Structure of alpha-synuclein fibrils derived from human Lewy body dementia tissue

doi:10.1038/s41467-024-46832-5

.2024年3月29日；15(1):2750.

doi:10.1038/s41467-024-46832-5。

人路易体痴呆组织中α-同核蛋白原纤维的结构

附属公司

¹美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院神经病学与神经疾病希望中心。
²伊利诺伊大学厄本那-香槟分校生物物理和定量生物学中心，伊利诺伊州厄本那，61801，美国。
^三威斯康星大学麦迪逊分校生物化学系，威斯康星州麦迪逊，53706，美国。
⁴华盛顿大学医学院细胞成像中心，密苏里州圣路易斯，63110，美国。
⁵伊利诺伊大学厄本那-香槟分校化学系，伊利诺伊州厄本那，61801，美国。
⁶美国伊利诺伊州乌尔巴纳-香槟伊利诺伊大学贝克曼高级科学技术研究所生物化学系生物物理和定量生物学中心，NIH高分子建模和可视化资源，理论和计算生物物理小组。
⁷伊利诺伊大学厄本那-香槟分校材料科学与工程系，伊利诺伊州厄本那，61801，美国。
⁸华盛顿大学医学院病理学与免疫学系，密苏里州圣路易斯，63110。
⁹美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院放射、神经科学、物理治疗和职业治疗系，邮编63110。
¹⁰计算生物分子磁共振核心，美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院糖尿病、消化和肾脏疾病研究所，20892。
¹¹伊利诺伊大学厄本那-香槟分校生物物理和定量生物学中心，伊利诺伊州厄本那，61801，美国。crienstra@wisc.edu。
¹²威斯康星大学麦迪逊分校生物化学系，威斯康星州麦迪逊，邮编53706。crienstra@wisc.edu。
¹³美国威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学莫格里奇研究所，邮编53706。crienstra@wisc.edu。
¹⁴威斯康星大学麦迪逊分校麦迪逊国家核磁共振设施，美国威斯康星州麦迪逊市，53706。crienstra@wisc.edu。
¹⁵美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院神经病学与神经疾病希望中心。kotzbauerp@wustl.edu。

^#贡献均等。

PMID： 38553463
PMCID公司：项目经理10980826
内政部： 10.1038/s41467-024-46832-5

人路易体痴呆组织中α-同核蛋白原纤维的结构

Dhruva D Dhavale公司等。国家通讯社. 2024.

.2024年3月29日；15(1):2750.

doi:10.1038/s41467-024-46832-5。

附属公司

¹美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院神经病学与神经疾病希望中心。
²伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校生物物理和定量生物学中心，伊利诺伊州厄巴纳，61801。
^三威斯康星大学麦迪逊分校生物化学系，威斯康星州麦迪逊，53706，美国。
⁴华盛顿大学医学院细胞成像中心，密苏里州圣路易斯，63110，美国。
⁵伊利诺伊大学厄本那-香槟分校化学系，伊利诺伊州厄本那，61801，美国。
⁶美国伊利诺伊州乌尔巴纳-香槟伊利诺伊大学贝克曼高级科学技术研究所生物化学系生物物理和定量生物学中心，NIH高分子建模和可视化资源，理论和计算生物物理小组。
⁷伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校材料科学与工程系，伊利诺伊州厄巴纳，61801。
⁸华盛顿大学医学院病理与免疫学系，密苏里州圣路易斯，63110，美国。
⁹美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院放射、神经科学、物理治疗和职业治疗系，邮编63110。
¹⁰计算生物分子磁共振核心，美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院糖尿病、消化和肾脏疾病研究所，20892。
¹¹伊利诺伊大学厄本那-香槟分校生物物理和定量生物学中心，伊利诺伊州厄本那，61801，美国。crienstra@wisc.edu。
¹²威斯康星大学麦迪逊分校生物化学系，威斯康星州麦迪逊，53706，美国。crienstra@wisc.edu。
¹³美国威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学莫格里奇研究所，邮编53706。crienstra@wisc.edu。
¹⁴威斯康星大学麦迪逊分校麦迪逊国家核磁共振设施，美国威斯康星州麦迪逊市，53706。crienstra@wisc.edu。
¹⁵美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院神经病学与神经疾病希望中心。kotzbauerp@wustl.edu。

^#贡献均等。

PMID： 38553463
PMCID公司：项目经理10980826
内政部： 10.1038/s41467-024-46832-5

摘要

帕金森病（PD）和路易体痴呆（LBD）的主要特征是路易体和路易神经节中α-同核蛋白（Asyn）纤维的积聚。在这里，我们开发并验证了一种方法来扩增从LBD死后组织样品中提取的Asyn纤维，并使用固态核磁共振（SSNMR）研究来确定原子分辨率结构。扩增的LBD Asyn原纤维由单根原丝和两根低捻原丝的混合物组成。原丝折叠与最近一项冷冻电子显微镜研究所确定的折叠高度相似，该研究是针对从LBD组织中提取的少数扭曲的单原丝纤维群体进行的。这些结果扩展了LBD Asyn纤维的结构特征，以及研究疾病机制、成像剂和针对Asyn的治疗方法的方法。

PubMed免责声明

利益冲突声明

下文指定的作者有一项题为“组织种子纤维蛋白及其制备和使用方法”的专利申请。专利申请人：圣路易斯华盛顿大学，发明人姓名：Paul T.Kotzbauer、Dhruva D.Dhavale、Rebecca Miller和Jennifer Y.O'Shea，申请号：17/858817，申请状态：待定。该专利申请涵盖了产生扩增原纤维的过程、方法和组成。其他作者声明没有相互竞争的利益。

数字

**图1。从死后组织样本中提取和扩增LBD Asyn纤维的示意图。**
一通过连续提取和组织样品离心分离不溶性部分中的纤维。将不溶性组分种子与重组Asyn单体结合，并进行多轮超声处理，然后在37°C下进行静态培养，以产生扩增的纤维。b条–**e（电子）**LBD扩增纤维的典型负染TEM图像(b条)，控制放大纤维(**c（c）**)，MSA扩增的原纤维(d日)和IV_特里斯原纤维(**e（电子）**). 从至少三个独立制备的纤维样品的负染TEM图像中获得了类似的结果。

**图2。表达A53T Asyn-CFP/YFP的HEK 293生物传感器细胞中组织衍生和扩增纤维的种子特性。**
荧光图像显示细胞接种了：一LBD不溶部分。b条MSA不溶性部分。**c（c）**LBD扩增的纤维。d日MSA扩增的纤维。**e（电子）**LBD组织可溶部分。**（f）**MSA组织可溶部分。克LBD扩增的纤维可溶性部分。小时MSA扩增的纤维可溶性部分。红色箭头表示细胞内包涵体。在检测三例LBD和三例MSA患者扩增纤维的三个以上独立实验中也观察到类似结果。比例尺=10µm。

**图3。LBD扩增纤维的冷冻EM 2D类别平均值。**
一,b条从单粒子低温电子显微镜数据中获得的两种原丝纤维类别的2D类别平均值示例。**c（c）**,d日从单粒子低温电子显微镜数据获得的单原丝纤维类的2D类平均值示例。比例尺=10 nM。

**图4。SSNMR分配、远程接触和MPL测量显示2个原丝是原纤维的主要种群。**
一 ¹³C类-¹³C的相关性¹³C类-¹⁵N标记的LBD原纤维显示羰基（左图）和脂肪族（右图），光谱上标记明确。数据采集频率为750 MHz¹H频率，16.667 kHz魔法角旋转，样品温度10±5^o个C，75毫秒DARR混合。b条（左）CO-N-H 3D和（右）CA-N-H实验的2D投影¹³C、，²H、，¹⁵N标记样品。中的数据(b条)在750 MHz下采集¹H频率，33.333 kHz魔法角旋转，使用6 ms¹⁵N个-¹³C交叉极化。在傅里叶变换之前，先使用非均匀采样采集3D，然后使用SMILE进行重建。**c（c）**根据均匀采样的CANH 3D光谱，绘制峰值高度，以明确指定¹³C、，¹⁵N-标记样品。将棒材归一化为残余A76的峰值高度。根据TALOS-N预测的二级结构绘制在LBD组织所需样本的峰高图下方。d日TALOS-N衍生的二面体Phi和Psi角揭示了β-片结构。预测的RCI化学位移有序参数以蓝色绘制，显示高度有序（R² > 0.9）G36和G41、T64和T81以及A85到V95之间的区域。

**图5。SSNMR测定的长程相关性。**
一使用L38 V70、G73、S87、I88之间的12 ms PAR混合确定的长范围明确相关性在¹³C类-¹³C二维相关实验。b条从3D打印二维条形图¹³C类-¹³C类-¹³C相关谱显示了三个苏氨酸残基（T72、T75、T92）的相关性，这些残基在F1和F2中相对于2D谱消除了歧义。**c（c）**hCAhhNH实验中确定的长范围接触表明L38与A76和V77之间以及G41与A69之间存在紧密接触。d日用暗场、未染色的TB-TEM显微照片测量LBD纤维的单位长度质量直方图。

**图6。LBD扩增纤维的结构。**
一通过SSNMR研究确定LBD纤维的卡通表示。b条测定了LBD纤维的10种最低能量结构。蓝色表示具有大量分子间接触的有序区域；红色代表相对无序的区域，使用基于CP的极化技术检测到的分子间接触很少。**c（c）**根据基于SSNMR CP的实验确定的内部联系人。品红线是在光谱内手动识别的分子内接触，蓝线是使用概率分配的PASD算法识别的相关性。

**图7。三例LBD患者放大纤维的光谱比较。**
一一维¹³C交叉极化谱显示LBD1（蓝色）、LBD6（红色）和LBD7（黑色）放大纤维的刚性纤维核。显示了光谱的脂肪族区域，突出了样品之间峰值位置和相对强度的相似性。b条,**c（c）**二维¹³C类-¹³C相关光谱与1 ms POSTC7混合(b条)LBD6和(**c（c）**)LBD1原纤维。黑色轮廓（正）对应边界之间的相关性¹³C核对和红色轮廓（负）对应于¹³C原子核相隔两个原子。总的来说，化学位移非常相似，尤其是Ala、Thr和Val残基的诊断侧链。

**图8。在存在突变Asyn单体的情况下，体外组装纤维和扩增纤维的纤维生长速率。**
一具有家族性PD突变A53T、E46K和H50Q的Asyn单体存在时WT正常生长率。b条含有S87K、S87Q、G68Q和A76T突变的Asyn单体的WT正常生长率。每个数据点代表平均增长率(n个 = 除静脉注射外，从每个单独的LBD（蓝色）和MSA（红色）尸检病例中制备的扩增纤维获得3个重复）_特里斯纤维（洋红色）。对4例LBD和4例MSA患者的放大纤维进行纤维生长率测量。星号表示LBD病例中与WT单体相比，突变单体的生长速度显著降低。MSA扩增原纤维的生长速率具有较高的变异性，包括WT单体，突变体和WT单体间的差异不显著。结果表明，四种突变（S87K(第页 = 0.009），S87Q(第页 = 0.008），G68Q(第页 = 0.007）和A76T(第页 = 0.009））显著降低LBD纤维的生长速度。其中两个突变（S87K和G68Q）似乎也降低了IV_特里斯而其他两种（S87Q和A76T）则没有。数据采用非配对双尾t检验（Welch）进行分析，并用Holm-Bonferroni方法进行多重比较校正（显著性水平为0.05）。数据表示为平均值±SD，独立实验=2。从两个独立实验中获得了类似的结果。源数据作为源数据文件提供。

**图9。扩增的Asyn的SSNMR结构类似于提取纤丝的低温电子显微镜结构。**
一人类Asyn的一级序列，β链用箭头注释。两亲性N末端区域、斑块的疏水性非淀粉样β组分（NAC）区域和酸性C末端区域分别为蓝色、黄色和红色。紫色、绿色和橙色矩形表示用于后续比较研究的残留范围。b条带有标记N和C末端的SSNMR LBD Asyn核结构的原子模型(PDB 8FPT型). 低置信度区域用带有灰色高光的透明卡通进行描绘。以高度可信的方式建模的残留物范围被描述为带有侧链的卡通，并以紫色、绿色和橙色突出显示。**c（c）**低温-EM LBD Asyn核结构（PDB 8A9L）的原子模型，颜色如(b条). 未确认的蛋白质岛呈灰色。SSNMR结构的高置信残基范围覆盖在紫色、绿色和橙色中，并计算了主链原子的根平方偏差（r.m.s.d）。d日使用来自PASD的初始赋值，使用Xplor-NIH计算在每剩余基础上映射到最低能量结构的满意NMR衍生原子间距离数。色标从白色延伸至红色，表示残留物几乎没有或没有观察到NMR衍生距离，表明残留物观察到许多NMR衍生的距离。**e（电子）**映射到cryo-EM Asyn堆芯结构（PDB 8A9L）上的满意NMR衍生距离数。

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来自人类路易体痴呆组织的α-同核蛋白原纤维的结构。
Dhavale DD、Barclay AM、Borcik CG、Basore K、Gordon IR、Liu J、Milchberg MH、O'shea J、Rau MJ、Smith Z、Sen S、Summers B、Smiths J、Warmuth OA、Chen Q、Fitzpatrick JAJ、Schwieters CD、Tajkhorshid E、Rienstra CM、Kotzbauer PT。 Dhavale DD等人。 bioRxiv[预印本]。2023年1月10日2023.01.09.523303。doi:10.1101/2023.01.09.523303。生物Rxiv。2023 更新位置：国家公社。2024年3月29日；15(1):2750. doi:10.1038/s41467-024-46832-5。 PMID：36711931 免费PMC文章。已更新。预打印。

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