Bax interacts with the permeability transition pore to induce permeability transition and cytochrome c release in isolated mitochondria

doi:10.1073/pnas.95.25.14681

.1998年12月8日；95(25):14681-6.

doi:10.1073/pnas.95.25.14681。

Bax与通透性转换孔相互作用诱导线粒体通透性转变和细胞色素c释放

M成田¹, 清水县S, T伊藤, T奇滕登, R J卢茨, H松田, Y津本

附属公司

PMID： 9843949
预防性维修识别码： PMC24509型
内政部： 10.1073/pnas.95.25.14681

Bax与通透性转换孔相互作用诱导线粒体通透性转变和细胞色素c释放

M成田等。美国国家科学院程序. 1998.

.1998年12月8日；95(25):14681-6.

doi:10.1073/pnas.95.25.14681。

作者

M成田¹, 清水县S, T伊藤, T奇滕登, R J卢茨, H松田, Y津本

附属

¹大阪大学医学院生物医学研究中心医学遗传学系，日本大阪住田山道冈2-2号，邮编：565-0871。

PMID： 9843949
预防性维修识别码： PMC24509型
内政部： 10.1073/pnas.95.25.14681

摘要

细胞色素c的释放和线粒体通透性转换（PT），包括跨膜电位的丧失（Deltapsi），在细胞凋亡中起着重要作用。使用分离的线粒体，我们发现重组Bax和Bak（Bcl-2家族的促凋亡成员）诱导线粒体Deltapsi丢失、肿胀和细胞色素c释放。所有这些变化都依赖于Ca2+，并被环孢菌素A（CsA）和旺克雷酸阻止，这两种物质都封闭了PT孔（巨通道），表明Bax-和Bak诱导的线粒体变化是通过这些孔的开放介导的。重组Bcl-xL和转基因衍生Bcl-2（Bcl-2家族的抗凋亡成员）以及寡霉素抑制了Bax诱导的线粒体变化，表明F0F1-ATPase可能对Bax诱导线粒体变化有调节作用。促凋亡的Bax-和Bak-BH3（Bcl-2同源）肽，但不是突变的BH3肽，也不是缺乏BH3的突变的Bak，诱导了线粒体的变化，表明BH3区域的重要作用。一项共免疫沉淀研究表明，Bax和Bak与电压依赖性阴离子通道相互作用，而电压依赖性阴离子通道是PT孔的一个组成部分。总之，这些发现表明，包括Bax和Bak在内的促凋亡Bcl-2家族蛋白通过与PT孔相互作用诱导线粒体PT和细胞色素c的释放。

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数字

图1
分离线粒体中rBakΔC和rBax诱导的Δψ损失(A类和B类)Δψ由rBakΔC引起的损失。将分离的线粒体（1 mg/ml）与100μg/ml孵育(A类)或指示浓度(B类)rBakΔC和Δψ的比值是通过在20分钟内使用Rh123摄取量测量的(A类)或20分钟时(B类). (C类)将rBakΔC摄入线粒体。在与B类对线粒体（30μg）进行离心、洗涤，并使用抗Bak抗体进行Western blot分析。100μg/ml中rBakΔC蛋白的总量表示为总量。(D类)Δψ损失由rBax引起。将分离的线粒体（1 mg/ml）与100μg/ml rBax孵育，并使用Rh123摄取测定20分钟后的Δψ。

图2
通过rBax和rBakΔC诱导PT。(A类)CsA预防rBax诱导的线粒体肿胀。将分离的线粒体（0.1 mg/ml）与rBax（10μg/ml）或同等浓度的模拟蛋白在100 nM有无CsA的条件下孵育，并按照*材料和方法*. (B类和C类)CsA或Ca预防rBax诱导的mAST释放²⁺螯合作用。将线粒体（1 mg/ml）与rBax（100μg/ml）或同等浓度的模拟蛋白在100 nM的CsA存在或不存在的情况下孵育(B类)或在指示浓度下(C类). Ca后，线粒体也与rBax（100μg/ml）孵育²⁺螯合作用B类在20分钟内测量.mAST活性(B类)或20分钟时(C类)如中所述*材料和方法*.•，rBax；○, 模拟蛋白；■; rBax+CsA（100 nM）；□, 含Ca的rBax²⁺螯合作用。(D类)CsA或Ca对rBax诱导的Δψ损失的预防作用²⁺螯合作用。线粒体（1 mg/ml）与rBax（100μg/ml）或同等浓度的模拟蛋白在有或无CsA的情况下以指定浓度孵育。Ca后，线粒体也与rBax（100μg/ml）孵育²⁺螯合作用。Δψ是在20分钟时使用Rh123测量的(E类)BK和BK抑制rBakΔC诱导的Δψ损失我-肉碱。在存在或不存在10 mM BK或5 mM的情况下，用rBakΔC（100μg/ml）培养线粒体（1 mg/ml）我-肉碱。Δψ是在20分钟时使用Rh123测量的。

图3
rBakΔC诱导PT中BH3域的要求(A类)rBakΔGDΔC缺乏Δψ损耗感应。将线粒体（1 mg/ml）与100μg/ml的rBakΔC、rBak△GDΔC或模拟蛋白孵育，并使用Rh123在20分钟时测量Δψ(B类)BH3肽诱导Δψ损失。在存在以下肽（10μM）的情况下孵育线粒体（1 mg/ml），并在20分钟时使用Rh123:Bak（氨基酸残基73-87）、突变BakL78A（氨基酸残基73-77）和Bax（氨基酸残端55-74）测量Δψ。

图4
Bax和Bak与VDAC的相互作用。(A类和B类)线粒体中rBax与VDAC的相互作用。线粒体（1 mg/ml）与rBax（100μg/ml）孵育。诱导PT后，离心线粒体并洗涤两次。用抗人Bax抗体（αBax）或正常兔IgG（NRI）对线粒体裂解物进行免疫沉淀（IP）A类和抗人VDAC抗体（αVDAC）或正常小鼠IgG（NMI）B类使用抗人VDAC抗体通过Western blotting分析免疫复合物(A类)和抗Xpress抗体(B类). 一份线粒体（mit）A类和rBaxB类作为对照。(C类)哺乳动物细胞中Bax或Bak与VDAC的相互作用。Cos7细胞与pUC-CAGGS-小鼠共转染*bax（巴克斯）*或pUC-CAGGS-human烘烤和pUC-CAGGS-人类*vdac1型*，并用DTBP处理，如中所述*材料和方法*用抗Bax（αBax）或抗Bak（αBak）多克隆抗体和正常兔IgG（NRI）免疫沉淀细胞裂解物。然后用抗人VDAC抗体进行免疫复合物的免疫印迹分析。

图5
细胞色素的诱导*c（c）*通过rBax和rBakΔC释放。线粒体（1 mg/ml）与100μg/ml rBax孵育(A类)，100μg/ml rBakΔC(B类)或10μM BH3肽(C类). 模拟蛋白用作对照A类和B类20分钟时，离心样品，并对等分（20μl）上清液进行细胞色素的Western blot分析*c（c）*（同期。*c（c）*). “Total”表示等分的线粒体。

图6
抑制rBax和rBakΔC诱导的细胞色素*c（c）*通过抑制PT释放(A类)rBax诱导细胞色素的预防*c（c）*CsA发布。线粒体（1 mg/ml）与rBax（100μg/ml）在CsA存在下以指定浓度孵育。在20分钟时，离心样品，并使用抗细胞色素进行蛋白质印迹分析等分（20μl）上清液*c（c）*抗体。(B类和C类)rBax和BH3肽诱导的细胞色素的预防*c（c）*通过消耗钙释放²⁺线粒体与100μg/mg的rBax、模拟蛋白或源自Bak或Bax（10μM）的BH3肽在Ca下孵育²⁺-耗尽条件。20分钟后，按照A类细胞色素的数量*c（c）*（同期。*c（c）*)释放物通过Western blotting分析。

图7
不需要细胞色素*c（c）*rBax引起的Δψ损失的释放。(A类)细胞色素*c（c）*线粒体耗竭。细胞色素*c（c）*用低渗缓冲液洗涤线粒体，如*材料和方法*完整的线粒体（完整）和细胞色素*c（c）*-线粒体耗竭（cyt。*c（c）*-（每个30μg）进行细胞色素分析*c（c）*（同期。*c（c）*)通过Western blotting。(B类)rBax诱导的细胞色素Δψ损失*c（c）*-外源细胞色素耗尽线粒体*c（c）*.细胞色素*c（c）*-耗尽的线粒体（1 mg/ml）与rBax（50μg/ml）或模拟蛋白在外源细胞色素存在下孵育*c（c）*（1 mM），使用Rh123测量Δψ。

图8
rBax诱导的Δψ损失和细胞色素的预防*c（c）*rBcl-x发布_L（左）、转基因Bcl-2和寡霉素。(A类)用rBcl-x防止rBax引起的Δψ损失_L（左）和寡霉素。在有或无rBcl-x的情况下，用模拟蛋白或rBax以50μg/ml的浓度孵育线粒体（1 mg/ml）_L（左）（wt）及其突变体（mt1和mt7）（20μg/ml）或寡霉素（10μM），以及使用Rh123在20分钟时测量Δψ(B类)rBcl-x防止rBakΔC引起的Δψ损失_L（左）在有或无rBcl-x的情况下，用rBakΔC（100μg/ml）培养线粒体（1 mg/ml）_L（左）（20μg/ml），并在30分钟时使用Rh123测量Δψ(C类)rBax诱导细胞色素的预防*c（c）*rBcl-x发布_L（左）和寡霉素。在Bcl-x存在或不存在的情况下，用rBax（50μg/ml）培养线粒体（1 mg/ml）_L（左）（wt）及其突变体（mt 1和mt 7）（20μg/ml）、CsA（100 nM）或寡霉素（10μM）。12分钟后，对样品进行离心，并对等分上清液（每个20μl）进行细胞色素的Western blot分析*c（c）*（同期。*c（c）*). (D类)转基因Bcl-2预防rBax诱导的Δψ损失。从肝bcl-2转基因小鼠（bcl-2）和非转基因同窝小鼠（非Tg）的肝脏中分离出线粒体。将线粒体（1 mg/ml）与模拟蛋白或rBax以50μg/ml孵育，并在30 min时测量Δψ。

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