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.2024;16(1):203-215.
doi:10.1159/000537775。 Epub 2024年3月12日。

人宿主防御肽LL-37抑制人支气管上皮细胞中TNFα介导的基质金属蛋白酶MMP9和MMP13

安东尼·阿尔蒂埃里 1 2, 考特尼·林恩·马歇尔 1, 帕德马尼·拉莫塔 1, 迪伦·劳埃德 三, Mahadevappa Hemshekhar公司 三, 维克多·斯派塞 2, 安妮·范德道斯 4, 内洛弗·穆克吉 1 三
附属公司

人宿主防御肽LL-37抑制人支气管上皮细胞中TNFα介导的基质金属蛋白酶MMP9和MMP13

安东尼·阿尔蒂埃里等。 J先天免疫. 2024.

摘要

简介：TNFα诱导的基质金属蛋白酶在包括哮喘在内的呼吸道炎症性疾病的气道重塑过程中起着关键作用。气道炎症期间，阳离子宿主防御肽LL-37在肺部升高。然而，LL-37对TNFα驱动过程的影响尚不清楚。在这里，我们研究了LL-37对人类支气管上皮细胞（HBEC）中TNFα介导的反应的影响。

方法：我们使用一种基于适配体的慢失速修饰蛋白质组学方法来定义HBEC蛋白质组因TNFα而改变。用免疫分析、ELISA和Western blots检测所选候选蛋白和信号中间产物的丰度，用qRT-PCR检测mRNA丰度。

结果：蛋白质组学分析显示，与未刺激细胞相比，124个蛋白质显著改变，12个蛋白质增强2倍以上，以应对TNFα。与未刺激细胞相比，MMP9是TNFα反应中增加最多的蛋白，增加了约10倍，MMP13增加了约3倍。此外，我们证明LL-37显著抑制了HBEC中TNFα介导的MMP9和MMP13。机械数据显示，TNFα介导的MMP9和MMP13的产生受SRC激酶控制，LL-37增强相关上游负调控因子，即磷酸化AKT（T308）和TNFα中介导的TNFAIP3或A20。

结论：本研究结果表明，LL-37可能在干预哮喘等慢性炎症性呼吸道疾病的气道重塑过程中发挥作用。

关键词：气道重塑；花青素；宿主防御肽；炎症；LL-37；基质金属蛋白酶；肿瘤坏死因子α。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，他们与本文的内容没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
TNFα对支气管上皮细胞蛋白质组的影响。用TNFα（20 ng/mL）刺激HBEC-3KT细胞24 h。使用基于高含量适配体的蛋白质组阵列探测从五个独立实验中获得的细胞裂解物（每个样品总蛋白14μg）。对标准化log2蛋白表达值和Welch’st吨以的截止值进行测试第页<0.05用于选择与未刺激细胞相比，在TNFα作用下显著改变的蛋白质丰度变化。火山图显示，与未刺激细胞相比，TNFα对蛋白质的反应存在差异。
图2。
图2。
TNFα诱导HBEC细胞分泌MMP9和MMP13.HBEC-3KT细胞(一)或淹没的人类原代支气管上皮细胞（PBEC）(b条)用TNFα（20 ng/mL）或IFNγ（30 ng/mL）刺激24 h。用ELISA检测细胞培养上清液中MMP9和MMP13的丰度。每个符号代表一个独立的实验，使用来自PBEC独立供体的细胞，条形图显示中间值和最小最大值范围。采用单因素方差分析和Fisher最小显著性差异检验进行统计分析(*第页< 0.05, ****第页< 0.0001).c（c）PBEC在气液界面（ALI）分化，用TNFα（10–40 ng/mL）或IFNγ（15–60 ng/mL。每个符号代表一个独立的实验，使用来自独立供体的细胞，条形图显示中间值和最小值范围。
图3。
图3。
LL-37和citLL-37抑制TNFα介导的MMP9和MMP13的产生。在有/无TNFα（20 ng/mL）的情况下，用LL-37、citLL-37或sLL-37（各0.25μm）刺激HBEC 24小时。用ELISA检测TC上清液中MMP9和MMP13在HBEC-3KT中的丰度(N个=5个独立实验）(一)和人PBEC（用N个=3名独立捐赠者n个=各2份技术副本）(b条).Y（Y）-轴表示在每个独立的实验复制中与配对的未刺激细胞相比的%变化。每个点代表一个独立的实验，条形图显示中间值和IQR，而胡须显示最小最大范围。统计分析采用费希尔最小显著性差异检验的双向方差分析(**p≤0.001, ****第页≤ 0.0001).
图4。
图4。
SRC激酶抑制剂抑制TNFα介导的MMP9和MMP13的产生。在用TNFα（20 ng/mL）刺激HBEC-3KT细胞之前，用药物抑制剂SRC1抑制剂（SRCi）和达沙替尼预处理1 h。在TNFα刺激24小时后收集TC上清液，并检测MMP9的丰度(一)和MMP13(b条)通过ELISA检测。每个数据点代表一个独立的复制(N个=4个独立实验），直线代表平均值。使用双向方差分析和Dunnett多重比较检验来确定统计显著性(***第页<0.001, ****第页<0.0001).
图5。
图5。
LL-37和citLL-37不同地改变支气管上皮细胞中的AKT磷酸化。HBEC-3KT公司(N个=3个独立实验）用LL-37、citLL-37或sLL-37（0.25μ米每个）。刺激后30分钟获得的总细胞裂解物（25μg）用于检测磷酸化AKT（T308）的丰度(一)和磷酸-AKT（S473）(b条)通过西方印迹。用β-肌动蛋白归一化后进行密度测定，作为每个样品的成对负荷对照。Y（Y）-轴表示与成对的非模拟控件相比的%变化。每个符号表示来自独立实验的密度测定评估，条形图显示中间值和最小最大范围。使用重复测量的单因素方差分析和Fisher最小显著性差异检验进行统计分析(*第页≤0.05）。
图6。
图6。
LL-37增强支气管上皮细胞中TNFα介导的负调节因子TNFAIP3或A20。HBEC-3KT公司(N个=4个独立实验）用LL-37、citLL-37或sLL-37（0.25μ米在TNFα（20ng/mL）存在和不存在的情况下。刺激后2h分离的mRNA通过qRT-PCR检测TNFAIP3的表达。每个符号代表一个独立的实验。折叠更改(Y（Y）-轴）将TNFAIP3归一化为18S RNA，并使用比较ΔΔCt方法与归一化至1的未刺激细胞进行比较。结果显示为箱线图，其中条形图显示中值和IQR，晶须显示最小值和最大值。采用单因素方差分析进行统计分析(***第页≤ 0.001). 虚线表示未模拟单元格的标准化基线值1。
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赠款和资金

本研究由加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）发现拨款资助（RGPIN-220-06599和435549-2013）。A.A.得到了研究MB、Mindel和Tom Olenick免疫学奖、加拿大哮喘协会、加拿大过敏性哮喘和免疫学基金会以及加拿大呼吸研究网络的学生资助和奖项。C.M.得到了加拿大哮喘协会、加拿大过敏性哮喘和免疫学基金会的学生资助，和加拿大卫生研究院。P.R.由加拿大研究生奖学金-硕士项目提供支持。