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.2023年7月6日；30（7）：973-986.e11。
doi:10.1016/j.stem.2023.05.015。 Epub 2023年6月19日。

基于人iPSC的帕金森病视基因α-同核蛋白聚集临床前模型

Min Seong Kim女士 1, Eun A Ra公司 1, Sin Ho Kweon公司 1, 薄安世 2, 韩世科 三, 哟，噢 4, 加桑·李 5
附属公司

基于人iPSC的帕金森病视基因α-同核蛋白聚集临床前模型

Min Seong Kim女士等。 细胞干细胞. .

摘要

人类诱导多能干细胞（hiPSCs）为疾病建模和药物发现提供了优势。然而，重建先天性细胞病理学，尤其是在具有累积蛋白质聚集体的晚发性神经退行性疾病中，包括帕金森氏病（PD），一直是一个挑战。为了克服这一障碍，我们开发了一种光遗传学辅助的α-突触核蛋白（α-syn）聚集诱导系统（OASIS），该系统可快速诱导PD hiPSC中脑多巴胺能神经元和中脑类器官的α-syn-聚集和毒性。我们用SH-SY5Y细胞进行基于OASIS的一级化合物筛选，确定了5个候选物，并用OASIS PD hiPSC大脑多巴胺能神经元和中脑类器官进行了二次验证，最终选择了BAG956。此外，BAG956通过促进病理性α-syn聚集物的自噬清除，在体内外显著逆转了α-syn-预制纤维模型中的特征PD表型。根据FDA现代化法案2.0对替代非动物试验方法的强调，我们的OASIS可以作为一种无动物临床前试验模型（新称为“非临床试验”），用于同核蛋白病药物的开发。

关键词：帕金森病；α-同核蛋白；多巴胺能神经元；人多能干细胞；光-α-同核蛋白；光遗传学；类有机物；蛋白质聚集；α-syn PFF；α-突触核蛋白预制纤维。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益声明M.S.K.、E.A.R.、H.S.K.和G.L.是与本研究相关的专利的发明者。G.L.是Vita Therapeutics的科学创始人、股东和科学顾问。

数字

图1。
图1 PD hiPSC衍生mDA神经元中光诱导疾病相关α-syn聚集
（A） 光遗传学辅助α-突触聚集诱导系统（OASIS）的示意图。（B） 示意图AAVS1型利用CRISPR/Cas9系统增强的同源重组进行位点靶向。SA，拼接受体。（C） 分化型TH的代表性图像+来自光锁或光-α-syn PD hiPSCs的mDA神经元。（D） PD-hiPSC-mDA神经元中光-α-syn聚集物的形成。（E） 使用自动肝细胞成像系统定量表达光锁或光-α-syn的mDA神经元中光-α-syn聚集物的总面积。(n个=3，每个实验至少包含40个细胞，普通双向方差分析）。（F） 使用自动活细胞成像系统定量光-α-syn表达mDA神经元胞体或轴突中光-α-syn聚集物的总面积。(n个=3，每个实验至少包含40个细胞，普通双向方差分析）。（G） 对照组或SNCA公司−/−单元格(n个=3，单向方差分析，然后是Tukey’s事后（post-hoc）测试）。（H） 光诱导α-syn-mDA神经元中α-syn聚集物的典型图像。（一） 5G4数量的量化+mDA神经元的聚集(n个=8，单向方差分析，然后是Tukey’s事后（post-hoc）测试）。（J） pS129-α-syn数量的量化+mDA神经元的聚集(n个=6，单向方差分析，然后是Tukey’s事后（post-hoc）测试）。（K） mCherry的共放大+带有指示抗体或硫黄素S（Thiof lavin S）（白色箭头）的聚集物。（五十） 在蓝光照射后的指定时间点，对光-α-syn-mDA神经元中的指示标记聚集体进行量化(n个= 12). 比例尺，10μm。条形代表平均值±SEM.n.s.，不显著****P（P）< 0.0001. 蓝光条件：34μW/mm2固定细胞成像在470 nm、0.17 Hz、0.5 s下持续7天，活细胞成像在488 nm、0.5 Hz、1.5μW下持续1 s。
图2。
图2：光遗传学辅助α-syn聚集诱导系统诱导PD hiPSC衍生mDA神经元选择性死亡。
（A） TH的代表性图像+神经元保持黑暗或暴露在蓝光下。（B） TH数量的量化+对蓝光有反应的神经元(n个=30，单因素方差分析，然后是Tukey’s事后（post-hoc）测试）。（C） 在黑暗或暴露于蓝光的光-α-syn mDA神经元中TH的代表性蛋白质印迹图像。（D） 黑暗或蓝光照射下视-α-syn-mDA神经元TH水平的量化(n个=3，双尾非配对t吨-测试）。（E） 的示意图NR4A2型（也称为NURR1号机组)CRISPR/Cas9系统靶向位点与NURR1:：GFP的分化+神经元。（F） NURR1:：GFP的量化+有无蓝光神经元(n个=4，单向方差分析，然后是Tukey’s事后（post-hoc）测试）。（G） 在指定的时间点，对蓝光刺激作出反应，光-α-syn-mDA神经元中裂解caspase-3的代表性免疫染色图像。（H） 蓝光刺激下视-α-syn-mDA神经元裂解caspase-3的定量研究(n个=9，单向方差分析，然后是Tukey’s事后（post-hoc）测试）。比例尺，10μm。条形代表平均值±SEM.n.s.，不显著*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001. 蓝光条件：34μW/mm2在470 nm、0.17 Hz、0.5 s条件下。
图3。
图3：利用光遗传学辅助α-syn聚集诱导系统进行高含量成像筛查
（A） 利用光遗传学辅助的α-突触核蛋白聚集诱导系统（OASIS）进行高含量成像（HCI）筛查的过程示意图。（B） 5G4代表性图片+骨料或DAPI+SH-SY5Y细胞中的细胞自动成像。（C） OASIS筛选HCI的Z’因子计算；黑暗（黑圈）或暴露于蓝光（蓝圈）的光α-syn细胞(n个= 36). （D） 基于OASIS的HCI分析中筛选的化合物的散点图。对于每种化合物，绘制治疗药物中观察到的相应聚集诱导得分（AIS）（阳性对照设置为1.0）。共筛选了1280个化合物，红色闭合圆圈代表19个选定的潜在命中化合物，AIS值小于0.5。（E） 在24孔平板培养条件下验证19种化合物对SH-SY5Y细胞α-syn聚集的影响(n个=31或42，单因素方差分析后接Dunnett’s事后（post-hoc）测试）。编号化合物的详细信息如表S1所示。（F） 在有或没有5种选定分子的情况下，保持在黑暗或暴露于蓝光的光-α-syn-mDA神经元中AIS的定量(n个对于BVT（BVT948）、BAG（BAG956）、AFA（Arcyriaflavin A）和AZD（AZD1480），=12；n个=18（CDC（C 021盐酸），单因素方差分析，然后是Dunnett’s事后（post-hoc）测试）。（G） TH的量化+光-α-syn-mDA神经元中的神经元处于黑暗或蓝光下，有或没有5个选定分子(n个=18，单因素方差分析，然后是Dunnett的事后（post-hoc）测试）。（H） TH的代表性图像+光-α-syn-mDA神经元保持在黑暗中或暴露于蓝光下，有无CDC或BAG治疗。（一） 黑暗或蓝光照射下经或不经CDC或BAG处理的视-α-syn-mDA神经元中裂解caspase-3的定量(n个=9，单因素方差分析，然后是Dunnett的事后（post-hoc）测试）。比例尺，10μm。条形代表平均值±SEM.n.s.，不显著*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001.
图4。
图4.所选两种化合物对光-α-同表达PD-hiPSC衍生中脑类有机物（MO）的影响的确认。
（A） 将光锁或光α-合成-MO中TH的典型免疫染色图像保存在黑暗中或暴露在蓝光下。白色虚线和箭头表示包含TH的区域+mDA神经元与TH水平下降+神经元。（B） 5G4代表性图片+TH中的信号+opt-α-syn-MO中的神经元保持在黑暗中或暴露在蓝光下。白色箭头表示TH之间的共同定位+和5G4+信号。（C） TH的量化+光锁或光α-syn-MO中的神经元保持黑暗或暴露于蓝光(n个=32，共8个类器官，单因素方差分析，Tukey's次之事后（post-hoc）测试）。（D） 5G4的量化+光锁或光αsyn-MO中的信号保持黑暗或暴露在蓝光下(n个=32，共8个类器官，单因素方差分析，Tukey's次之事后（post-hoc）测试）。（E） 在黑暗或暴露于蓝光下的光模拟或光α-合成MOs中GFAP的定量。(n个=14，共8个类有机物，单因素方差分析，Tukey's事后（post-hoc）测试）。（F） 在有或没有CDC或BAG治疗的情况下，保持在黑暗或暴露于蓝光下的光-α-syn-MOs中TH和5G4的代表性免疫染色图像。（G） 5G4的量化+光锁或光-α-syn-MO中的α-syn聚集体(n个=24，共8个有机类，双尾非配对t吨-测试）。（H） TH的量化+光锁或光α-syn-MO中的神经元(n个=24，共8个有机类，双尾非配对t吨-测试）。（一） MO中蓝光诱导光-α-syn聚集体降解效率检查系统示意图。Opto-α-syn-MO暴露于蓝光下6天，然后与载体、CDC或BAG一起在黑暗中放置1天。（J） 5G4代表性图片+在蓝光照射6天后，用载体、CDC或BAG将光-α-syn-MO中的α-syn聚集体置于黑暗中1天。（K） 5G4的量化+光-α-syn-MO中带或不带CDC或BAG的信号(n个=24，共8个类器官，单因素方差分析，Tukey's事后（post-hoc）测试）。（五十） 基于OASIS的化合物筛选的示意性总结。比例尺，100μm。条形代表平均值±SEM.n.s.，不显著*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001. 蓝光条件：34μW/mm2在470 nm、0.17 Hz、0.5 s条件下。
图5。
图5：通过口服BAG 956，α-syn PFF注射液引起的行为缺陷和PD-like病理得到恢复。
（A） 纹状体内注射PBS或α-syn PFF后7个月行为评估示意图(n个= 8). PBS注射小鼠接受载体或BAG治疗高的（10 mg/kg），而注射α-syn PFF的小鼠口服载体BAG低的（2 mg/kg），或袋装高的（10毫克/千克）。（B） 前后腰部握力测试(n个=8，单向方差分析，然后是Tukey’s事后（post-hoc）测试）。（C） 旋转试验的坠落延迟(n个=8，单向方差分析，然后是Tukey’s事后（post-hoc）测试）。（D） 代表展示了每组的运动和中枢活动通过OFT中的行驶路径。（E） 显示了OFT中心区域的条目数量（左）、花费的时间（中）和行驶的距离（右）(n个=8，单因素方差分析，然后是Tukey’s事后（post-hoc）测试）。（F） EPM（G）中各组小鼠的代表性运动路径。显示了在远离中心区域的开放区域中进入的次数（左）和花费的时间（右）(n个=8，单向方差分析，然后是Tukey’s事后（post-hoc）测试）。（H） 通过总冻结时间和线索FC的冻结发作评估α-syn PFF诱导的学习记忆丧失(n个=8，单向方差分析，然后是Tukey’s事后（post-hoc）测试）。（一） 包括TH在内的中脑冠状切片的代表性显微照片+和尼日尔+带或不带BAG的PBS或α-syn PFF中的神经元（J）TH的量化+和尼日尔+带或不带BAG的PBS或α-syn PFF中的神经元(n个=3，单向方差分析，然后是Tukey’s事后（post-hoc）测试）。（K） 经或未经BAG处理的PBS或α-syn PFF抗pS129-α-syn-免疫反应的代表性荧光图像。（五十） 腹侧中脑区不溶性（上部）和可溶性（下部）部分的代表性免疫印迹。（M） pS129-α-syn蛋白水平（较高）和TH水平（较低，n个=3，单向方差分析，然后是Tukey’s事后（post-hoc）测试）。比例尺，100μm。条形代表平均值±SEM.n.s.，不显著*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001.
图6。
图6 BAG 956治疗通过抑制PI3K-PDK1/AKT/mTOR通路诱导自噬介导的α-syn-聚集物清除
（A） 经PBS或α-syn PFF与载体、BAG或CDC治疗的PD hiPSC衍生mDA神经元的典型western blot图像。（B） PBS或α-syn PFF与载体、BAG或CDC联合治疗PD hiPSC衍生mDA神经元中LC3-II的定量(n个=3，单向方差分析，然后是Tukey’s事后（post-hoc）测试）。（C） PBS或α-syn PFF与载体、BAG或CDC联合治疗PD hiPSC衍生mDA神经元p62的定量(n个=3，单向方差分析，然后是Tukey’s事后（post-hoc）测试）。（D） LC3的代表性免疫染色图像+/5G4型+蓝光照射后（6天），光-α-syn MO中的共定位点（白色箭头）保持在黑暗中。比例尺，100μm。（E） LC3的量化+/5克4+蓝光照射后保持黑暗的光-α-syn-MO的共定位(n个=16，共8个有机类，双尾非配对t吨-测试）。（F） 5G4的代表性免疫染色图像+α-syn聚集体和TH+含有载体、BAG或BAG和Bafilomycin A1（Bafilo）的视-α-syn-mDA神经元中的神经元。比例尺，10μm。（G） 5G4的量化+视-α-syn-mDA神经元中的α-syn聚集(n个=21，双尾非配对t吨-测试）。（H） TH的量化+视-α-syn-mDA神经元中的神经元(n个=14，双尾非配对t吨-测试）。（一） 具有PBS或α-syn PFF与载体或BAG的PD hiPSC衍生mDA神经元中PI3K/PDK1下游靶点的代表性western blot图像(n个=3，单向方差分析，然后是Tukey’s事后（post-hoc）测试）棒材代表平均值±SEM.n.s.，不显著*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001. 蓝光条件：34μW/mm2在470 nm、0.17 Hz、0.5 s下持续7天。
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