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.1998年6月1日；141(5):1147-57.
doi:10.1083/jcb.141.5.1147。

Cdc42在巨噬细胞趋化性中的作用

W E艾伦 1, D齐查, A J雷德利, G E琼斯
附属公司

Cdc42在巨噬细胞趋化性中的作用

W E艾伦等。 J细胞生物学. .

摘要

已知Rho家族的三个成员Cdc42、Rac和Rho调节基于肌动蛋白的细胞骨架结构的组织。在Bac1.2F5巨噬细胞中，我们发现Rho调节细胞收缩，而Rac和Cdc42分别调节跛足和丝状足的形成。我们现在已经使用Dunn趋化室测试了Cdc42、Rac和Rho在集落刺激因子-1（CSF-1）诱导的巨噬细胞迁移和趋化中的作用。微量注射组分活化的RhoA、Rac1或Cdc42抑制细胞迁移，可能是因为细胞无法对CSF-1产生显著的极化反应。CSF-1诱导的迁移需要Rho和Rac，因为在注射了Rho抑制剂C3转移酶或显性阴性Rac突变体N17Rac1的细胞中，迁移速度降低到背景水平。相反，注射显性阴性Cdc42突变体N17Cdc42的细胞能够迁移，但不会沿梯度方向极化，对CSF-1的趋化性被消除。我们得出结论，Rho和Rac是细胞迁移过程所必需的，而Cdc42是细胞对CSF-1梯度反应所必需的但对细胞运动不是必需的。

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数字

图1
图1
Dunn趋化室中的微量注射和梯度形成。(一)Dunn室是一个改进的Helber计数室滑块。细胞培养在盖玻片上，盖玻片倒置在玻片上。在相位控制光学下可以观察到位于腔室环形桥上的细胞，并通过延时帧抓取自动记录其迁移轨迹(b条)为了测量微注射细胞，在盖玻片上画出引导标记，以标记Dunn室环形桥的界限，以及在校准标记的一段内标定的一个小象限。在将盖玻片安装到培养箱上之前，对该象限内的所有细胞进行微注射。对象限内的所有细胞和象限外的一些未注射细胞进行细胞迁移测量。后一种测量作为内部控制。
图2
图2
Cdc42调节CSF-1诱导的细胞极化。肌动蛋白丝定位显示在缺乏CSF-1 24小时的Bac1细胞中，无论是未刺激的还是未刺激的(一)暴露于CSF-1浓度梯度下2 h(b条)或微注射V12A35Rac1(c（c）)，V12Cdc42(d日)，或N17Cdc42(e（电子）)然后暴露于CSF-1浓度梯度下2小时。棒材，10μm。
图4
图4
Rho、Rac和Cdc42蛋白对巨噬细胞迁移速度的影响。Bac1巨噬细胞饥饿CSF-1 24小时，微量注射所示蛋白，然后暴露于CSF-1梯度中3小时。计算每个细胞连续4分钟间隔3小时的细胞运动速率(一)，使用Mathematica笔记本计算平均值和95%置信限。为V12A35Rac1注入的对照细胞绘制了10个随机选择的细胞的迁移轨迹(b条)和N17Cdc42注入细胞(c（c）)显示所有跟踪单元格的最终位置的矢量图。很明显，N17Cdc42不会干扰在对照细胞中观察到的细胞迁移的线性。
图4
图4
Rho、Rac和Cdc42蛋白对巨噬细胞迁移速度的影响。Bac1巨噬细胞饥饿CSF-1 24小时，微量注射所示蛋白，然后暴露于CSF-1梯度中3小时。计算每个细胞连续4分钟间隔3小时的细胞运动速率(一)，使用Mathematica笔记本计算平均值和95%置信限。为V12A35Rac1注入的对照细胞绘制了10个随机选择的细胞的迁移轨迹(b条)和N17Cdc42注入细胞(c（c）)显示所有跟踪单元格的最终位置的矢量图。很明显，N17Cdc42不会干扰在对照细胞中观察到的细胞迁移的线性。
图4
图4
Rho、Rac和Cdc42蛋白对巨噬细胞迁移速度的影响。Bac1巨噬细胞饥饿CSF-1 24小时，微量注射所示蛋白，然后暴露于CSF-1梯度中3小时。计算每个细胞连续4分钟间隔3小时的细胞运动速率(一)，使用Mathematica笔记本计算平均值和95%置信限。为V12A35Rac1注入的对照细胞绘制了10个随机选择的细胞的迁移轨迹(b条)和N17Cdc42注入细胞(c（c）)显示所有跟踪单元格的最终位置的矢量图。很明显，N17Cdc42不会干扰在对照细胞中观察到的细胞迁移的线性。
图3
图3
CSF-1诱导的趋化性需要Cdc42，但不需要迁移。Bac1巨噬细胞被CSF-1饥饿24小时，微注射V12A35Rac1(一和b条)，V12Cdc42(c（c）和d日)或N17Cdc42(e（电子）和（f）)然后在Dunn室中暴露于CSF-1浓度梯度下3 h。按照材料和方法中的描述绘制指定数量细胞的迁移轨迹。指示这些单元格的最终位置，将每个单元格的起点作为X轴和Y轴之间的交点，并在顶部显示CSF-1的源(一,c（c）、和e（电子）). 圆形直方图(b条,d日、和（f）)显示每个20°间隔内具有迁移方向的细胞比例，同样，CSF-1的来源位于顶部。迁移<10μm的细胞不包括在本分析中。(b） 箭头，细胞迁移的平均方向；灰色段; 95%置信区间。在V12Cdc42-和N17Cdc42注入细胞中(d日和（f）)，没有观察到明显的迁移方向性。
图5
图5
Rac1和RhoA蛋白对CSF-1诱导的细胞极化的影响。Bac1巨噬细胞在24小时内缺乏CSF-1，并微量注射V12Rac1(一)，N17Rac1(b条)，V14RhoA(c（c）)或C3转移酶(d日)然后在Dunn室中暴露于CSF-1梯度下2小时。细胞固定并染色以显示肌动蛋白丝。棒材，10μm。
图6
图6
细胞迁移需要Rac和Rho。Bac1巨噬细胞在24小时内缺乏CSF-1，并微量注射V12Rac1(一和b条)，N17Rac1(c（c）和d日)，V14RhoA(e（电子）和（f）)或C3转移酶(克和小时)然后暴露于CSF-1梯度下3 h。绘制所示细胞数的迁移轨迹，并在X轴和Y轴交叉处用每个细胞的起点指示这些细胞的最终位置，CSF-1的来源位于顶部(一,c（c）,e（电子）、和克). 圆形直方图(b条,d日,（f）、和小时)显示了在每个方向上迁移的细胞的比例，同样CSF-1的来源在顶部。对这些数据进行的瑞利测试表明，在任何情况下，迁移都没有明显的方向性。
图7
图7
迁移细胞中CSF-1受体的定位。CSF-1R（c-fms）在缺乏CSF-1的Bac1巨噬细胞中的定位(一)，用CSF-1刺激细胞2分钟(b条)，在暴露于CSF-1浓度梯度2小时的细胞中(c（c）)或在细胞内微量注射N17Cdc42，然后暴露于CSF-1梯度2小时(d日). 刺激前，细胞饥饿CSF-1 24小时，然后用大鼠抗CSF-1R抗体固定CSF-1R-定位，然后用FITC-偶联山羊抗大鼠IgG。棒材，10μm。
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