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如果希望引物位于特定位置，请输入位置范围。位置是指模板正链上的基数（即，对于给定的底漆，“起始”位置应始终小于“结束”位置）。允许部分范围。例如，如果您希望PCR产物位于模板上的位置100和位置1000之间，可以将正向引物“From”设置为100，将反向引物“to”设置为1000（但将正向引子“to“和反向引物”From“留空）。注意，正向底漆的位置范围可能与反向底漆的位置不重叠。
可以选择输入预先设计的正向底漆。始终使用实际的底漆序列（即模板正链上的5'->3'）。请仅输入引物序列（不允许任何其他字符）。
可选择输入预先设计的反向底漆。始终使用实际的引物序列（即模板负链上的5'->3'）。请仅输入引物序列（不允许任何其他字符）。
Tm计算由热力学参数表和盐校正公式（高级参数下）控制。热力学参数默认表为“SantaLucia 1998”，根据primer3程序的建议，默认盐校正公式为“Santa Lucia 1998”。
这控制了引物是否应该跨越mRNA模板上的外显子连接。选项“Primer must span an exon-exon junction”（引物必须跨越外显子连接）将指示程序返回至少一个横跨外显子-外显子结合的引物（在给定的引物对内）。这有助于将扩增仅限于mRNA。如果你想扩增mRNA以及相应的基因组DNA，也可以排除此类引物。
必须退火到接合处5'或3'侧外显子的最小和最大碱基数 帮助
这规定了引物必须退火到外显子-外显子连接处5'侧（即朝向引物起点）或3'侧（也就是朝向引物终点）模板上的最小碱基数。退火到两个外显子是必要的，因为这可以确保退火到外显子-外显子连接区，而不仅仅是外显子。请注意，只有在为“外显子连接跨度”选项选择“引物必须跨越外显子-外显子接合”时，此选项才有效。
启用此选项后，程序将尝试使用NCBI中的mRNA-基因组DNA比对，在相应的基因组DNA上找到由至少一个内含子分隔的引物对。这使得很容易区分来自mRNA和基因组DNA的扩增，因为后者的产物因内含子的存在而更长。
这指定了将正向和反向引物分开的相应基因组DNA上的总内含子长度范围。
启用此选项后，程序将根据所选数据库搜索引物，并根据引物对与目标的匹配及其方向，确定引物对是否可以在数据库中的任何目标上生成PCR产物。如果可能的话，程序将只返回在非预期序列上没有生成有效PCR产物的引物对，因此是特定于预期模板的。注意，不仅要检查正向-反向引物对的特异性，还要检查正向和反向引物组的特异性。
Primer-blast试图通过将候选引物放在与其他靶点不相似的独特模板区域来寻找靶点特异性引物。然而，在某些情况下，引物爆破无法确定数据库序列是否是预期目标，因此用户指南可能会有所帮助（例如，当您的模板是多态形式或搜索数据库中条目的部分区域时，或者当数据库（如nr）包含模板的冗余条目时）。只有当程序没有找到足够的唯一模板区域时，“自动”选项才会要求用户指导，而如果您的模板与任何其他数据库序列显示出高度相似性，“用户指导”选项将始终要求用户指导。
如果您不关心这些，则可以选择将所选数据库中的序列从特异性检查中排除。在Refseq mRNA、Refseq RNA和nr数据库中有大量预测的Refseq转录物。nr数据库中还有许多未培养/环境样本序列。
输入生物体名称（或生物体组名称，如肠杆菌科、啮齿动物）、分类id或在键入时从建议列表中选择。 帮助
这将限制对特定生物体的引物特异性检查。强烈建议您在扩增特定有机体的DNA时始终指定有机体（因为搜索所有有机体的速度要慢得多，而从其他有机体启动的目标不相关）。如果要限制为多个有机体，请单击“添加更多有机体”标签（在每个输入框中只输入一个有机体）。
您可以使用常规entrez查询来限制数据库对引物特异性的搜索。例如，输入GenBank登录号以将搜索限制为仅限于该特定序列（注意：这意味着不会根据指定序列以外的任何其他序列检查引物特异性）。
这需要至少一个引物（对于给定的引物对）与非预期目标具有指定数量的不匹配。引物和非预期目标之间的不匹配（尤其是接近3'端的不匹配）越大，引物对对模板的特异性就越高（即，退火到非预期目标将更加困难）。然而，指定更大的失配值可能会使找到这种特异性引物更加困难。在这种情况下，尝试降低不匹配值。
这是另一个可用于调整引物特异性严格程度的参数。如果目标与至少一个引物（对于给定的引物对）之间的不匹配总数等于或大于指定的数量（无论不匹配的位置如何），则在进行引物特异性检查时将忽略任何此类目标。例如，如果您只对与引物完全匹配的目标感兴趣，可以将该值设置为1。在这种情况下，您还可以降低E值（请参阅高级参数）以加快搜索速度，因为检测与引物不匹配的目标时，不需要较高的默认E值。此外，该程序具有与引物差异太大的极限检测目标。。。它将检测到与引物序列有高达35%不匹配的靶点（即，20个mer共有7个不匹配）。如果要检测不匹配数量高于默认值的目标，可能需要选择更敏感的爆炸参数（在高级参数下）。
这规定了要通过引物BLAST检测的PCR靶标的最大扩增子大小。一般来说，如果非特异性靶标的大小非常大，则不那么令人担忧，因为PCR对较大的扩增子的效率要低得多。
如果启用，该程序将不会排除引物对，这些引物对可以从与PCR模板相同的基因中扩增一个或多个mRNA剪接变体，从而使引物具有基因特异性而非转录特异性（请注意，它并不是要生成能够扩增所有变体的引物。这只是意味着引物除了可以扩增您指定的一个片段变体外，还可以扩增一个或多个其他片段变体）。启用此选项将更容易找到基因特异性引物，因为无需区分剪接变体。此选项要求您输入refseq mRNA加入或gi或fasta序列作为PCR模板输入，因为其他类型的输入可能不允许程序正确解释结果。
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数据库序列的最大数量（具有唯一的序列标识符）对primer-Blast进行查找，以筛选引物对的特异性。请注意，实际相似区域数（或点击数）可能远大于此值（例如，单个目标序列（如染色体）上可能有大量点击）。如果需要执行更严格的搜索，请选择更高的值。
随机模型中的预期机会匹配数。如果需要更严格的特异性检查（即识别与引物有更多不匹配的目标，以及完全匹配的目标），则应使用更高的E值。另一方面，如果您只对完美或接近完美的匹配感兴趣，建议使用较低的E值，因为这将大大缩短搜索时间。
BLAST检测目标所需的查询序列和目标序列之间的最小相邻核苷酸碱基匹配数。如果需要查找与引物不匹配的目标序列，请设置较低的值。然而，这将增加搜索时间。
为了找到特定引物对而要筛选的候选引物对的最大数量（候选引物由primer3程序生成）。增加这个数量可以增加找到特定引物对的机会，但这一过程需要更长的时间。
设计新引物时显示的PCR目标（扩增子）的最大数量。
检查预先设计的引物的特异性时显示的PCR目标（扩增子）的最大数量。
在搜索数据库中任何单个序列上找到的PCR目标（扩增子）的最大数量。
左右引物3'端的连续Gs和Cs数。
单核苷酸重复的最大允许长度，例如AAAAAA。
左引物或右引物最后五个3'碱基的最大稳定性。更大的数字意味着更稳定的3'端。
左或右引物最后五个3'碱基中允许的最大Gs或Cs数。
选项“使用热力学寡核苷酸对齐”指示Primer3使用热力学对齐模型（而不是旧的传统二级结构对齐）来计算寡核苷酸形成发夹和二聚体的倾向，而选项“使用热力模板对齐”指示Primer3使用热力学对齐模型（而不是旧的传统二级结构对齐）来计算寡聚物退火到模板序列中不需要的位置的倾向。
例如，401,7 68,3禁止在7个碱基中选择引物，从401开始，3个碱基在68开始。或用<和>标记源序列：例如。。。ATCT＜CCCC＞TCAT。。。禁止在中央CCCC中使用引物。
输入以空格分隔的核苷酸位置列表。这要求左侧或右侧的引物跨越任何此类位置中只有3'的接合处。例如，输入“50 100”意味着左侧或右侧引物必须跨越核苷酸位置50和51之间的连接或位置100和101之间的连接（从5'到3'计数）。您还可以在下面的字段中指定左侧或右侧引物必须位于连接两侧的最小核苷酸数。如果希望为模板上的跨度特定连接添加底漆，则此选项很有用。请注意，此选项不能与上面的“外显子/内含子选择”选项结合使用。
连接处5'或3'侧左侧或右侧引物必须具有的最小核苷酸数
PCR中盐（通常为KCl）的摩尔浓度。Primer3使用此参数计算寡聚物熔化温度。
二价盐阳离子（PCR中通常为MgCl2+）的摩尔浓度。Primer3使用本文建议的公式将二价阳离子的浓度转换为单价阳离子的浓度Ahsen等人，2001年. [一价阳离子]=[一价离子]+120*（v（[二价阳离子]-[dNTP]））。根据公式，脱氧核苷酸三磷酸的浓度[dNTP]必须小于二价阳离子的浓度。由于某些镁受dNTP的约束，因此dNTP浓度包含在公式中。获得的单价阳离子浓度用于计算寡聚物/底漆熔化温度。请参阅dNTPs浓度以指定dNTP的浓度。
脱氧核糖核苷酸三磷酸的摩尔浓度。只有在指定了二价阳离子浓度时才考虑此参数。
用于指定熔融温度计算的盐校正公式的选项。有三种不同的选项可用：1Schildkraut和Lifson 1965，DOI:10.1002/bip.360030207（在Primer3的1.0.1版本之前一直使用）。的默认值Primer3 1.1.0版本（用于向后兼容性）2圣卢西亚1998，DOI:10.1073/pnas.95.4.1460这是推荐价值。三。Owczarzy等人，2004，DOI:10.1021/bi034621r
最近邻热力学参数表和熔化温度计算方法的选项。有两个不同的热力学参数表：Breslauer等人，1986年，DOI:10.1073/pnas.83.11.3746在这种情况下，熔炼温度计算公式由Rychlik等人，1990年使用。圣卢西亚，1998年，DOI:10.1073/pnas.95.4.1460这是推荐价值。
PCR中退火寡聚物的纳米摩尔浓度。注意，这不是反应混合物中寡聚物的浓度，而是退火到模板的寡聚体的浓度。Primer3使用此参数计算寡聚物熔化温度。默认值（50nM）与怀特黑德/麻省理工学院基因组研究中心使用的标准方案很好地配合——在20微升的反应中，每个引物寡聚物用0.5微升20微摩尔浓度，10毫微克模板，0.025单位/微升Taq聚合酶，每个dNTP中0.1 mM，1.5mM MgCl2，50mM KCl，10mM Tris-HCL（pH 9.3）使用35次循环，退火温度为56摄氏度。该参数对应于Rychlik、Spencer和Rhoads等式（ii）（核酸研究，第18卷，第21页）中的“c”，其中“经验确定”合适的值（对于较低的模板初始浓度）。该参数的值小于反应中寡核苷酸的实际浓度，因为它是退火寡核苷酸的浓度，而退火寡核苷酸又取决于给定循环中模板（包括PCR产物）的数量。在PCR过程中，这种浓度大大增加；幸运的是，PCR对于各种寡聚物熔化温度似乎相当稳健。
启用此选项后，程序将自动检索模板中包含的SNP信息（需要使用GenBank登录或GI作为模板），并避免选择SNP区域内的引物。
如果选择了默认的“自动”设置，程序将使用以下规则自动选择重复数据库。1.如果用户在“有机体”字段中指定的同一有机体中有重复数据库（见上文），则将使用该重复数据库。例如，如果指定了“Human”，则将选择Human repeat数据库。2.如果来自同一有机体的重复数据库不可用，则将选择分类树中该有机体最亲本的数据库。例如，如果在“有机体”字段中指定了“鼠标”，则会选择啮齿动物重复数据库。然而，如果指定了“五倍子”，则不会选择重复数据库，因为来自其分类亲本的重复数据库不可用。
低复杂度区域是DNA序列中一些碱基组成有偏差的区域，例如一段ACACACACAACACACA。
此选项启用了我们的新图形视图，它为您的模板和引物提供了更多详细信息。它将在未来取代当前的图形视图。
