Evolution of Mycobacterium abscessus in the human lung: Cumulative mutations and genomic rearrangement of porin genes in patient isolates

doi:10.1080/21505594.2023.2215602

.2023年12月；14(1):2215602.

doi:10.1080/21505594.2023.2215602。

的演变脓肿分枝杆菌人类肺部：患者分离物中孔蛋白基因的累积突变和基因组重排

附属公司

¹美国马里兰州贝塞斯达NIH临床中心检验医学部微生物学服务。
²美国马里兰州大学巴尔的摩医学院微生物与免疫学系基因组科学研究所。
^三美国马里兰州贝塞斯达NIH国家过敏和传染病研究所临床传染病实验室（LCID）。
⁴美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学儿科传染病。
⁵华盛顿大学医学中心肺和危重病护理医学部，西雅图，华盛顿州，美国。
⁶美国德克萨斯州泰勒市德克萨斯大学健康科学中心分枝杆菌/诺卡氏菌实验室。
⁷英国伯明翰阿拉巴马大学微生物系。
⁸美国国立卫生研究院心肺血液研究所肺分院慢性气道感染实验室，美国马里兰州贝塞斯达。

PMID： 37221835
PMCID公司：项目编号：1243398
内政部： 10.1080/21505594.2023.2215602

的演变脓肿分枝杆菌人类肺部：患者分离物中孔蛋白基因的累积突变和基因组重排

沙米拉·沙洛姆等。毒力. 2023年12月.

.2023年12月；14(1):2215602.

doi:10.1080/21505594.2023.2215602。

附属公司

¹美国马里兰州贝塞斯达NIH临床中心检验医学部微生物学服务。
²美国马里兰州大学巴尔的摩医学院微生物与免疫学系基因组科学研究所。
^三美国马里兰州贝塞斯达NIH国家过敏和传染病研究所临床传染病实验室（LCID）。
⁴美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学儿科传染病。
⁵华盛顿大学医学中心肺和危重病护理医学部，西雅图，华盛顿州，美国。
⁶美国得克萨斯州泰勒市得克萨斯大学健康科学中心分枝杆菌/诺卡氏菌实验室。
⁷英国伯明翰阿拉巴马大学微生物系。
⁸美国马里兰州贝塞斯达NIH国家心肺与血液研究所（NHLBI）肺科慢性呼吸道感染实验室。

PMID： 37221835
PMCID公司：项目编号：1243398
内政部： 10.1080/21505594.2023.2215602

摘要

背景： 脓肿分枝杆菌亚种大规模的(M。 大规模的)越来越被认为是一种新出现的细菌病原体，尤其是在囊性纤维化（CF）患者和CF中心的呼吸道疫情中。我们对来自两名慢性肺结核分枝杆菌感染导致死亡的CF患者（1S和2B）的15个系列分离物的基因组和表型变化进行了表征，以及来自CF中心暴发的4个分离物的基因和表型变化，其中患者2B是指标病例。

结果：比较基因组分析揭示了影响生长速率、代谢、转运、脂质（糖肽多肽损失）、抗生素敏感性（大环内酯类和氨基糖苷类耐药性）和毒力因子的突变。23S rRNA突变，基质金属蛋白酶4、孔蛋白基因座和泰特R基因出现在两名CF患者的分离株中。有趣的是，我们在分枝杆菌孔蛋白位点发现了两种不同的自发突变事件：患者1S中两个串联孔蛋白副序列的融合和患者2B中第一个孔蛋白副片段的部分缺失。这些基因组变化与孔蛋白表达减少、¹⁴分枝杆菌感染的THP-1人细胞中的C-葡萄糖摄取、细菌生长速度减慢和TNF-α诱导增强。部分恢复的孔蛋白突变体的孔蛋白基因互补¹⁴C-葡萄糖摄取、生长速率和TNF-α水平与完整的孔蛋白菌株相比。

结论：我们假设特定突变在M。 大规模的包括在可传播菌株之间共享的突变，共同导致CF患者和其他易感宿主中产生更具毒性、适应宿主的血统。

关键词：脓肿分枝杆菌；块状分枝杆菌；波林；囊性纤维化；免疫反应；全基因组测序。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人没有报告任何潜在的利益冲突。

数字

**图1。**
患者1S的分离物和时间轴：四个患者分离物的菌落形态图片按时间顺序显示：1S-1、1S-2、1S-3和1S-4。上面板是放大10倍的菌落图片，下面板是放大100倍的单个菌落。分离物1S-1、1S-2和1S-3具有光滑的形态，而分离物1S–4虽然稍有粗糙，但表面光滑。患者1S的隔离物收集时间约为5年。在疾病过程的后期，大约在分离物1S–3出现时开始抗生素治疗。

**图2。**
患者2B的分离物和时间轴：11个患者分离物的菌落形态图按时间顺序显示为2B-1、2B-2、2B-3、2B-4、2B-5、2B-6、2B-7、2B-8、2B-9、2B-10、2B-11。前六个分离物是光滑的。菌株2B-6（光滑）和2B-7（粗糙）在同一培养基中共培养。分离物2B-7至2B-11很粗糙。上部面板是放大10倍的菌落图片；下面板显示100倍放大的单个菌落。患者2B的分离物收集时间约为8年。当分离出第一个分离物2B-1时，开始进行抗生素治疗。

**图3。**
邻接系统发育树：基于脓肿分枝杆菌基因组全基因组多重比对的系统发育树。使用Mugsy对分枝杆菌基因组进行比对，并使用Phylomark对核心片段进行鉴定。患者1S分离株为蓝色，患者2B分离株为洋红色。患者2B的疫情分离物呈橙色。参考基因组以黑色显示。

**图4。**
患者1S中Porin基因座的重组突变：（a）患者1S分离株中Porin-基因座的示意图。患者1S的前三个分离物（1S-1至1S-3）具有两个完整的孔蛋白基因拷贝；最后一个分离物（1S–4）具有从第一个孔蛋白基因拷贝到第二个孔蛋白蛋白基因拷贝的99 bp到573 bp的帧内融合。（b）孔蛋白位点的PCR扩增。通过凝胶电泳对PCR产物进行分析，发现完整的孔蛋白分离物（1S-1、1S-2和1S-3）有~1.6kb和~0.5kb的产物，而孔蛋白突变分离物1S-4只有~0.4kb的片段。（c）孔蛋白表达1S分离物的蛋白提取物通过SDS-PAGE进行解析，然后使用多克隆抗孔蛋白（MspA）抗体进行western blot。分离物1S–4的孔蛋白表达显著降低。

**图5。**
患者2B中孔蛋白基因座的部分缺失突变：（a）患者2B分离物中孔蛋白位点的示意图。患者2B的前四个分离物（2B-1至2B-4）有两个完整的孔蛋白基因拷贝；最后7个分离物（2B-5至2B-11）在第一个孔蛋白副序列的5’端有约140bp的缺失，上游有489bp的缺失。（b）孔蛋白位点的PCR扩增。通过凝胶电泳对患者2B和西雅图疫情分离株的PCR产物进行分析，结果表明，完整基因座的分离株为~1.5kb，孔蛋白突变株为~0.6kb。（c）通过SDS-PAGE和western blot使用多克隆抗孔蛋白（MspA）抗体解析2B分离物的孔蛋白蛋白表达蛋白提取物。分离物2B-5至2B-11的孔蛋白表达显著降低。

**图6。**
（a）孔蛋白补体1S–4菌株的孔蛋白表达。用抗孔蛋白（MspA）抗体对补充了孔蛋白基因座或载体控制的分离物1S-1、1S-4和1S-4进行Western blot。（b）用抗Porin（MspA）抗体对补充了Porin位点或载体控制的菌株2B-1、2B-5、2B-11和2B-5以及2B-11进行了Porin蛋白表达。

**图7。**
感染患者S1株和补体孔蛋白株的THP-1细胞的细胞因子反应：使用基于珠的细胞因子分析在24 h培养上清上测定TNF-α水平（pg/ml）。结果是总共5个独立实验的平均值±SEM。1S-4与含孔蛋白质粒（1S-4孔蛋白）互补导致TNF-α减少（*p值0.0160，FDR为0.05）。

**图8。**
感染患者2B株和补体孔蛋白株的THP-1细胞的细胞因子反应：使用基于珠的细胞因子分析在24 h培养上清上测定TNF-α水平（pg/ml）。结果是总共5个独立实验的平均值±SEM。与第一株2B-1相比，患者2B最后一株2B-11的TNF-α水平显著升高（****p值0.0001，FDR为0.05）。2B-11的孔蛋白互补导致TNF-α减少（**p值0.0040，FDR为0.05）。

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