用NB100-60417和NB100-604.18（Novus Biotechnology），对于hnRNPL D-5（sc-48391，Santacruz）和SETD2（38633，SAB），同时使用兔IgG同型对照（10500C，Life）或鼠IgG（10400C，Invitrogen）作为对照。蛋白A–Sepharose（CL-4B euroclone）或蛋白G-Sepharoze（GE-Healthcare）珠通过与NF在4°C下旋转培养45分钟来预先清除。然后取出珠子，并在37°C下用100μg/ml RNase A（Invitrogen）或2 U/ml DNase I（Invit罗gen）将清除的NF（CNF）处理15分钟，或直接用于与一级抗体（NF with antibody，NFA）的过夜培养。另一方面，在没有（未经处理的NT条件）或存在50μg/ml溴化乙锭（EtBr；Sigma-Aldrich）的情况下，将CNF与一级抗体孵育过夜。所有不同的NFA最终与珠子孵育45分钟，在4°C下旋转。然后用NLB缓冲液洗涤结合络合物三次。对于western blot分析，使用含有5%Bolt样品还原剂（Life Technologies）的SDS-加载缓冲液LDS样品缓冲液（Invitrogen）在92°C下洗脱干燥的Sepharose珠复合物10分钟。将样品加载在带有蛋白质标记（Euroclone）的3-8%三醋酸蛋白凝胶（Thermo Fisher）上，并通过电泳分离。电泳后，将蛋白质转移到硝化纤维素膜（GE-Healthcare）。用一级抗体[CHD8 NB100-60417（Novus Biotechnology）、hnRNPL D-5（sc-48391，Santacruz）和SETD2（38633，SAB）]培养滤膜过夜，然后用含有0.1%吐温的PBS洗涤三次，并用特异性二级抗体在4℃培养1小时。

样品制备和质谱

将共免疫沉淀的样品加载在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶上，运行约1cm。然后用考马斯对凝胶进行染色，并将整个染色区域作为一个样品切除。将切除的凝胶带切成小块（～1 mm^三)分别用10 mM DTT和55 mM碘乙酰胺进行还原和烷基化。然后在水中清洗凝胶片，用乙腈（ACN）脱水，并在快速真空中干燥。凝胶塞用50mM NH重新水合₄一氧化碳_三含有12.5 ng/ml胰蛋白酶（Promega）的冰溶液30分钟。在37°C下继续消化过夜。收集上清液，并用30%ACN、3%三氟乙酸（TFA）和100%ACN从凝胶中依次提取肽。所有上清液在SpeedVac中混合并干燥。然后用1%TFA将胰蛋白酶肽酸化至pH<2.5，在C18级尖端上脱盐，并在20μl 0.1%甲酸缓冲液中重新悬浮，用于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS分析）。肽在Easy-nLC 1200高效液相色谱（HPLC；Thermo-Fisher）系统上通过85 min梯度和400 nl/min流速在25 cm柱上分离，柱内径75μm，内部填充ReproSil-Pur C18-AQ材料（3μm粒径，Dr Maisch，GmbH）。梯度设置如下：在流速为400 nl/min的情况下，在52 min内从5%到25%，在8 min内从25%到40%，在10 min内从40%到98%。缓冲液为水中0.1%的甲酸（a）和ACN（B）中0.1%的乙酸。在Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪（Thermo Fisher）中以数据依赖模式分析肽，在Orbistrap中以120 000 FWHM分辨率（200米/z)之后，在3 s的循环时间内进行一组（高能碰撞离解）MS/MS扫描。在350–1100的质量范围内进行全面扫描米/z，目标值为1×10⁶离子和最大注入时间为50 ms。在30%的碰撞能量、150 ms的最大注入时间（离子阱）和5×10的靶点下进行ms/ms扫描^三离子。

质谱数据分析和处理

使用Proteome Discoverer软件v.2.2.0（Thermo Fisher Scientific）搜索原始文件。针对生物信息学消化UniProt人类数据库（2019年7月下载）和包含常见污染物的数据库。选择胰蛋白酶/P作为五个缺失裂解的酶。研究中纳入了对氨基甲酰（C）进行静态修饰，并对氧化（M）和乙酰化（蛋白质N项）进行可变修饰。MASCOT搜索引擎[v.2.6.2（MatrixScience）]用于识别蛋白质，使用前体质量耐受性10 ppm和产品质量耐受性0.6 Da。在肽和蛋白质水平上将FDR设置为1%。过滤结果以排除潜在污染物。根据每个样品中特定蛋白质丰度的平均值对肽的峰值强度进行标准化(68). 通过复制并减去IP样品的IgG平均值，对单个肽的对数归一化强度进行平均；计算每个肽的折叠变化（FC）。然后，通过平均分配给每个蛋白质的所有肽的FC来计算每个蛋白质的FC。通过比较IP样品和IgG对照（IP/IgG）的倍增浓度来检测CHD8-结合伙伴。使用Student’s吨-检验（双尾，双样本不等距方差，Excel）。在单个重复的情况下，通过减去IP样品中IgG的对数2归一化强度来计算每个肽的富集度。如前所述计算统计显著性（学生吨-测试）。

hnRNPL的靶向siRNA敲除

总计3×10⁶使用Lonza Nucleofector®2b设备和定制的电穿孔缓冲液（5 mM KCl、15 mM MgCl）用200 pM siRNA寡核苷酸对hiNPC进行电穿孔₂，10 mM葡萄糖和120 mM K₂高性能操作₄/千赫₂人事军官₄pH 7.2）。在电穿孔48-72小时后测定击倒效率。靶向hnRNPL基因的siRNA寡核苷酸（三个独特的27-mer和一个通用的加扰阴性对照）购自OriGene（SR302174）。使用RIPA缓冲液（ThermoScientific）提取用于蛋白质印迹的蛋白质，并在离心前使用Q700（Qsonica）进行超声处理，同时使用TRIZOL（Invitrogen）获得总RNA。

结果

瑞士法郎8抑制显著影响转录延长染色质状态

评估瑞士法郎8对染色质组织的抑制，我们采用了先前表征的对照iPSC衍生的NPC系GM8330-8及其衍生物，其中瑞士法郎8通过慢病毒介导的shRNAs传递获得(11). 在这些模型系统中，我们使用ChIP-seq分析了六种不同的组蛋白修饰，特别是询问转录活性（H3K4me2、H3K4me3、H3K27ac和H3K36me3）和抑制区域（H3k17me3）以及活性/平衡增强子（H3K 4me1和H3K 27ac）。对于六个组蛋白标记中的每一个，三个独立的shRNA靶向瑞士法郎8（Sh1、Sh2和Sh4）和针对GFP公司使用的顺序（图1安培). 第1页-瑞士法郎8，第2页-瑞士法郎8和Sh4-瑞士法郎8呈现出几乎可比的水平瑞士法郎8约为其生理水平的50%，因此精确模拟了人类的单倍体不足状态（参见补充图S1A和B转录和蛋白质水平）(11). 重要的是，对于瑞士法郎8-可拆卸模型以及GFP公司对照组、全基因组转录组数据和CHD8-结合位点可用（图1安培) (11).

ChIP-seq实验平均获得4000万条窄标记（H3K4me3/me2/me1和H3K27ac）和6000万条宽组蛋白标记（H3C36me3/K27me3）和INPUT样本。经过绘图和过滤，每个样品平均鉴定出42308个峰(补充图S1C、D)，并显示了转录起始位点（TSS:H3K4me3/me2/me1和H3K27ac）、活性转录基因的基因体（H3K36me3）或跨越转录沉默基因单元（H3K27me3）的较大基因组区域的预期富集模式和后基因图谱，以及预期富集与ENCODE公共数据集的相关性(补充图S1E、F) (69,70).

于瑞士法郎8抑制，H3K4me1、H3K27ac和H3K36me3与对照（Sh的交叉-GFP公司和Sh-GFP2公司) (补充图S2A). 然而，观察到了一定程度的复制异质性，尤其是对于H3K4me1和H3K27ac，而H3K36me3表现出更一致和显著的减少(补充图S1D–F和S2A). 重要的是，第三个生物复制体Sh1-瑞士法郎8，效率较低瑞士法郎8转录抑制(补充图S1A) (11)，但CHD8蛋白减少更强(补充图S1B)，确认H3K36me3富集受损(补充图S2A). 此外，Sh2-瑞士法郎8和Sh-GFP公司独立的ChIP-seq数据集（在与之前数据集不同的实验室中生成）再次支持了以下结论：瑞士法郎8抑制与H3K36me3富集度降低有关(补充图S2B).

通过ChromHMM对组蛋白标记富集的联合分析(48)，我们定义了控制hiNPC中具有特定染色质状态的10种基因组区域[1，转录起始（H3K4me3、H3K4me2、H3K4me1和H3K36me3）；2，转录延伸（高H3K365me3），3，弱转录（低H3K360e3）；4，强增强子（H3K4me2、H3Ge1和H3K27ac）；5，弱/平衡增强子a（H3K 4me2和H3K 4me1）；6，弱/平衡增强子b（H3K4me1和H3K27ac）；7，活性启动子（H3K4me3、H3K4me2、H3K4me1和H3K27ac）；8，非活性/平衡启动子（H3K27me3、H3K4me3、H4K4me2和H3K4me1）；9，多梳抑制（H3K27me3）；和10，异染色质/低信号（无富集）]（图1B年，左）。确定受以下因素影响的状态瑞士法郎8敲除后，我们比较了两种情况下的组蛋白标记（每个染色质状态下每个组蛋白标记的峰值计数），即对照组与瑞士法郎8击倒（Sh2-瑞士法郎8和Sh4-瑞士法郎8)（图1B年（右），并检测到转录延伸、强-弱/平衡增强子和活性启动子是受影响最大的染色质状态瑞士法郎8抑制。

为了进一步分析这些结果，我们比较了对照组和对照组中每个组蛋白标记的峰数瑞士法郎8每个染色质状态中的敲除。虽然生物复制之间的差异不支持增强子和启动子状态的统计显著差异(补充图S3A、B)组蛋白H3K36me3修饰的基因组区域与转录延伸有关的峰数在Sh2–Sh4中显著降低瑞士法郎8(P（P）-值<0.05，吨-测试）与对照（图1摄氏度). 在涉及转录延伸的基因组区域内，H3K36me3的减少影响了人类NPC中所有表达的蛋白编码基因的～50%（在TPM>2的蛋白质编码基因中，5447个丢失了H3K365me3，而6451个没有受到影响）。此外，H3K36me3缺失的基因瑞士法郎8与未受影响的基因相比，单倍体不充分性显著延长（90290对60902 bp），并且包含更多外显子（7.36对6.20）（未显示）。使用DiffBind和western blot进行的独立定量分析进一步支持了三个Sh1–Sh2–Sh4中H3K36me3结合区的临界减少瑞士法郎8敲除克隆与对照Sh的比较-GFP公司（图一维-F类). 相反，后基因图谱、效应大小和DiffBind分析报告H3K27ac和H3K4me1标记没有实质性差异(补充图S3C–H). H3K36me3降低的所有基因的合成热图瑞士法郎8抑制与未改变的基因组位置如所示补充图S4.H3K36me3减少的基因瑞士法郎8抑制强烈富集于“受限”基因[对功能丧失突变不耐受，gnomAD(71)]，“大脑中的FMRP目标”(72)、SFARI ASD基因(https://gene.sfari.org/about-gene评分/)“基本基因”[细胞生存所必需的(73)]和“M3共表达模块”(6)其表达在神经系统发育早期达到高峰（图1G个;补充表S1).

瑞士法郎8组蛋白H3 Lys36三甲基化的抑制依赖性减少对CHD8-结合基因的影响

通过将人类CHD8结合位点叠加在先前建立的染色质状态上（图1B年)，我们确认CHD8仅限于活性启动子（90.11%）和较不显著的增强子[强、弱/稳定的a和b（3.18、3.00和1.34%）](补充图S5A) (11). 如前所述(74)，CHD8结合与高组蛋白H3K36me3相关(补充图S5B、E)和H3K4me3(补充图S5C，F)与CHD8-未结合基因相比，后基因图谱丰富，RNA表达水平升高(补充图S5D).

于瑞士法郎8严格定义的抑制（参见材料和方法）CHD8结合基因似乎比CHD8未结合基因更敏感（分别为988和4205），表现出显著降低的H3K36me3富集特征，如效应大小分析所证实的（图2安培,B类;补充图S6A). 值得注意的是，组蛋白H3K36me3的减少由瑞士法郎8抑制是特异性的，因为组蛋白H3K4me3是另一种富含高表达基因TSS的组蛋白修饰(补充图S7A、B)，保持不变(补充图S7C–E).

基于对照hiNPC中CHD8-结合位点富集的聚类分析确定了三个不同的簇：簇#1由1239个CHD8高富集基因组成[mean log2（ChIP/INPUT）=0.27]，簇#2由2429个CHD8中富集到低富集基因组成[mean log 2（ChIP/INPUT）=–0.04]簇#3由1380个基因组成，CHD8富集可忽略不计[平均值log2（ChIP/INPUT）=–0.31]（图2摄氏度D） ●●●●。引人注目的是，集群#1受到CHD8下降的强烈影响，整个基因体中H3K36me3水平显著降低（图第二版;补充图S6B). 相反，集群#2和#3在对照hiNPC中CHD8富集较差，显示出相应的H3K36me3富集较低，在以下情况下没有显著差异瑞士法郎8抑制（图2楼,克;补充图S6C、D). 总之，该分析证实CHD8-结合基因对CHD8减少非常敏感，H3K36me3组蛋白修饰显著而特异性下降（图2摄氏度–D类;补充图S6B). 来自簇#1和簇#2的基因功能富集，即CHD8结合和CHD8抑制后H3K36me3缺失富集，突出显示了与“mRNA处理”和“RNA剪接”相关的GO生物过程术语（图2小时;补充表S1). 还介绍了来自簇#3的基因的功能富集(补充图S8).

诱导组蛋白H3 Lys36三甲基化减少瑞士法郎8抑制改变RNA AS

为了评估以下观察到的H3K36me3减少的功能重要性瑞士法郎8抑制，然后我们利用来自控制和瑞士法郎8-击倒克隆。组蛋白H3K36me3似乎与高水平RNA表达相关(补充图S7A) (75)，我们推断H3K36me3水平的下降与RNA表达水平的降低有关。CHD8水平意外降低，H3K36me3富集受损，这与CHD8-结合基因或CHD8--未结合基因转录的全球差异并不一致(补充图S9A–C).

重要的是，在瑞士法郎8抑制【462个基因，其中176个（38.1%）在启动子或增强子区域具有CHD8-结合位点】呈现出改变的AS图谱，这由两种分析方法证明（图3A级,B类;补充图S9D–F) (74,76). 我们注意到H3K36me3峰值的分布几乎相等瑞士法郎8外显子和内含子区域之间的抑制（数据未显示）。

绝大多数AS改变事件被归类为“替代第一外显子”[994（51.19%）]或“外显子跳跃”[283（15.71%）]（图3厘米;补充图S9F). 对于SUPA检测到差异剪接事件的～1000个基因（图3A级,B类)ΔPSI（ΔPSI=PSI_ctrl–PSI_KD）为正或负的事件比例[937个事件（52.03%）具有正值；864个事件（47.97%）具有负值]保持相当相似。有趣的是，与所有差异剪接外显子（all）相邻的±100 bp序列、CHD8差异剪接和结合（AS-binded）或H3K36me3差异剪接并丢失（AS-K36）的RBP基序匹配显示SRSFs、hnRNPs和ELAVs RNA结合蛋白富集，表明这些因子在观察到的表型中可能起调节作用（图三维). 在以H3K36me3减少并伴随剪接改变为特征的基因中，GO术语和与“蛋白脱乙酰化”、“组蛋白脱乙酰基”和“蛋白脱酰基”相关的通路的过度表达（图第三方，顶部；补充表S1)被观察到，而那些被CHD8结合并呈现改变的剪接模式瑞士法郎8抑制因“mRNA分解代谢”、“翻译起始”和“RNA剪接调控”而增强（图第三方，底部；补充表S1). 直接比较特异性H3K36me3缺失峰和外显子呈现差异剪接事件，发现适度交叉(补充图S9G). 然而，在八个基因组坐标下，可以观察到H3K36me3和AS的同时减少，ΔPSI>0.30。具体来说，在其1位点，Intersectin 1基因参与内吞膜交通和突触传递(77,78)复杂的学习和记忆形成(79)也曾与精神分裂症有关(80)，证实了H3K36me3富集的明显减少，以及呈现敲低水平的hNPC中剪接变异体的PSI比率（剪接入/剪接入+剪接出）的相应增加瑞士法郎8（图第三层–我).

异常的AS表型也反映在先前公布的小鼠数据集中(14,62). 明确地，第8章P5皮质区的基因消融(补充图S10A、C、D、F)和小鼠NPC（mNPC；补充图10B、C、E、F)引发AS模式改变，这种改变在数量上和AS亚型分布上与iPS-衍生NPC中描述的变化非常相似。对于P5皮质样本，检测到950（59.90%）个“替代第一外显子”和191（12.04%）个“外显子跳跃”事件。类似的值。即，在mNPC中观察到840（52.01%）个“替代第一外显子”和240（14.86%）个（外显子跳跃）。ΔPSI阳性或阴性的事件分布也保持相似（P5皮质标本中ΔPSI51.01%为阳性，48.99%为阴性，mNPC标本中△PSI阳性49.10%为阴性，50.90%为阴性）(补充图S10A、B)从而支持了以下假设瑞士法郎8/第8章抑制通常与AS缺陷相关，而与所考虑的物种无关。有趣的是，尽管在每个神经元模型系统中呈现剪接改变的基因通常不同（GO术语/通路在补充图S10G–I)尽管如此，一些测试的十字路口仍存在明显重叠（费希尔测试，补充图S10C–F)，暗示了一组核心基因，其中一半与CHD8结合（即。ITSN1号机组,CNOT2公司和MDM2型)参与“神经元分化”、“细胞周期”和“DNA修复”，对剪接改变非常敏感。

hnRNPL作为一种新的CHD8相互作用体：桥接可变剪接与H3K36me3富集

为了阐明观察到的AS表型并揭示CHD8如何控制H3K36me3在基因体的富集，我们使用hNPC核富集部分上的两个独立的免疫沉淀有效抗体（#17-N-和#18-C-末端，参见材料和方法）通过MS/MS分析表征CHD8相互作用组（图4A级,B类;补充图S11A). MS使用两种不同的抗体，并对三个独立的生物复制品获得的肽进行平均，得到了一份新的和以前报告过的[CHD7、组蛋白H1和POLR2(81–84)]CHD8交互器（图4摄氏度,D类;补充图S11B、C;补充表S1). CHD8#17抗体产生了更多的免疫沉淀和测序肽(n个=99），与CHD8#18相比(n个 = 26). 将三个独立的生物复制和两个抗体（抗体#17A、B、C；抗体#18A、B和C）的统计显著结果结合起来，列出了18个严格定义的蛋白质相互作用物（图4D（四维）,E类)已获得。这些蛋白质在与“RNA结合”、“mRNA加工”和“mRNA剪接体剪接”相关的术语中得到了高度富集(补充图S11D). 具体而言，在18个严格定义的新CHD8-相互作用候选基因中，有5个属于hnRNP-RBP家族，该家族已经通过对所有差异剪接外显子附近的±100 bp序列的模体分析预见到（图三维)，积极调节AS、mRNA稳定以及转录和翻译过程(85)（图4摄氏度–E类). 重要的是，对小鼠胚胎干细胞（mESCs）的独立Chd8 MS分析确定了一种类似的相互作用蛋白模式，GO术语和KEGG（京都基因和基因组百科全书）通路与“剪接体”和“mRNA处理”相关，在两个实验模型之间冗余富集(补充图S11E，F). 在CHD8-相互作用蛋白中，在hNPC和mESCs中测序的hnRNPL在独立的联合免疫沉淀实验中被证实是直接的CHD8相互作用物，对DNase和EtBr处理不敏感（图4楼,克;补充图S11G). 然而，RNase A处理部分影响了CHD8和hnRNPL之间的结合（图4G网络;补充图S11H)从而表明RNA分子可能在这种相互作用的结合或功能稳定中发挥作用。尽管hnRNPL与H3K36甲基转移酶活性没有直接关联，但之前被描述为SETD2相互作用物和调节物(40). 事实上，先前报道的SETD2和hnRNPL之间的结合在我们的hNPC模型中也得到了证实（图4小时)，提示CHD8通过hnRNPL在调节SETD2依赖型H3K36me3中发挥了新的间接作用，将AS变化与染色质调节联系起来。HnRNPL在剪接调控中起直接作用(86)与富含CA的RNA元素结合(87)并抑制隐秘外显子内含(88). 因此，我们询问hnRNPL抑制是否与反映CHD8抑制的功能失调剪接事件相关。为了全面了解hiNPC中hnRNPL依赖性AS事件，我们通过电穿孔控制或hnRNPL公司-将siRNAs[单一寡核苷酸（A、B或C）]靶向我们的细胞。测试siRNA效率的初步实验显示hnRNPL公司电穿孔后72小时使用200 pM si-C进行抑制(补充图S12A、B). 两者都有hnRNPL公司与对照组相比，RNA和蛋白质显著减少了～60%（图5A级–C类). 因此，我们随后对聚腺苷化转录组进行配对测序，对每个处理进行四次生物复制（见材料和方法）。RNA-seq分析证实了样本的正确聚类（主成分分析；补充图S12C)以及hnRNPL公司其他hnRNP的转录本未被治疗改变(补充图S12D). AS分析[相同的工具（SUPPA）和相同的参数(P（P）-数值<0.05）之前使用的]RNA-seq数据hnRNPL公司人类hiNPC的敲除揭示了473个AS事件，影响了287个独特的基因，部分与以下描述的重叠瑞士法郎8抑制。具体而言，47.7%的基因受到以下至少一种异常AS事件的影响hnRNPL公司抑制与AS改变重叠瑞士法郎8击倒（图第五天). 值得注意的是，再次发现AF是CHD8抑制影响最大的AS亚型，是hnRNPL减少后最常见的异常AS事件类型（图第五版)而与“核转录mRNA”和“RNA分解代谢过程”相关的通路和GO术语在两种基因中均反复丰富，受功能失调剪接影响的基因列表瑞士法郎8和hnRNPL公司抑制数据（图5楼). 最后，尽管基因重叠的百分比减少了（20%）hnRNPL公司在不相关的细胞模型系统（HepG2和K562细胞，ENCODE；参见材料和方法）中的敲除仍然与下述剪接缺陷相关瑞士法郎8抑制(补充图S12E).

讨论

中断瑞士法郎8从从头开始蛋白质截短和结构变异已被公认为ASD的高度渗透性风险因素(三,4,7,76). CHD8最初被描述为与β-catenin相互作用，作为WNT信号的负调控因子(83,89–91)在神经系统发育过程中起着重要作用(14,83). CHD8在H3K27ac和H3K4me3富集区的约7000个基因组位置直接结合DNA，这些区域富含高转录活性的启动子和增强子(11,16). 然而，观察到的直接和间接转录效应如下瑞士法郎8抑制，其在ASD中的分子作用模式尚不清楚(11). CHD8招募组蛋白KMT2/MLL甲基转移酶复合物(18,92)，而与核心PRC2甲基转移酶Ezh2的串扰(12)，无法排除。然而，由于CHD8与延长RNAPII相关，需要考虑其在转录延长中的作用，特别是对于组蛋白H3K36me3密集修饰的高表达基因(84).

在我们的与ASD相关的人类神经元祖细胞模型系统中，我们观察到瑞士法郎8抑制与H3K36me3组蛋白修饰中的耗竭而非增益显著相关。虽然不能完全排除增强子和启动子的作用，但严格的统计标准将重点放在最强和最可靠的表观遗传变化上，支持H3K36me3的急剧耗竭，这是一种通过独立定量方法验证的表型。组蛋白标记减少的基因富含“受限”基因[对功能丧失突变不耐受，gnomAD(71)]，“大脑中的FMRP目标”(72)、SFARI ASD基因(https://gene.sfari.org/about-gene-scoring网站/)，“基本基因”(73)以及在神经系统发育早期（M2、M3，受孕后10-12周）表达高峰的基因(6). 因此，CHD8可以促进甲基转移酶活性（SETD2/SETD5）导致H3K36三甲基化或作为KDM2B的抑制剂(93). H3K36甲基化的调节与神经元发育和分化过程中的细胞周期调节有关。事实上设置D2Sotos综合征是一种伴有巨头畸形的儿童过度生长状态(94)在ASD先证者中，也表现为巨头(5,95)，而破坏性突变设置5-一种新描述的H3K36me3甲基转移酶(96)-与ID/ASD关联(1,76–79) (97)和3p25.3微缺失综合征(98). 因此，有可能瑞士法郎8通过其调节H3K36me3水平的能力，抑制可能导致动物模型和瑞士法郎8-自闭症患者(9,14).

CHD8如何调节H3K36me3？根据RNA-seq数据，瑞士法郎8抑制与SETD2/SETD5水平的直接降低或H3K36me3 KDM2B甲基转移酶的上调无关（未显示）。然而，CHD8与它们的启动子/增强子结合的基因在H3K36me3中表现出明显的缺失，因此表明色域和H3K36三甲基化酶之间可能存在直接的相互作用。的确，设置D2和瑞士法郎8在人脑发育过程中显示类似的时间表达模式（数据来自BrainSpan Atlas）(9).

H3K36的三甲基化界定了活性转录基因的身体区域，为调节转录保真度、mRNA剪接和DNA损伤修复提供信号(75). 我们数据中异常的H3K36me3减少并不是转录差异的直接原因，这与之前的发现一致(99). 相反，H3K36me3的减少与AS的改变相关。以前曾报道过H3K365me3与AS的相关性(100,101). 本研究中检测到的拼接差异是瑞士法郎8抑制反应反映在不同的数据集中，甚至在ASD[P5皮质和mNPC的小鼠模型中(14,62)]. 在所有情况下，在神经系统发育过程中或在神经元承诺的祖细胞中都会发现剪接改变(14,62)，跳过事件和可选的5′，SE-AF，事件类型是最敏感的，因此支持先前发现的神经元剪接缺陷第8章单倍不足(36). 然而，虽然H3K36me3富集度降低的基因中有很大一部分呈现出改变的剪接模式，但其他大量异常剪接基因并不呈现H3K365me3降低，而是CHD8的结合位点。该观察结果支持H3K36me3、CHD8和剪接调控之间的功能联系，同时也表明H3K365me3对CHD8在AS调控中的间接作用（图5克). 此外，与异常剪接事件相邻的RNA序列的模体分析预测了SRSF、hnRNP和ELAV RBP家族的相关贡献，这些家族是AS公认的调节因子，因此提示CHD8可以通过一种模式运作。有趣的是，与“RNA剪接”和“mRNA加工”相关的基因属于与CHD8结合并显示异常AS的基因。这一目前被忽视的分子机制值得进一步研究，尤其是在神经发育综合征和ASD中。

为了填补这一空白，我们在hNPC中采用了MS/MS分析。在先前识别的CHD8交互器的冗余池旁边(81–84)，我们的分析揭示了一组重要的核蛋白直接参与“RNA结合”、“RNA加工”和“剪接体”调控。具体来说，许多hnRNP(85)通过对异常剪接事件相邻序列的RNA模体分析已经预见到，分别用两种N端和C端CHD8抗体以及mESCs进行了独立鉴定（图4D（四维）,E类). 有趣的是，最近的人类遗传学研究将hnRNP确定为神经发育条件中的候选基因，这强烈暗示着该基因家族在大脑发育改变中的破坏(102). 其中，hnRNPL优先绑定到富含CA的元素(103)和诱导性外显子跳跃的调节器(104)，已优先进行验证。CHD8可能通过N末端结构域与hnRNPL强烈相互作用，这由使用CHD8 C末端抗体获得的更有效下拉来判断，而DNase和EtBr处理没有影响（图4楼,克). 然而，由于RNase A处理对这种结合的影响，RNA对CHD8/hnRNPL结合的稳定作用可能被提出（图5克). 事实上，之前有报道称hnRNPL以RNA依赖的方式与染色质和增强子结合(105). 因此，CHD8/hnRNPL协会可能也会招募中介复合体(106)，可能稳定增强子/启动子的环，从而支持转录启动。事实上，hnRNPL与Med23相关(107)而CHD家族（CHD1）的其他成员此前曾被报道与MED1/23/6相互作用并协调起始前复合物（PIC）组装（图5克).

HnRNPL也曾被报道为人类KMT3a/Set2复合物的一个亚单位，协助H3K36三甲基化体内(40). 这种相互作用通过SETD2–hnRNP相互作用域发生，其缺失导致H3K36me3沉积减少(39). 事实上，hnRNPL在我们的hNPC中也与SETD2强烈相互作用（图4小时). 重要的是，siRNA-介导hnRNPL公司ASD相关模型系统中的瞬态减少部分反映了以下观察到的功能障碍AS（47.7%）瑞士法郎8抑制。这些观察结果强化了CHD8驱动的H3K36me3依赖性AS调节至少部分归因于hnRNPL–CHD8关联的假设。然而，通过比较CHD8和SETD2 MS实验[我们的数据和(39)]出现了许多其他hnRNP相互作用体，从而在SETD2、hnRNP和CHD8之间提供了额外的功能链接，并将延伸RNAPII进行探索和表征。

总之，由于hnRNPL-以及其他hnRNPs作为新的CHD8相互作用体的鉴定，我们在这里揭示了CHD8的一个新功能，并可能扩展到CHD家族的其他成员，即染色质、转录和剪接机制调节之间的相互作用。因此，分析延伸偶联的H3K36甲基化功能障碍对转录保真度、RNA剪接和DNA损伤修复的影响(75)这将是理解神经发育障碍尤其是自闭症中染色质相关改变的下一个挑战。

数据可用性

作者向地球观测组织提交了所有数据集，登录号为GSE148057。MS蛋白质组学数据已通过PRIDE保存在ProteomeXchange Consortium中(108)数据集标识符为PXD025739的合作伙伴存储库。

补充数据

补充数据可从NAR Online获取。

致谢

我们感谢Biagioli、Ferrari和Talkowski实验室成员的有益讨论，感谢Chiacchiera博士（特伦托大学CIBIO系）对手稿的批判性阅读。我们感谢CIBIO NGS设施的De Sanctis博士和Bertorelli博士对ChIP-seq文库的制备和测序提供的支持，感谢CIBIO-MS和蛋白质组学设施的Belli博士和Peroni博士对MS实验的帮助，以及CIBIO Cell Technology设施的Cardano和Cutarelli博士，帮助hiNPC培养和电穿孔。我们感谢意大利理工学院（意大利热那瓦IIT）基因组学设施的Vozzi博士为RNA-seq的制备和测序提供的帮助。我们感谢Stephen Haggarty博士（马萨诸塞州总医院和哈佛医学院，美国马萨诸塞州立大学波士顿分校）分享人类神经祖细胞系。M.A.B.感谢Danny Reinberg主持他休假，期间在mESCs上进行了CHD8 MS。

基金

这项工作得到了CIBIO部门对M.B.和S.P.的机构资助，自闭症演讲者和西蒙斯基金会对J.F.G.的自闭症研究倡议的资助，以及国家卫生研究院GM061354和NS093200对J.F.G和M.E.T.E.S.的资助，得到了SEMM结构化国际博士后计划（SIPOD）的支持和AFM-TELETHON奖学金，编号21835。

利益冲突声明。未声明。

参考文献

作者笔记