Impact of Translocator Protein 18 kDa (TSPO) Deficiency on Mitochondrial Function and the Inflammatory State of Human C20 Microglia Cells

doi:10.3390/cells12060954

.2023年3月21日；12(6):954.

doi:10.3390/cells12060954。

转运蛋白18kDa（TSPO）缺乏对人C20小胶质细胞线粒体功能和炎症状态的影响

斯蒂芬妮·贝德¹, 蒂亚·沃尔费尔¹, 塔贾娜·扬纳¹, 卡罗琳·诺德弗特¹, Rainer Rupprecht公司¹, 弗拉基米尔·米伦科维奇¹, 克里斯蒂安·韦策尔¹

附属公司

PMID： 36980295
预防性维修识别码：项目经理10046935
内政部： 10.3390/单元12060954

转运蛋白18kDa（TSPO）缺乏对人C20小胶质细胞线粒体功能和炎症状态的影响

斯蒂芬妮·贝德等。细胞. 2023.

.2023年3月21日；12(6):954.

doi:10.3390/cells12060954。

作者

斯蒂芬妮·贝德¹, Thea Würfel剧院¹, 塔贾娜·扬纳¹, 卡罗琳·诺德弗特¹, Rainer Rupprecht公司¹, 弗拉基米尔·米伦科维奇¹, 克里斯蒂安·韦策尔¹

附属

¹德国雷根斯堡93053，雷根斯伯格大学精神病学和心理治疗系。

PMID： 36980295
预防性维修识别码：项目经理10046935
内政部： 10.3390/单元12060954

摘要

小胶质细胞是中枢神经系统的常驻免疫细胞。在刺激出现时，小胶质细胞从静止状态极化为激活状态。小胶质细胞转运体蛋白18kDa（TSPO）被认为是炎症的标志物。在这里，我们通过研究TSPO缺乏对人类小胶质细胞的影响来表征TSPO的作用。我们使用人类C20小胶质细胞系的TSPO敲除（TSPO-/-）变体。我们发现与对照细胞相比，TSPO-/-细胞中TSPO-associated protein VDAC1显著减少。此外，我们评估了TSPO缺乏对钙水平和线粒体膜电位的影响。TSPO-/-细胞系中细胞液和线粒体钙浓度增加，而线粒体膜电位趋于降低。通过RT-PCR对线粒体DNA拷贝数的评估显示，与对照组相比，TSPO-/-细胞中线粒体DNA的数量减少。此外，C20细胞的代谢谱强烈依赖于糖酵解途径。然而，TSPO耗竭并未影响细胞代谢谱。促炎介质mRNA表达水平的测量显示，TSPO缺失细胞对促炎刺激的反应减弱，这意味着TSPO蛋白在小胶质细胞极化过程中发挥作用。

关键词：CRISPR/Cas9；氧磷；钙显像；糖酵解；炎症；代谢谱；线粒体；呼吸测定；易位蛋白18 kDa。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
TSPO−/−和对照C20细胞系中的mtDNA拷贝数。数据以六个RT-PCR±SEM的单个值表示（n=3个生物复制品）。与对照细胞相比，TSPO-KO中的mtDNA拷贝数显著减少（星号表示显著性第页= 0.0003; 韦尔奇纠正了t吨-测试）。

图2
VDAC1在C20人小胶质细胞、TSPO−/−和对照细胞系中的表达。(A类)Western blot显示管家基因β-微管蛋白为55 kDa、VDAC1为34 kDa和TSPO为18 kDa。TSPO−/−细胞系在18 kDa时无可见带。(B类)在对照和TSPO−/−细胞系中，VDAC1的相对表达归一化为β-微管蛋白的表达。在KO细胞系中VDAC1的相对表达显著降低（平均值±SEM，n=3个生物复制；star表示显著性第页< 0.05).

图3
细胞质和线粒体钙²⁺对照组和TSPO缺乏的人C20小胶质细胞中的水平。TSPO缺乏对细胞溶质的影响(A类)和线粒体钙²⁺水平(B类). Fura-2比率(A类)和Rhod-2荧光强度(B类)与对照组相比，TSPO−/−细胞显著增加。所示为单个值和n=3个实验的平均值。(C类)示例图像显示加载了Fura-2/AM和Rhod-2/AM的细胞。比例尺：20µm。星星表示意义第页< 0.0001.

图4
C20小胶质细胞大小。通过计算加载Fura-2后显示的像素数来评估C20小胶质细胞的面积(A类)（CTRL 1498±21.86 vs.KO 1213±15.97；第页< 0.0001; n=3；Mann–Whitney U测试）。指示加载Fura-2细胞的示例图像（比率图像），分析的感兴趣区域如所示(B类). 比例尺：20µm。星星表示意义。

图5
线粒体膜电位（MMP）。阳离子染料JC-1被线粒体的负膜电位吸引，并在高能量（强超极化MMP）线粒体中形成红色荧光聚集体。JC-1聚集体在MMP还原（去极化）后分解为绿色荧光单体。因此，该比率可用于估计基质金属蛋白酶的极性。(A类)所示为单个值和n=3个实验的平均值（CTRL 1.43±0.032 vs.KO 1.33±0.022；n=3次生物复制；Mann-Whitney U检验）。(B类)显示JC-1负载线粒体的示例图像。比例尺：20µm。ns表示无显著差异。

图6
人C20小胶质细胞ATP含量。TSPO缺乏对ATP含量的影响。数据显示为单个值以及平均值±SEM（n=3）（CTRL 6.246±0.368 vs.KO 6.025±0.389；第页=0.4848，Mann–Whitney U检验）。ns表示无显著差异。

图7
抗霉素A和2-脱氧-D-葡萄糖对TSPO缺陷和对照C20小胶质细胞活力的影响。(A类)抗霉素A（1-10µM）或(B类)用TSPO-缺乏的C20细胞和对照C20细胞的resazurin试验检测2-脱氧-D-葡萄糖（5-300 mM）对细胞活力的影响。数值代表无抗霉素A或2-脱氧-D-葡萄糖条件下的正常生存率。N=6，双向方差分析和Tukey多重比较测试（针对数据和第页值，见补充表S1和S2；星星表示意义）。

图8
抗霉素A和2-脱氧-D-葡萄糖对细胞因子刺激的TSPO-deficient和控制的C20小胶质细胞活性的影响。(A类)抗霉素A（1-10µM）或(B类)用TSPO-缺乏的C20细胞和对照C20细胞的resazurin试验检测2-脱氧-D-葡萄糖（5-300 mM）对细胞活力的影响。用细胞因子混合物TNFα、IL-1β和INFγ（各为1 ng/mL）处理细胞40 h。数值表示在不含抗霉素A或2-脱氧-D-葡萄糖的条件下的正常存活率。用300 mM 2-脱氧-D-葡萄糖处理细胞后，TSPO−/-和对照细胞的活性显著不同(第页=0.0026，t=3991，df=10，未配对t吨-测试）。对于手段和第页值，见补充表S1和S2。星星表示意义。

图9
将TSPO缺乏的人C20小胶质细胞归一化为TSPO表达的对照细胞（在基础/非刺激条件下）中的细胞因子mRNA表达。(A类)肿瘤坏死因子α：1.642±0.358，第页= 0.1330; (B类)IL6:0.744±0.025，第页= 0.0002; (C类)IL1β：0.409±0.053，第页< 0.0001; (D类)IL12A:1.062±0.094，第页= 0.5404; (E类)IL8:0.634±0.119，第页= 0.283; 和(F类)NOS2:0.655±0.130，第页= 0.0571. N=6，韦尔奇修正t吨-测试。星星表示意义。ns表示无显著差异。

**图10**
用细胞因子混合物治疗后（16 h），TSPO缺乏的人C20小胶质细胞和TSPO表达的对照细胞中的细胞因子mRNA表达。数据表示与未刺激/基础条件相关的表达倍数变化：对照(A类)或TSPO−/−电池(B类). N=6，韦尔奇修正t吨-测试。对于数据和第页值，见补充表S3。星星表示意义。

**图11**
用细胞因子混合物治疗后TSPO缺乏和TSPO表达的人C20小胶质细胞中细胞因子mRNA的表达。这些数据与TSPO-表达C20控制的非模拟控制有关（灰色）。(A类)肿瘤坏死因子α：13.71±2.845 vs.81.66±20.32，第页= 0.02; (B类)IL6:1129±119.4对662.7±72.15，第页= 0.0098; (C类)IL1β：219.5±36.70 vs.172.5±6.305，第页= 0.2599; (D类)IL12A:7.301±0.720 vs.4.482±0.521，第页= 0.0112; (E类)IL8:1368±164.3对1378±280.3，第页= 0.9782; 和(F类)NOS2:3.047±0.595对2.668±0.589，第页= 0.663. N=6，韦尔奇修正t吨-测试。星号表示显著性，ns表示非显著性差异。

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