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.2023年6月9日；14(6):356.
doi:10.1038/s41419-023-05868-z。

HNF4A-BAP31-VDAC1轴同步调控胃癌细胞增殖和凋亡

周庆庆 # 1, 刘腾飞 # 2, 钱文静 # 三, Jun Ji公司 4, 屈才 1, 杨炳金 1, 金陵江 1, Jun Zhang（张军） 5
附属公司

HNF4A-BAP31-VDAC1轴同步调控胃癌细胞增殖和凋亡

周庆庆等。 细胞死亡病. .

摘要

B细胞受体相关蛋白31（BAP31）与肿瘤进展密切相关，而BAP31在胃癌中的作用和机制尚不清楚。本研究探讨BAP31在GC组织中上调，高表达表明GC患者生存率低。BAP31基因敲除抑制细胞生长并诱导G1/S期阻滞。此外，BAP31的减弱增加了膜的脂质过氧化水平，促进了细胞的铁凋亡。BAP31通过与VDAC1直接结合调节细胞增殖和铁凋亡，并影响VDAC1寡聚和多泛素化。HNF4A在启动子处与BAP31结合并增加其转录。此外，在体内和体外，BAP31的敲低倾向于使GC细胞易受5-FU和凋亡诱导剂橡皮素的攻击。我们的研究表明，BAP31可能是胃癌的预后因素，并可能成为胃癌的潜在治疗策略。

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数字

图1
图1。BAP31表达增加的GC提示预后较差。
A类在GC组织和来自TCGA数据的非癌胃组织中分析BAP31。B类利用TCGA数据集分析BAP31在不同GC分期和淋巴结转移中的表达。C类使用GSE66229数据集分析胃癌组织和非癌胃组织中BAP31的表达。天western blot分析胃癌组织与非癌胃组织中BAP31的表达。E类显示GC组织和相应的非癌组织中BAP31水平的代表性IHC图像。F类图示BAP31中上调、不变和下调的比例的饼图，用于比较GC组织和非癌组织。G公司159例BAP31表达差异的GC患者总生存率的Kaplan-Meier分析。单变量(H（H）)和多元(我)采用Cox比例风险分析法评估BAP31在GC中的HR*对 < 0.05, **对 < 0.01.
图2
图2。BAP31促进GC细胞生长。
A类Western blot检测GC细胞株BAP31的内源性水平。B类Western blot检测BAP31在过度表达的GC细胞中的表达。C类采用CCK8分析评估BAP31过度表达对GC细胞生长的影响。天采用集落形成实验评估BAP31过度表达对GC细胞生长的影响。E类Western blot检测BAP31基因敲除的GC细胞中BAP31的表达。F类采用CCK8法评估BAP31敲除对GC细胞生长的影响。G公司采用集落形成实验评价BAP31基因敲除对GC细胞生长的影响。H（H）流式细胞术检测BAP31敲除GC细胞的细胞周期分布。我Western blot检测BAP31敲除GC细胞的细胞周期相关蛋白。EdU分析用于评估BAP31过度表达的GC细胞的生长(J型)或BAP31击倒(K（K）). *对 < 0.05, **对 < 0.01.
图3
图3。BAP31的衰减促进脂质过氧化和铁沉积。
A类–C类流式细胞术检测BAP31过表达或敲除条件下GC细胞的ROS荧光，并用橡皮素（5μM）预处理细胞12 h。天–F类用橡皮素（5μM）预处理BAP31过表达或BAP31敲除的GC细胞12 h，并检测脂质ROS的产生。G公司共聚焦成像检测用橡皮素（5μM）预处理12 h的GC细胞在BAP31敲除下的脂质过氧化。H（H）用橡皮素（5μM）预处理12 h后，BAP31过度表达或BAP31敲低GC细胞，并评估MDA含量。我,J型在有或无2μmol/L Fer-1的情况下，用橡皮素（5µM）预处理BAP31敲低GC细胞12 h，然后观察脂质ROS的产生。K（K）在存在或不存在2μmol/L Fer-1的情况下，用橡皮素（5µM）预处理GC细胞12 h，并测定MDA含量*对 < 0.05, **对 < 0.01.
图4
图4。BAP31的敲除使GC细胞对铁下垂诱导剂橡皮素敏感。
A类用BAP31敲除法分析AGS和NCI-N87细胞中橡皮素的IC50。B类热图显示GC细胞对5μM erastin的协同反应与BAP31的衰减相结合。C类克隆形成分析显示，erastin（5μM，10μM）与GC细胞中BAP31的衰减发生协同反应。天裸鼠皮下异种移植模型和注射方案。将转染shNC或shBAP31的NCI-N87细胞皮下注射到裸鼠的两侧，裸鼠在不使用或使用橡皮素的情况下，观察肿瘤的典型解剖图像(E类)，肿瘤重量(F类)和肿瘤生长曲线(G公司)老鼠。H（H）在分离的肿瘤组织中进行Ki-67和PTGS2的HE和IHC分析。我测量上述小鼠的体重*对 < 0.05, **对 < 0.01.
图5
图5。BAP31与VDAC1相互作用并影响其蛋白质稳定性。
A类利用STRING数据库预测与BAP31相互作用的蛋白质。B类免疫沉淀法检测BAP31与VDAC1的关系。C类,天通过免疫荧光分析观察BAP31和VDAC1之间的相互作用。E类Western blot用于评估BAP31过度表达或BAP31敲低GC细胞中VDAC1的蛋白水平。F类BAP31过表达组和对照组用环己酰亚胺（CHX）预处理，然后检测VDAC1蛋白水平。G公司BAP31过表达组和对照组用MG132预处理6h，检测VDAC1蛋白水平。H（H）在BAP31过表达组和对照组中VDAC1的泛素化。我我们减弱AGS和NCI-N87中的BAP31，并分别用DMSO或VBIT-12处理。然后，收集各组细胞，并在乙二醇双（琥珀酸丁二酰亚胺）存在下培养至交联蛋白，然后进行western blot以评估VDAC1的寡聚状态。箭头表示VDAC1的单体和二聚体形式。星号表示分子内交联带。在存在或不存在10µM VBIT-12（VDAC1齐聚抑制剂）的情况下，用橡皮素（5µM）预处理BAP31敲除GC细胞12小时，其中脂质ROS产生(J型)和MDA含量(K（K）)进行了化验。L（左）在转染VDAC1 WT或两个泛素化突变体（VDAC1 K274R和Poly-KR）的BAP31过度表达细胞中检测到BAP31和VDAC1的表达。转染VDAC1 WT或用橡皮素（5µM）处理两个泛素化突变体12小时的BAP31-过表达GC细胞，其中脂质ROS产生(M（M）)和MDA含量(N个)进行了测试。无统计学意义（p>0.05）*对 < 0.05, **对 < 0.01.
图6
图6。HNF4A与BAP31启动子结合并增强BAP31转录。
A类,B类在HNF4A过表达或敲低的GC细胞中检测BAP31的mRNA和蛋白水平。C类在转染BAP31 shRNA的HNF4A过表达细胞中检测到HNF4A和BAP31的水平。天–F类用橡皮素（5µM）处理BAP31 shRNA 12 h后，测定HNF4A过表达细胞中的脂质ROS和MDA含量。G公司用BAP31启动子不同截短片段转染HEK-293T和NCI-N87细胞，评估其相对荧光素酶活性。H（H）在JASPAR中预测了HNF4A结合基序。我JASPAR分析显示BAP31启动子区内有两个潜在的HNF4A结合位点（得分>10）。J型HEK-293T和NCI-N87细胞转染不同截短的BAP31启动子，分别在HNF4A过表达或敲除的情况下，评估相对荧光素酶活性。K（K）,L（左）在HNF4A过度表达或敲除的情况下，分别评估用BAP31荧光素酶报告载体（野生型或HNF4A-结合位点突变，-1495/-1483 bp）处理的HEK-293T和NCI-N87细胞中的相对荧光素酶活性。M（M）琼脂糖电泳用于HNF4A与BAP31启动子结合的ChIP分析。N个BAP31启动子处HNF4A结合的ChIP-qPCR分析。O（运行）胃癌组织中BAP31和HNF4A表达的Western blot分析(n个 = 28).P（P）使用TCGA数据集分析GC组织中HNF4A和BAP31之间的关系（R=0.28，对 < 0.001). *对 < 0.05, **对 < 0.01.
图7
图7。BAP31的敲除使GC细胞对5-FU敏感，5-FU与橡皮素结合可增强抗肿瘤作用。
A类,B类分析BAP31敲低的AGS和NCI-N87细胞中5-FU的IC50。C类,天在AGS和NCI-N87细胞中，热图显示了对5μg/ml 5-FU与BAP31敲除的协同反应。E类,F类克隆形成分析显示，在AGS和NCI-N87细胞中，5-FU（5μg/ml，10μg/ml）与BAP31敲除联合作用具有协同效应。G公司–J型CCK8和克隆形成试验表明，与AGS和NCI-N87中的单一处理相比，橡皮素与5-FU联合处理对细胞生长具有更高的抑制作用*对 < 0.05, **对 < 0.01.
图8
图8。HNF4A-BAP31-VDAC1轴的示意图，该轴同步调节胃癌中的增殖和铁凋亡。
HNF4A直接与BAP31启动子结合并增强其转录。BAP31促进细胞增殖，抑制脂质过氧化和铁沉积。BAP31过表达通过泛素蛋白酶体途径直接诱导VDAC1蛋白降解，促进GC进展。shBAP31可以抑制BAP31的翻译，增强铁凋亡诱导剂橡皮素的抗肿瘤作用，这可能是一种很有前景的抗肿瘤治疗策略。
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