Osteomacs promote maintenance of murine hematopoiesis through megakaryocyte-induced upregulation of Embigin and CD166

doi:10.1016/j.stemcr.2024.02.004

.2024年4月9日；19(4):486-500.

doi:10.1016/j.stemcr.2024.02.004。 Epub 2024年3月7日。

成骨细胞通过巨核细胞诱导的Embigin和CD166的上调促进小鼠造血维持

附属公司

¹印第安纳大学医学院微生物学和免疫学系，美国印第安纳州印第安纳波利斯。
²美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院医学系。
^三美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院骨科。
⁴美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院医学和分子遗传学系。
⁵印第安纳大学医学院整形外科，美国印第安纳州印第安纳波利斯；美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院解剖、细胞生物学和生理学系。
⁶印第安纳大学医学院微生物与免疫学系，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国；印第安纳大学医学院医学系，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国；美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院儿科esrour@iu.edu。

PMID： 38458190
预防性维修识别码：项目经理11096441
内政部： 2016年10月10日/j.stemcr.2024.02.004

成骨细胞通过巨核细胞诱导的Embigin和CD166的上调促进小鼠造血维持

Safa F穆罕默德等。干细胞报告. 2024.

.2024年4月9日；19(4):486-500.

doi:10.1016/j.stemcr.2024.02.004。 Epub 2024年3月7日。

附属公司

¹美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院微生物与免疫学系。
²美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院医学系。
^三美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院骨科。
⁴美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院医学和分子遗传学系。
⁵印第安纳大学医学院骨科，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国；美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院解剖、细胞生物学和生理学系。
⁶印第安纳大学医学院微生物与免疫学系，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国；印第安纳大学医学院医学系，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国；印第安纳大学医学院儿科，美国印第安纳州印第安纳波利斯。电子地址：esrour@iu.edu。

PMID： 38458190
预防性维修识别码：项目经理11096441
内政部： 2016年10月10日/j.stemcr.2024.02.004

摘要

造血干细胞（HSC）功能在小生境中的维持是一个精心策划的事件。骨瘤（OM）是生态位的关键细胞成分。以前，我们记录了成骨细胞、OM和巨核细胞相互作用促进造血。在这里，我们进一步描述了OM的特征，并确定了巨核细胞诱导的介质，这些介质增强了OM在生态位中的作用。巨核细胞刺激OM的单细胞mRNA-seq、质谱和CyTOF检测表明，上调OM上的CD166和Embigin可增强其造血维持功能。CD166敲除OM或shRNA-Embigin敲除AM证实，这些分子的丢失显著降低了OM增强成骨细胞介导的造血增强活性的能力。重组CD166和Embigin部分替代OM功能，这两种蛋白都是OM造血功能的关键介质。我们的数据确定Embigin和CD166是OM-调节的HSC功能的关键组分，在干细胞的各种体外操作中是潜在的参与者。

关键词：CD166；恩贝金；造血干细胞；巨核细胞；生态位；成骨细胞；骨瘤。

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利益冲突声明

利益声明作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
BM衍生细胞的流式细胞术分析（A）专门用于此分析的4个独立实验之一。每次实验从2至3只小鼠中收集8至12周龄小鼠的骨髓细胞。使用27G针头和注射器从长骨中积极冲洗BM（以促进骨折）。单细胞悬液用指示的荧光结合抗体染色并进行分析。细胞被选通（在所示的3行中）以包含所有细胞（顶行）、仅淋巴细胞（中行）或仅粒细胞（底行）。侧面散射与F4/80的对比⁺在左起第三列中显示，以反映F4/80的位置（相对于侧面散射）⁺使用的3个门上的单元格。（B）条形图总结了专门用于此分析的所有4个实验的数据。需要指出的是，所有细胞中只有28.7%（在这4个实验中为26.3%±3.7%）是F4/80，这与Millard等人的图1中的值不同。，超过50%。需要注意的是，粘附在淋巴细胞上的巨噬细胞碎片对细胞大小的影响最小（正向和侧向散射），对粒度没有任何影响（侧向散射）。因此，应在淋巴细胞门内观察到离散的“受污染”细胞群。A离散F4/80⁺CD3（CD3）⁺或F4/80⁺第220页⁺人群检测不到，尤其是淋巴细胞门。Ter-119检测到一些双重染色，不能排除其非特异性。

图2
使用CyTOF（17种表面抗体；表S2）分析从相同的2至3日龄幼崽获得的新鲜NCC和新生儿BM的OM（A和B）单细胞悬浮液的特性。对这17种抗体的分析在3个不同的样本上重复了3次。对单细胞存活细胞（Ir191/193）、事件长度和顺铂（Pt195）进行数据门控。数据通过CD45进行门控⁺80层/四层⁺用于识别新鲜NCC中OM的细胞（A，左）和NBM中巨噬细胞（A，右）。（A） ViSNE图显示OM和BM巨噬细胞之间单个表面标记的差异。CD45上事件相对于另一事件的集体和相对位置⁺80层/四层⁺2个ViSNE图中的事件（tSNE1 vs.tSNE2）表明，新鲜NCC和BM巨噬细胞与使用的17种抗体的表型不同。（B） OM和BM巨噬细胞亚群内的异质性。根据17个表面标记的表达确定每个簇。这10个簇的所有其他使用的标记的表达均为阴性，而这些标记在簇的标识中没有显示出来；N=3–6。（C）流式细胞术分析显示NCC（左点图）和8周颅骨细胞（右点图）OM上CD80和CD206共表达。（D） 8周龄和2岁小鼠长骨中OM的百分比（相对于有核细胞总数），N=8，Student t检验，p<0.05。（C）和（D）显示了OM表型和数量的发育变化。（E）将来自C57BL/6J（CD45.2）小鼠的1000个LSK移植到2×10⁵照射（900 cGy，1剂量）F1受体的BoyJ（CD45.1）细胞静脉注射。通过CD45和F4/80染色鉴定OM，通过CD45.1和CD45.2染色鉴定其来源。描述了第4个月的嵌合现象。其他数据如图S1A和S1B所示。（F和G）用qPCR分析新分离的OM（闭合圆）和OB（闭合三角形）的指示基因。（H）分选的OM和OB以其原始NCC百分比重建，并在不存在（OM+OB）或存在（OM+OB+MK）MK的情况下培养，通过0.4μm的transwell（T）与OM+OB分离。在第7天评估培养细胞的克隆形成潜能，并测定CFU倍数变化。N=3；^∗p<0.05，单因素方差分析。MK接触对OM增殖影响的其他数据如图S1C所示。

图3
在不存在或存在MK（NCC+MK）的情况下，将2至3日龄幼鼠的OM、OB和MK相互作用（A）NCC培养16小时。OM（CD45⁺80层/四层⁺CD41细胞⁻)从2组中进行分类，并进行单细胞捕获。对来自NCC的24个OM和来自NCC+MK的20个OM进行了单细胞mRNA测序。（B）（A）中靶基因的qPCR验证单细胞mRNA测序。N=3；^∗p＜0.05；单因素方差分析。（C和D）NCC在MK不存在（NCC）或存在（NCC+MK）的情况下共培养过夜。每组接种LSK 2天，然后通过细胞分选分离OM。各组OM均进行基于TMT的肽标记和LC-MS/MS。从新鲜NCC中分离的OM和未培养的OM作为对照。共鉴定了1548个蛋白质，并对1359个蛋白质进行了定量。（C）火山图比较了NCC和新鲜NCC（左）、NCC+MK和新鲜NCC+MK和NCC（右）中OM的蛋白表达。高亮显示的黑色圆点（红色箭头）是Embigin在所有3个绘图中的表达级别。橙色虚线是0.05 p值的截止线。（D）所有3组Embigin的平均分组丰度。使用SE.N=3–4估计统计准确性。（E–G）NCC单细胞悬浮液在有或无MK的情况下培养2天，并使用30种表面和细胞内抗体进行分析（表S1；滴定每种抗体以确定最佳浓度）。如图2所示，对单细胞存活细胞、事件长度和顺铂的原始数据进行门控。数据通过CD41进行门控⁻CD45型⁺80层/四层⁺用MK培养的细胞鉴定NCC和NCC中的OM。从NCC和NCC+MK获得的OM的（E）ViSNE图显示了一些标记物的表达，包括CD166和Embigin。（F）热图显示了从NCC和NCC+MK获得的OM上30个抗体的表达。N=3。（G）在NCC和NCC+MK的OM亚群中观察到的异质性表现。每个亚群的特征取决于它们17个表面标记的表达。

图4
OM上CD166表达对造血功能的影响（A）NCC流式细胞术分馏的示意图（2至3日龄幼崽）。（B） CD166型⁺和CD166⁻通过细胞分选分离OM并用OB（CD45）进行电镀⁻80层/四层⁻NCC细胞），然后接种LSK 7天。建立了测定培养LSK子代CFU倍数变化的CFU分析方法。一式三份的三个独立实验之一；^∗与除CD166外的所有对照组相比，p＜0.05⁺OM+OB；单因素方差分析。（C）祖细胞（D）和竞争性再生试验（E–G）的实验设计。所有培养物中的细胞活力均超过97%。我们之前已经证明（Cheng等人，2011；Chitteti等人，2010b，2013b），在这些培养物中，只有LSK后代表现出任何CFU功能或植入潜力。将NCC衍生OB的共培养物与新分离的NCC（OM）中包含的OM的原始数量混合^重量+OB）或CD166 KO OM（OM）的补充编号（相当于NCC中OM的原始编号）^CD166−/−+OB）在没有或存在MK的情况下。隔夜培养物接种LSK，并与上述各组培养1周以上。（D）用培养物测定LSK子代CFU折叠变化。一式三份的三个独立实验之一。^#与不含MK的对照组相比，p<0.05，与含MK对照组相比，^∗p＜0.05；单因素方差分析。（E–G）受试者（F1小鼠）接受照射（分剂量700和400 cGy，间隔4小时），并在200μL PBS中接受静脉注射试验细胞（1000个新鲜分离的LSK细胞或其培养后代）。细胞移植到含有400000个BoyJ（CD45.1）细胞的竞争性重新繁殖试验中。（E）通过外周血嵌合体分析每月数据。（F）移植后4个月BM观察到嵌合现象（G）第4个月的BM多系重建。N=5-9只小鼠/组；^∗p<0.05；单因素方差分析。

图5
在没有或存在MK的情况下，在OM上表达Embigin对造血功能（A）OM和OB培养的影响。在培养的第0、3和6天添加Embigin-阻断抗体（>Emb；1μg/孔）。第7天，清除多余的抗体，并将LSK添加到培养物中。此方法在OM、OB和MK上暂时阻止Embigin，但在LSK上没有。一式三份的三个独立实验之一。所有培养物中的细胞活力均超过97%。我们之前已经证明（Cheng等人，2011；Chitteti等人，2010b，2013b），在这些培养物中，只有LSK后代表现出任何CFU功能或植入潜力。^#与不含MK的所有对照组相比，p<0.05；ˆ与所有MK对照组相比p<0.05；单因素方差分析。（B）祖细胞的示意图（C）和竞争性再生试验（D）。NCC在2天内用shRNA或空载体进行4次螺旋感染。第四次感染后，添加MK 1周。第7天，GFP⁺Emb公司⁻OM（标记为OM^{（徽章KD）})和GFP+Emb+OM（标记为OM^{（电动汽车）})已排序。隔夜与感染了病毒的OM和未感染的OB共同培养。未感染OM+OB+MK作为对照。然后将LSK与每组一起培养1周。（C）建立祖细胞分析以确定CFU折叠变化。用2个shRNA构建物（OM）观察到CFU下降^徽章KD1+OB+MK和OM^徽章KD2+OB+MK）。一式三份的三个独立实验之一。^∗p<0.05；单向方差分析。（D） LSK子代经静脉移植，在受照（700和400 cGy，分剂量）F1受体中使用200000个BoyJ（CD45.1）细胞进行竞争性再填充试验。通过外周血嵌合体分析每月数据。（E）将重组小鼠CD166和Embigin（作为OM的替代品）涂布在组织培养板上。这些平板用于培养从NCC中分离的OB。用LSK接种培养物以测定CFU折叠变化。一式三份的三个独立实验之一。^∗与OM+OB、rCD166+OB和rCD166+rEmb+OB相比，p<0.05，p<0.05；单因素方差分析。（F） CD166 KO NCC在2天内接受4次螺旋感染，以感染GFP⁺含有shRNA的病毒*恩贝金*或空向量。在第四次感染结束时，MK分别与这些组培养1周。第7天，这些培养物用于流式细胞术筛选OM，即GFP⁺Emb公司⁻或GFP⁺Emb公司⁺隔夜与感染了病毒的OM和未感染的OB进行共培养。各组均培养LSK 1周。建立了子代测定法，以测定培养的LSK子代相对于250个新鲜LSK的CFU倍变化。一式三份的三个独立实验之一。^∗与LSK、OB、OM相比p<0.05^{（徽章KD）}+OB+MK、OM^{（CD166−/−）}+OB+MK、OM^{（EV/CD166−/−）}+OB+MK、OM^{（CD166−/−/Emb KD）}+OB+MK；单向方差分析。

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