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.2023年7月；15(7):948-959.
doi:10.1038/s41557-023-01232-y。 Epub 2023年6月15日。

五元正交吡咯烷基-tRNA合成酶/tRNA派尔对

亚当·贝蒂 # 1, 丹尼尔·邓克尔曼 # 1, 杰森·W·琴 2
附属公司

五元正交吡咯烷基-tRNA合成酶/tRNA派尔对

亚当·贝蒂等。 自然化学. 2023年7月.

摘要

相互正交的氨酰转移RNA合成酶/转移RNA对为将非规范氨基酸编码成蛋白质、编码非规范聚合物和大环合成提供了基础。在这里，我们发现了五倍正交吡咯烷酰-tRNA合成酶（PylRS）/吡咯烷基-tRNA（tRNA）派尔)对。我们发现了相互正交性的经验序列同一性阈值，并将其用于PylRS和tRNA的凝聚聚类派尔序列；这定义了许多序列簇，跨越五类PylRS/tRNA派尔对（现有类+N、A和B，以及新定义的类C和S）。大多数PylRS集群属于未被探索用于正交对生成的类。通过测试不同簇和类的配对，以及结构异常的吡咯烷基-tRNA，我们解决了制作五重正交PylRS/tRNA所需的80%的配对特异性派尔对；我们通过工程和定向进化来控制其余的特性。总的来说，我们创建了924个相互正交的PylRS/tRNA派尔对，1324个三正交对，128个四正交对和8个五正交对。这些进展可能为编码聚合物合成提供关键基础。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争性利益

作者们宣布了以下竞争性财务利益：J.W.C.是Constructive Bio公司的创始人。

数字

图1
图1。先前表征的ΔN PylRSs和pyl tRNAs中序列一致性和交叉反应性之间的关系。
一ΔN PylRS各组合的活性我和ΔN tRNA派尔j个，以GFP（150AllocK）产量计量他的6来自承载GFP（150标签）他的6存在4 mM AllocK的基因1根据ΔN PylRS之间的序列恒等式绘制我和ΔN PylRSj个，式中ΔN PylRSj个是与ΔN tRNA来自同一生物体的合成酶派尔j个ΔN PylRS蛋白的序列一致性大于55%（灰色虚线），主要与彼此的pyl tRNAs激活（88%的病例）。序列同源性小于55%的ΔN PylRS蛋白可能与其他的pyl tRNA一起激活，也可能不激活。b。每个组合ΔN PylRS的活性大于我和ΔN tRNA派尔j个根据ΔN tRNA之间的序列一致性绘制派尔我和ΔN tRNA派尔j个，式中ΔN tRNA派尔我是tRNA派尔来自与ΔN PylRS相同的生物体我序列一致性大于75%的ΔN pyl tRNAs（灰色虚线）主要与其他合成酶一起激活（93%的病例）。序列同源性小于75%的ΔN pyl tRNAs可能对彼此的合成酶起作用，也可能不起作用。点表示三个生物复制的平均值，误差条如补充图1所示。补充表2中提供了所有数值。
图2
图2。候选PylRS和tRNA的选择派尔CUA公司序列和将pyl系统划分为五个不同的序列定义类。
a。检索到351个PylRS C末端结构域氨基酸序列的聚类图。树状图上显示了三组：+N（红色）、ΔN（蓝色）和sN（绿色）。使用55%的聚类阈值，得到37个聚类。热图显示序列标识分数的百分比。b。351个PylRS C末端结构域氨基酸序列的凝聚层次聚类生成的37个簇的树状图。标记了37个PylRS代表序列。径向坐标表示百分比序列标识（对数刻度）。灰色轮廓20%间隔，红色轮廓55%序列一致，聚类阈值。c。35 tRNA的聚类图派尔来自同一生物体的序列作为每个簇的代表性PylRS。树状图上显示了五种pyl系统类别：N（红色）、A（紫色）、B（浅蓝色）、C（深蓝色）和S（绿色）。d。树状图显示了由35个已鉴定tRNA的凝聚层次聚类产生的八个簇派尔序列。彩色标签对应16 tRNA派尔选择用于实验表征的序列及其同源PylRS酶。径向坐标表示百分比序列标识（对数刻度）。灰色轮廓20%间隔，红色轮廓75%序列一致，聚类阈值。e、。代表性tRNA派尔显示了每个类中的；相对于标准N的显著结构差异-嗯tRNA派尔蓝色。f、。三个Pyl系统组及其划分为五类的示意图。选择用于表征的Pyl系统的名称标注在每个类的下面。对于A类和B类Δ-1月26日PylRS/A公司-阿尔夫特核糖核酸派尔和BΔ-亮度1PylRS/B-InttRNA派尔使用配对。对于所有其他类别，PylRS/tRNA派尔对来自同一生物体。克.所有五个类之间的交互网络示意图。已知N类和S类相互作用（红色箭头）；类N、类A和类B之间的相互作用可以通过tRNA工程（灰色箭头）消除。类之间的所有其他交互都尚未探索（粉红色箭头）。
图3
图3。候选PylRS酶和pyl-tRNA的活性图谱，以及新的三重正交PylRS/tRNA的发现派尔对。
a。热图显示了通过GFP（150AllocK）的产生测量的所选pyl-tRNAs和PylRS酶组合的活性他的6来自承载GFP（150标签）他的6存在4 mM AllocK的基因1值是野生型GFP的百分比。只有PylRS酶和pyl-tRNA具有至少一个tRNA的30%以上活性派尔或PylRS酶分别显示。数据表示三次生物复制的平均值。提供了所有数值和条形图，包括显示s.d.的误差条（补充表2）。b。双正交PylRS/tRNA各家族代表集合的活性热图派尔从活动屏幕获得的对。正交系数（o.c）以灰色显示；将显示每个族中o.c.最高的集合。一个家族的不同成员共享同一组PylRS酶，但使用不同的pyl-tRNAs。数据表示三次生物复制的平均值。提供了所有数值和条形图，包括显示s.d.的误差条（补充表2）。c。三重正交PylRS/tRNA家族中o.c.最高的组的活性热图派尔从活动屏幕获得的对。数据表示三次生物复制的平均值。提供了所有数值和条形图，包括显示s.d.的误差条（补充表2）。d。S的生成Δ通过从S类PylRS酶中删除N末端结构域而产生的PylRS变体。我们考虑了SΔPylRS变体作为ΔN组的工程成员；他们的活动概况太过多样化，不能被视为一个独特的类别。e、。所有五类PylRS之间的相互作用网络基于特征PylRS酶和pyl-tRNAs之间的活性。使用来自以下类别的PylRS酶可以找到相互正交的对：A类和B类；A级和S级；B类和S类；C类和N类；C类和S类（灰色双头箭头）。因此，发现了十分之五的可能相互正交的组合；其他五个均显示出一个不希望出现的交叉反应性（单头红色箭头）。这些正交相互作用在没有工程调整PylRS:tRNA的情况下被确定派尔互动。对于没有两个PylRS类，所有对的组合都具有双侧交叉反应性。
图4
图4。筛选工程化的pyl-tRNAs可以控制五个pyl类特定成员之间20种交叉反应中的18种。
a。五种特异性PylRS/tRNA相互作用示意图派尔代表通过tRNA形成五对正交对的逻辑起点的对（每类一对）派尔工程战略。对于类别N、A和B，我们选择了类间交叉反应性（用蓝色突出显示的箭头）先前由tRNA控制的活性对派尔对于C类，我们选择了C对Δ-尼特拉管道RS/C-热量1tRNA派尔对，其中tRNA派尔与所有其他PylRS类自然正交。最后，对于S类，我们选择了最活跃的类内PylRS/tRNAPyl对。b。选择一组PylRS酶和pyl-tRNAs的活性热图作为开发五对正交对的基础。需要工程或替换以控制不需要的交叉反应的pyl-tRNA标记为红色，而已经满足所有必要正交性要求的pyl-t RNA标记为绿色。绿盒：C的自然正交性-热量1tRNA派尔.蓝盒：以前被tRNA正交化的类交互派尔工程和筛选。数据表示三次生物复制的平均值。提供了所有数值和条形图，包括显示s.d.的误差条（补充表2）。c。来自的活动热图b条，根据N类tRNA的结果更新派尔屏幕。N个-遇见tRNA派尔，N类tRNA中最正交的tRNA派尔与所选PylRS酶相关的筛选，与N配对+-嗯PylRS编号-遇见tRNA派尔满足所有正交性要求（绿色框）。数据表示三次生物复制的平均值。提供了所有数值和条形图，包括显示s.d.的误差条（补充表2）。d。来自的活动热图c（c），根据A的结果更新-阿尔维特核糖核酸派尔屏幕。A类-阿尔夫特核糖核酸第21层，最正交的tRNA派尔来自A类tRNA派尔屏幕，与A配对Δ-1R26号机组PylRS.A公司-阿尔夫tRNA第21层满足所有正交性要求（绿色框）。数据表示三次生物复制的平均值。提供了所有数值和条形图，包括显示s.d.的误差条（补充表2）。e、。来自的活动热图d日，根据B类tRNA的结果更新派尔屏幕。B类-国际tRNA17C10磅，最正交的tRNA派尔来自B类tRNA派尔由于与C的交叉反应性，屏幕不满足所有必要的正交性要求Δ-尼特拉PylRS（红色方框）。数据表示三次生物复制的平均值。提供了所有数值和条形图，包括显示s.d.的误差条（补充表2）。f、。总结N、A和B tRNA关键结果的示意图派尔屏幕。通过筛选天然和工程的pyl-tRNA，20种相互作用中有18种需要正交化才能产生五重正交的PylRS/tRNA派尔pairs–controlled（左图，用蓝色突出显示的箭头表示成功控制的交互）。三个完全正交的pyl-tRNAs（用与其同源的PylRS酶标记为绿色）被鉴定出来，对于其余两个pyl-tRNA（用红色）中的每一个，只有一个交叉反应需要控制。
图5
图5。S独特的活动模式ΔPylRS酶能够形成四对正交对。
a。用S替换B或C类PylRS酶的策略示意图ΔPylRS变体用于解决C类PylRS和B类tRNA之间不希望出现的交叉反应派尔S的各种活动ΔPylRS变体意味着可以找到不同的变体来替代B类（例如SΔ-Clos公司B的PylRSΔ-亮度1PylRS，如标签所示）或C类（如SΔ-I2类C的PylRSΔ-尼特拉牌手表PylRS，如标签所示）PylRS酶。b。三重正交PylRS/tRNA每个家族最高o.c.组的活性热图派尔根据N、A和B tRNA的结果获得的配对派尔屏幕。用不同的S替换B或C类PylRSΔPylRS变体（用两种深浅的蓝色标记）允许生成许多新族。金盒子：来自先前报告的三正交N的代表性集合+-嗯PylRS，A型Δ-1R26号机组PylRS，B型Δ-亮度1PylRS系列。银盒：在N、A和B tRNA之前发现的唯一三重正交家族的代表性集合派尔屏幕。正交系数o.c.以灰色显示。一个家族的不同成员共享同一组PylRS酶，但使用不同的pyl-tRNAs。数据表示三次生物复制的平均值。提供了所有数值和条形图，包括显示s.d.的误差条（补充表2）。c。四正交PylRS/tRNA每个家族最高o.c.组的活性热图派尔根据N、A和B类tRNA的结果获得的对派尔屏幕。用不同的S替换B类或C类PylRSΔPylRS变体（用两种深浅的蓝色标记）允许生成所有此类家族。数据表示三次生物复制的平均值。提供了所有数值和条形图，包括显示s.d.的误差条（补充表2）。d日.带有单个S的两个四胞胎家庭的活动热图Δ替代B类或C类PylRS的PylRS变体，以及最终类（N类）中最正交的第五对。需要工程或替换以减少不必要的交叉反应的pyl-tRNA标记为红色，而已经满足所有必要正交性要求的pyl-t RNA标记为绿色。数据表示三次生物复制的平均值。提供了所有数值和条形图，包括显示s.d.的误差条（补充表2）。e、。具有最高o.c.的四正交集之间的相互作用示意图（B类PylRS由S替代ΔB（o.c.3.9）和最后一类中最正交的第五对（N类）。f、。具有最低o.c.的四正交集之间的相互作用示意图（c类PylRS由S替代ΔC，o.c.2.5）和最后一类中最正交的第五对（N类）。
图6
图6。五正交PylRS/tRNA派尔通过定向进化配对。
a。活动热图将四胞胎与最后一节课的最高o.c.和最正交的第五对组合在一起。交叉反应用红色框住；用五倍正交进化变异体取代的pyl-tRNA标记为红色。b。用于从S进化五重正交pyl-tRNAs的库-I2类tRNA派尔脚手架。S的三叶草结构-I2类tRNA派尔如图所示。c。来自的活动热图一，根据B类（或S类）特异性pyl-tRNA的定向进化结果进行更新ΔB). S公司-I2类tRNAPyl-B3型2是定向进化中最正交的tRNA，满足所有必要的正交性要求（绿色框）。因此，五重正交SΔB-Clos公司活塞RS/S-I2类tRNA塔-B32这对组合有效地替代了B类，不需要进一步的工程。数据表示三次生物复制的平均值。提供了所有数值和条形图，包括显示s.d.的误差条（补充表2）。d。来自的活动热图c（c），根据S.S类特异性pyl-tRNA的定向进化结果更新-I2类tRNAPyl-S52型满足所有必要的正交性要求（绿色框）。因此，S+-德布PylRS/S型-I2类tRNAPyl-S52型pair不需要进一步的工程，它完成了一组五重正交的pair（o.c.4.0）。数据表示三次生物复制的平均值。提供了所有数值和条形图，包括显示s.d.的误差条（补充表2）。e、。总tRNA示意图派尔进化策略和结果对。N类和B类（或其S类）之间的交叉反应Δ等价物）以及N类和S类之间的相互作用被相继破坏以产生一组五对，其中所有二十个交叉反应被最小化。f、。包含进化的pyl-tRNA的两个五倍正交对家族的活性热图；o.c.最高的五胞胎。数据表示三个生物复制的平均值。提供了所有数值和条形图，包括显示s.d.的误差条（补充表2）。g。具有最高o.c.（5.4）的五对正交配对内的相互作用示意图，由每个类别的一个PylRS组成。小时。示意图强调了吡咯烷系统成功划分为五个相互正交的功能类别：N、A、B或SΔB、C或SΔC、和S。
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引用人

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