Pharmacological inhibition of TAK1 prevents and induces regression of experimental organ fibrosis

doi:10.1172/jci.insight.165358

.2023年7月24日；8（14）：e165358。

doi:10.1172/jci.insight.165358。

TAK1的药理抑制作用预防和诱导实验性器官纤维化的逆转

附属公司

¹美国密歇根州安阿伯市密歇根大学内科风湿病学系密歇根硬皮病项目。
²EydisBio Inc.，美国北卡罗来纳州达勒姆。
^三美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学院药理学和癌症生物学系。

PMID： 37306632
预防性维修识别码：项目经理10443806
内政部： 10.1172/jci目击165358

TAK1的药理抑制作用预防和诱导实验性器官纤维化的逆转

斯瓦尔纳·贝尔等人。 JCI洞察力. 2023.

.2023年7月24日；8（14）：e165358。

doi:10.1172/jci.insight.165358。

附属公司

¹美国密歇根州安阿伯市密歇根大学内科风湿病学系密歇根硬皮病项目。
²EydisBio Inc.，美国北卡罗来纳州达勒姆。
^三美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学院药理学和癌症生物学系。

PMID： 37306632
预防性维修识别码：项目经理10443806
内政部： 10.1172/jci目击165358

摘要

系统性硬化症（SSc）中的多器官纤维化导致大量死亡，并且缺乏有效的治疗。TGF-β活化激酶1（TAK1）位于TGF-α和TLR信号的交叉点，可能在SSc中起致病作用。因此，我们试图评估SSc患者的TAK1信号轴，并使用潜在的新型药物如选择性TAK1抑制剂HS-276研究药物TAK1阻断。抑制TAK1可消除TGF-β1对健康皮肤成纤维细胞胶原合成和肌成纤维细胞分化的刺激，并改善SSc皮肤成纤维纤维细胞的结构性激活。此外，HS-276治疗可预防皮肤和肺纤维化，并降低博莱霉素治疗小鼠中纤维化前介质的表达。重要的是，即使在纤维化已经确立之后，开始HS-276治疗也能阻止其在受累器官中的进展。总之，这些发现表明TAK1参与了SSc的发病机制，并确定了使用小分子作为治疗SSc和其他纤维化疾病的潜在策略的靶向TAK1抑制。

关键词：自身免疫；皮肤病学；细胞外基质；纤维结合蛋白；纤维化。

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数字

**图1。TAK1在SSc中激活。**
(一)SSc患者的皮肤成纤维细胞(n个=4）和健康对照(n个＝4）在汇合处用磷酸化-TAK1（上图）和TAK1（下图）的抗体进行免疫标记；对免疫阳性细胞（来自3个随机选择的区域的平均值）进行定量。未付款t吨测试。(B类)SSc成纤维细胞培养液中分泌的I型胶原（cgnI）(n个=4）有或没有HS-276治疗。顶部面板：免疫印迹。底部面板：cgnI量化**P（P）*< 0.05.

**图2。HS-276减少了SSc成纤维细胞中ECM的沉积和TAK1的激活。**
SSc皮肤成纤维细胞在HS-276治疗前后培养24小时。(一)用磷酸化TAK1和I型胶原抗体对成纤维细胞进行免疫标记(n个= 4). 比例尺：100μm（顶部面板）。用Fn-EDA抗体对成纤维细胞进行免疫标记(n个= 6). 比例尺：100μm（底部面板）。代表性图像。(B类)融合SSc皮肤成纤维细胞(n个=9）与HS-276孵育24小时，用qPCR定量mRNA水平。未付款t吨测试。

**图3。HS-276抑制TGF-β依赖性纤维化细胞反应。**
在HS-276（10μM）存在或不存在的情况下，将融合的包皮成纤维细胞与TGF-β1（10 ng/mL）孵育24小时。(一)qPCR。用GAPDH标准化水平。(B类)免疫印迹法检测全细胞裂解物；代表性免疫印迹。相对折叠变化与对照相比，用GAPDH标准化。(C类)用I型前胶原、ASMA或Fn-EDA抗体对成纤维细胞进行免疫标记。代表性图像。比例尺：10μm（顶部面板）或50μm（底部面板）。相对荧光强度的量化（来自3个随机选择区域的平均值±SEM）。

**图4。HS-276可逆转TGF-β诱导的纤维化反应。**
将汇合的包皮成纤维细胞与TGF-β1一起或不与TGF-β1一起孵育24小时，然后加入HS-276（10μM）再孵育24小时。(一)qPCR测定mRNA水平(n个=2个生物复制品，2个独立包皮成纤维细胞[FS]）。(B类)全细胞裂解物进行免疫印迹。与对照组相比，具有相对折叠变化的代表性免疫印迹，用GAPDH标准化。

**图5。HS-276治疗可预防博莱霉素诱导的皮肤纤维化。**
C57/BL6小鼠被随机分为4个治疗组(n个=6–8只小鼠/组），在第22天实施安乐死，并收获皮肤。(一)三色染色，代表性图像。比例尺：100μm（左侧面板）。皮肤厚度（右侧面板，表示每hpf 8次测定的±SEM）。单向方差分析，然后是Tukey的多重比较测试。(B类–D类)皮肤切片用磷酸化TAK1（绿色；比例尺：50μm）、ASMA（红色；比例杆：50μm）、F4/80（红色；标尺：10μm）和DAPI（蓝色）抗体进行免疫标记。代表性图像（左面板）。免疫阳性细胞的定量（右侧面板；来自3只小鼠/组的3个随机选择区域的平均值）。单向方差分析，然后是Tukey的多重比较测试。

**图6。HS-276抑制博莱霉素诱导的肺纤维化。**
C57BL/6小鼠被随机分为4个治疗组，并在第22天实施安乐死，然后采集肺部。(一)H&E染色。代表性图像。比例尺：200μm。(B类)羟脯氨酸化验，左肺(n个= 3–4). 结果为平均值±扫描电镜（SEM）。单向方差分析（ANOVA），然后是Tukey的多重比较测试。(C类–E类)肺切片用磷酸化TAK1（比例尺：10μm）、CD45（比例尺：50μm），F4/80（比例竿：50μm）和DAPI（蓝色）抗体进行免疫标记。代表性图像（左面板）；免疫阳性细胞的定量（右图，来自4只小鼠/组的3个随机选择的区域）。单向方差分析，然后是Tukey的多重比较测试。

**图7。HS-276治疗缓解了既定的皮肤和肺纤维化。**
C57BL/6小鼠每天皮下注射PBS或博莱霉素，并在第14天开始每天腹腔注射HS-276（25 mg/kg）。研究持续到第28天，对小鼠实施安乐死，并采集皮肤和肺部进行分析。(一)皮肤三色斑点，代表性图像。比例尺：200μm。(B类)皮肤厚度（平均值±SEM，8次测定/hpf，n个= 4–7). 单向方差分析，然后是Tukey的多重比较测试。(C类)肺切片H&E染色，代表性图像。比例尺：200μm。(D类)羟脯氨酸分析，左肺(n个= 2–3). 单向方差分析，然后是Tukey的多重比较测试。

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[10] Yamaguchi K等人。鉴定MAPKKK家族的一个成员作为TGF-β信号转导的潜在介质。科学。1995;270(5244):2008–2011. doi:10.1126/science.270.5244.2008。-内政部-公共医学

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