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.2023年6月2日；13(6):936.
doi:10.3390/biom13060936。

路易体病的疾病特异性α-突触核蛋白种子和多系统萎缩在甲醛固定石蜡包埋人脑中得以保存

艾恩·金 1 2, 伊万·马丁内斯·瓦尔布纳 1 三, 李军（Jun Li） 1, 安东尼·E·朗 1 三 4, Gabor G Kovacs公司 1 2 三 4 5
附属公司

路易体病的疾病特异性α-突触核蛋白种子和多系统萎缩在甲醛固定石蜡包埋人脑中得以保存

艾恩·金等。 生物分子. .

摘要

最近的研究已经能够使用种子扩增分析（SAAs）检测来自突触核蛋白病患者的甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织中的α-突触核蛋白（αSyn）种子，但由于蛋白质提取效率有限，灵敏度相对较低。为了引入冷冻组织的替代方案，我们开发了一种简化的蛋白质提取方案，用于评估FFPE人脑中疾病特异性接种。我们评估了不同组织制剂、脱蜡和蛋白质提取缓冲液的蛋白质提取效率，使用甲醛固定组织和单个路易体病（LBD）患者的FFPE组织。或者，我们使用商用试剂盒将热诱导抗原检索和分离结合起来。我们的新型蛋白质提取方案已经过优化，可用于10个4.5µm厚或2 mm直径的FFPE组织切片，这些切片可用于种子SAA。我们证明，从FFPE中提取的蛋白质仍然保留了播种潜力，并进一步显示了LBD和多系统萎缩的疾病特异性播种。据我们所知，我们的研究首次重述了FFPE人脑中疾病特异性α-Syn接种行为。我们的发现为重新评估存档的人类脑组织开辟了新的视角，将疾病特异性种子试验扩展到更大的队列，以促进同核蛋白病的分子亚型划分。

关键词：FFPE；SAA；α-同核蛋白；蛋白质提取；播种行为。

PubMed免责声明

利益冲突声明

G.G.K.拥有5G4抗体的共享专利。其他作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
FFPE蛋白质提取优化示意图。(一)使用FFPE和甲醛固定颞叶皮层对受试LBD受试者的蛋白质提取效率进行测试，与对照受试者相比，受试者使用三种不同的组织制剂、两种不同的脱蜡和再水化方法以及六种不同的提取缓冲液（均存档<2年）；(b条)引入热诱导抗原回收和分离以提高用简单PBS缓冲液提取的蛋白质产量；(c（c）)应用优化提取方案评估不同地区和LBD受试者的蛋白质提取效率和α-Syn接种（存档>20年）；(d日)评估LBD（存档<2年）黑质、MSA小脑（存档>20年）和对照（存档<2年）受试者顶叶皮层和小脑的α-Syn疾病特异性，比较仅进行抗原回收或同时进行抗原回收和分离的组织之间的接种。
图2
图2
使用各种组织制剂、脱蜡和提取方法比较FFPE蛋白质提取效率和随后的α-Syn接种。(一)使用六种不同的提取缓冲液，从受试者顶叶皮层的4-mm微穿孔和载玻片、试管中的45-µm FFPE切片或受试者颞叶皮层的4mm FFPE微穿孔中提取二甲苯-乙醇或庚烷-甲醇脱蜡获得的蛋白质产量；(b条)LBD颞叶皮层和控制顶叶皮层4-mm FFPE微穿孔提取蛋白的后续αSyn播种潜力。
图3
图3
使用甲醛固定人脑组织的不同提取缓冲液的蛋白质提取效率和随后的αSyn接种潜力。(一)用不同的缓冲液提取LBD的甲醛固定FFPE颞叶皮层4mm微穿孔获得的蛋白质产量；(b条)当使用缓冲液1-6从甲醛固定的人脑组织中提取蛋白质时，观察到αSyn接种阴性。
图4
图4
利用抗原回收和分离提取的蛋白质优化α-Syn-SAA。(一)不同组织制剂蛋白质产量的比较；(b条)从对照组的FFPE顶叶皮层和LBD受试者的颞叶皮层和黑质获得的蛋白质产量，已存档<2年（LBD 1）；(c（c）)从四名LBD受试者的FFPE额叶皮层获得的蛋白质产量已存档20年以上（LBD 2-5）；(d日)αSyn接种来自PBS可溶部分的连续稀释总蛋白，在蛋白提取之前使用抗原回收和分离提取；(e（电子）)从PBS可溶性级分中连续稀释的总蛋白的αSyn接种，在没有抗原回收或解离的情况下提取；(（f）)使用5µg PBS可溶部分总蛋白评估α-Syn种子接种潜力，这些总蛋白是在蛋白质提取之前通过抗原回收和分离从不同组织制剂中提取的；(克)<2年存档的FFPE LBD人脑组织中α-Syn种子活性的受试者间和受试者内异质性(n个= 1; 颞皮质和黑质）和>20岁(n个= 4; 额叶皮层）与FFPE对照人脑组织(n个= 1; 顶叶皮层和小脑）；(小时)不同组织制剂的曲线下面积、T50和最大ThT值；(我)αSyn种子的受试者间和受试者内异质性的曲线下面积、T50和最大ThT值。****，第页<0.0001，采用Tukey多重比较试验进行单因素方差分析（ANOVA）。
图5
图5
LBD和MSA FFPE脑组织中α-Syn种子活性的比较，无论是否分离提取。(一)在使用PBS提取蛋白质之前，仅通过抗原提取或同时进行抗原提取和分离，从受试对照受试者顶叶皮层和小脑、受试LBD受试者颞叶皮层和受试MSA受试者小脑的2mm FFPE微穿孔中获得的总蛋白质产量；(b条)评估LBD中有利于SAA的疾病特异性αSyn种子，并比较从游离或非游离（仅抗原回收）组织中提取的蛋白质的αSyn播种活性；(c（c）)评估MSA-favouring SAA中疾病特异性αSyn种子接种，并比较从游离或非游离（仅抗原回收）组织中提取的蛋白质的αSyn接种；(d日)曲线下面积、T50和最大ThT值，用于比较使用LBD-有利SAA提取的PBS可溶部分中的αSyn种子活性；(e（电子）)曲线下面积、T50和最大ThT值，用于比较使用MSA-favouring SAA提取的PBS-可溶部分中的αSyn种子活性。***，第页< 0.001; ****,第页<0.0001，采用Tukey多重比较试验进行单因素方差分析（ANOVA）。
图6
图6
LBD和MSA FFPE脑组织中保存的α-Syn疾病特异性的生化和超微结构验证。(一)LBD偏爱SAA时观察到的疾病特异性αSyn种子差异；(b条)MSA预防SAA中观察到的疾病特异性αSyn种子差异；(c（c）)曲线下面积、T50和最大ThT值，用于使用有利于SAA的LBD比较LBD、MSA和对照FFPE人脑组织中的αSyn接种活性；(d日)使用MSA-favoring SAA比较LBD、MSA和对照FFPE人脑组织中αSyn种子活性的曲线下面积、T50和最大ThT值；(e（电子）)利用LBD FFPE颞叶皮层透射电镜证实SAA生成的αSyn纤维中观察到的偶尔扭转；(（f）)TEM证实使用MSA FFPE小脑在SAA生成的αSyn纤维中观察到厚的缠绕扭曲。**，第页< 0.01; ****,第页<0.0001，采用Tukey多重比较试验进行单因素方差分析（ANOVA）。比例尺输入(e（电子）)表示100 nm。
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出版物类型

赠款和资金

这项研究得到了爱德蒙德·萨夫拉慈善基金会、克伦贝尔基金会、马来亚银行基金会和罗西基金会的支持。A.K.得到了神经退行性疾病研究中心（CRND）研究生基金会、联合利华/利普顿神经科学研究生奖学金和杰西·凯欣研究生奖的支持。资助机构没有参与研究的设计、数据的收集、分析或解释，也没有参与手稿的撰写。