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.1998年5月；112(2):205-15.
doi:10.1046/j.1365-2249.1998.00557.x。

结肠巨噬细胞的分离及其表型特征

G罗格勒 1, M豪斯曼, D Vogl公司, E Aschenbrenner公司, T Andus公司, W福克, R安德烈森, J Schölmerich公司, V总
附属公司

结肠巨噬细胞的分离及其表型特征

G罗格勒等。 临床实验免疫学. 1998年5月.

摘要

巨噬细胞在肠粘膜免疫系统中起着重要作用。然而，他们是一个定义不清的细胞群体。因此，我们在正常结肠粘膜中测定了它们的表型。通过胶原酶消化法从结肠活检和手术标本中分离出巨噬细胞。抗CD33磁珠对结肠巨噬细胞进行了阳性分选。流式细胞仪三重荧光分析研究CD14、CD16、CD33、CD44、CD11b、CD11c、CD64、HLA-DR、CD80、CD86和CD3/CD19的表达。CD33被评估为肠巨噬细胞的阳性标记物。在FACS分析中，从正常结肠粘膜分离的CD33+细胞与已建立的细胞内巨噬细胞标记物CD68共同表达。CD33+细胞具有吞噬功能。与未分选的固有层单核细胞（LPMC）相比，通过磁性抗CD33珠和培养分离该细胞群导致IL-1β增加4.2-40倍，肿瘤坏死因子α（TNF-α）分泌增加4.5-44倍。在CD33+细胞中，CD44+细胞占90.9+/-6.9%（平均+/-s.d.）。然而，来自结肠粘膜的巨噬细胞仅表现出CD14（10.5+/-3.8%）、CD16（10.1+/-3.9%）、HLA-DR（27.3+/-9.2%）、CD11b（17.4+/-6.8%）和CD11c（17.8+/-10.4%）的低表达。此外，CD80（9.2+/-4.2%）和CD86（15.1+/-7.3%）的表达较低，表明正常肠道巨噬细胞激活T细胞和T细胞介导的免疫反应的能力较低。我们的结论是，CD33有助于结肠巨噬细胞的分离和流式细胞术鉴定。这些细胞在缺乏脂多糖（LPS）受体和共刺激分子的正常粘膜（CD33++、CD44++、CD14-、CD16-、CD11b-、CD11c-、HLA-DRlow、CD80-、CD86-）中表现出单一表型。

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数字

图1
图1
正常结肠和血液中单个核细胞的正向/侧向散射特征在体外分化的巨噬细胞。从正常结肠（a）、外周血（b）或在体外用FACS分析分化的巨噬细胞（c）（每个细胞10000个）。很明显，血单核细胞很容易区分淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞（b）在体外分化巨噬细胞（c）。对于孤立的结肠巨噬细胞（a），几乎不可能清楚区分淋巴细胞和巨噬细胞区域。
图2
图2
流式细胞术检测CD33+结肠粘膜细胞。（a） 侧面散射特性的点图对CD33荧光。每个人分析了一万个细胞。CD33型+细胞（红色）很容易与其他细胞（蓝色）区分开来，这些细胞主要是淋巴细胞。（b） CD33的“支持”+细胞（红色）显示，与淋巴细胞群相比，这些细胞具有更高的侧面散射信号。正向/侧向散射图中的区域是单核细胞/巨噬细胞的典型区域。（c） CD33（PE）荧光点图对CD3/CD19（PerCP）荧光。CD33型+淋巴细胞标记CD3和CD19的细胞（红色）为阴性，>90%。只有极少数细胞显示CD33和CD3/CD19的阳性信号，可能是由于附着或粘附的细胞。
图3
图3
FACS分析CD68和CD33的共同表达。（a） 透化结肠巨噬细胞的前向/侧散点图显示碎片增加（绿色）。巨噬细胞（红色）和淋巴细胞群（蓝色）上设置了区域。（b） 同位素对照显示无非特异性染色。（c） CD68和CD33的共同表达（右上象限）。表达这两种抗原的细胞具有巨噬细胞的光学特性。左下象限的红细胞再次表明，光学特征不足以清楚区分结肠淋巴细胞和巨噬细胞。几乎没有细胞单独表达CD33（右下象限）或CD68（左上象限）。（d） 侧面散射对CD68图清楚显示阳性细胞群。（e） 侧面散射对CD33图显示与CD68相比，阳性人群具有非常相似的侧面散射特征+细胞。
图4
图4
CD68吞噬作用的免疫荧光显示+和CD33+细胞。按照材料和方法中的描述分离人类结肠单核细胞并进行免疫染色。标本取自结肠组织学正常的患者。与CD33（c）相比，CD68（a）的染色更亮，胞浆中的背景染色更高，可能是由于离心过程中胞浆扩散所致。CD68的90%以上+细胞（a）和>80%的CD33标记细胞（c）表现出FITC-标记珠的吞噬作用（b，d）。
图5
图5
CD33的分离+细胞通过抗CD33磁珠。在（a）和（b）两个后续的MACSbeads分离程序之前和之后，分离出的肠道单核细胞的正向/侧向散射特征。b（c）侧面散射中大量淋巴细胞几乎完全消失对CD33型+一个隔离步骤后的细胞。CD33型+细胞富集到50%左右。（d） 第二步分离后，>90%的完整细胞为CD33+（e）同位素对照显示无非特异性染色。
图6
图6
分离CD33的培养+结肠巨噬细胞。CD33型+用磁珠和在体外分化后的巨噬细胞在Primaria六孔或24孔培养板上培养。（a） 培养3天后，抗CD33分离细胞的典型巨噬细胞样形态。用同型对照和DAB-过氧化物酶染色的细胞。（b） ●●●●。用抗CD68抗体孵育。90%以上的细胞显示阳性染色。同样的实验在培养7天后进行在体外分化的巨噬细胞（c，d）。（c） 与结肠巨噬细胞形态相似，用同种对照抗体染色。（d） 与结肠巨噬细胞平行的CD68抗体染色>90%在体外分化的巨噬细胞。
图7
图7
培养CD33分泌IL-1β和肿瘤坏死因子α+细胞。（a） 固有层单个核细胞（LPMC）和分选CD33的IL-1β分泌+来自五个不同隔离的细胞。CD33型+细胞分泌的IL-1是LPMC的4.2-40倍。（b） 在LPMC培养基和相应的CD33-MACSbead分离的结肠巨噬细胞培养24小时后分泌TNF-α。隔离CD33+细胞分泌的TNF-α增加4.5-44倍。
图8
图8
正常结肠粘膜分离的单核细胞表型。（a） CD33（PE）荧光点图对CD14（FITC）荧光。CD33型+/CD14号机组−和CD33+/CD14号机组+细胞很容易与其他细胞区分开来。（b） CD33（PE）荧光点图对CD16（FITC）荧光。（c） CD33（PE）荧光点图对HLA-DR（FITC）荧光。（d） CD33（PE）荧光点图对CD44（FITC）荧光。（e） CD33（PE）荧光点图对CD11b（FITC）荧光。（f） CD33（PE）荧光点图对CD11c（FITC）荧光。每个人分析了一万个细胞。只有少量CD14+，CD16+、HLA-DR+，CD11b+和CD11c+巨噬细胞（CD33+).
图9
图9
结肠巨噬细胞CD80（B7-1）和CD86（B7-2）的表达在体外分化的树突状细胞。（a，c）CD33（PE）荧光点图对CD80（FITC）荧光（a）或对结肠巨噬细胞CD86（FITC）荧光（c）。大多数结肠巨噬细胞缺乏CD80和CD86表达（箭头所示）。只有少数细胞对CD80或CD86呈阳性反应（右上象限）。（b，d）CD33（PE）荧光点图对CD80（FITC）荧光（b）或对CD86（FITC）荧光（d）在体外分化的树突状细胞。几乎所有树突状细胞（CD33+)表示CD80和CD86（右上象限）。
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