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.2023年2月12日；24(4):3687.
doi:10.3390/ijms24043687。

VDAC1基因敲除通过影响复合物I活性影响线粒体耗氧量触发ETC重排

安德烈亚·马格里 1 2, 萨尔瓦多安东尼奥·玛丽亚·库比西诺 三, 朱塞佩·巴蒂亚托 三, 克里斯蒂亚娜·露西娅·丽塔·利帕里 三, 斯特凡诺·孔蒂·尼巴利 三, 米里亚姆·维萨姆·萨博 4, 亚历山德拉·皮塔拉 4, 安吉拉·玛丽亚·阿莫里尼 4, 维托·德平托 2 三, 安吉拉·梅西纳 1 2
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VDAC1基因敲除通过影响复合物I活性影响线粒体耗氧量触发ETC重排

安德烈亚·马格里等人。 国际分子科学杂志. .

摘要

电压依赖性阴离子选择性通道亚型1（VDAC1）是线粒体外膜（OMM）孔蛋白最丰富的亚型，是离子和代谢物进出细胞器的主要通道。VDAC1还参与许多其他功能，如调节细胞凋亡。虽然该蛋白并不直接参与线粒体呼吸，但它在酵母中的缺失会触发整个细胞代谢的完全重新连接，从而使线粒体的主要功能失活。在这项工作中，我们详细分析了VDAC1基因敲除对近单倍体人类细胞系HAP1线粒体呼吸的影响。结果表明，尽管细胞中存在其他VDAC亚型，但VDAC1的失活与氧消耗的显著损伤和电子传输链（ETC）酶的相对贡献的重新组织相关。准确地说，在VDAC1敲除的HAP1细胞中，复杂的I连接呼吸（N通路）通过从呼吸储备中提取资源而增加。总的来说，这里报告的数据加强了VDAC1作为线粒体代谢的一般调节器的关键作用。

关键词：HAP1细胞；VDAC1淘汰赛；复合物I；线粒体；呼吸储备。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
本研究中使用的HAP1细胞的表型特征(A类)VDAC1基因敲除的图式化：在VDAC1的外显子VI中进行了2 bp的缺失。(B类)亲代和ΔVDAC1细胞总裂解物的代表性Western blotting（左）和相对蛋白水平定量（右），显示了三种VDAC亚型的表达。正如预期的那样，在敲除细胞中未检测到VDAC1蛋白带。N.D.-未检测到。(C类)增殖试验表明样品之间没有显著差异。数据显示为的平均值±SDn个=3个独立计数，通过双向方差分析进行统计分析；ns-不显著。(D类)MTT法的细胞活力分析显示样品之间没有显著差异。(E类)流式细胞术对亲代和ΔVDAC1细胞中MitoTraker信号的定量。观察到大约10%的轻微但显著的差异。中的数据(D类,E类)表示为平均值±SEMn个=3个独立计数，由未配对者进行统计分析t吨-测试，使用**第页< 0.01; ns-不显著。
图2
图2
HAP1细胞的耗氧量。(A类)亲代HAP1细胞线粒体呼吸剖面的代表性曲线，以及用于完整细胞和渗透细胞的SUIT协议。对丙酮酸；苹果酸甲酯；谷氨酸；地高辛；S-琥珀酸酯；鱼藤酮；阿玛霉素。(B类)定量分析ROUTINE、OXPHOS的耗氧率和HAP1细胞中的最大ET容量，以pmol/second/百万细胞表示。与亲代相比，ΔVDAC1细胞在每个状态下的耗氧量都显著降低。数据显示为中位数±SEMn个=6个独立实验，由非配对进行统计分析t吨-测试，使用***第页< 0.001.
图3
图3
暴露于VBIT-12后HAP1细胞的耗氧量。(A类)亲代HAP1完整细胞线粒体呼吸剖面的典型曲线以及此处使用的SUIT协议。为了达到最大呼吸容量，增加了解偶联CCCP。(B类)定量分析先前用VBIT-12或DMSO处理过的HAP1亲代细胞的ROUTINE耗氧率和最大ET容量（对照）。在处理过的细胞中观察到ET容量显著降低。数据表示为每百万个细胞的pmol/second，并显示为n个=6个独立实验。数据通过未配对进行统计分析t吨-测试，使用*第页< 0.05; ns-不显著。
图4
图4
HAP1细胞通量控制比（FCR）分析。(A类)计算并证明了ROUTINE和OXPHOS状态对ET容量的特定贡献，以及呼吸储备（虚线直方图）、E-Reserve和E-Excess。ΔVDAC1细胞的两个FCR值均显著增加，这对应于储备的成比例减少。(B类)针对泄漏状态计算的FCR。亲代和ΔVDAC1细胞之间未检测到显著差异。中的数据(A类,B类)显示为平均值±SEMn个=6个独立实验，并通过未配对进行统计分析t吨-测试，使用**第页<0.01和***第页< 0.001; ns-不显著。
图5
图5
HAP1细胞中N-和S-通路的分析。(A类,B类)在我们的实验HRR装置中ET链活性的示意图。通过Q-连接激活复合物III只能由复合物I或II发生，精确地说是通过用NADH-连接底物刺激复合物I，并且在没有琥珀酸（N-途径，A类)或在鱼藤酮抑制复合物I（S途径，B类). 对丙酮酸盐；苹果酸甲酯；谷氨酸；S-琥珀酸酯；Rot-rotenone公司。(C类)定量分析N-和S-途径的耗氧速率，以百万细胞pmol/second表示。与亲代相比，ΔVDAC1细胞在每种状态下的耗氧量都显著降低。(D类)计算N-和S-通路的FCR显示，ΔVDAC1细胞中N-的增加超过S-通路。数据显示为中位数(C类)或表示(D类)±SEMn个=6个独立实验，由非配对进行统计分析t吨-测试**第页<0.01和***第页< 0.001.
图6
图6
HAP1细胞NADH减少分析。烟酰胺辅因子NAD总量的定量分析+、NADH、NADP+和NADPH(A类)、NAD比率+/NADH公司(B类)和乳酸的总体水平(C类). ΔVDAC1细胞中较低水平的烟酰胺辅因子被高NAD比例抵消+/NADH值。使用亲代HAP1作为对照，数据表示为倍增长。数据显示为中位数±SEMn个=4个独立实验，由非配对进行统计分析t吨-测试，使用**第页< 0.01; ns-不显著。
图7
图7
通过HRR分析HAP1细胞对复合I和II抑制剂的敏感性(A类)除此处使用的SUIT协议外，亲代HAP1完整细胞线粒体呼吸曲线的代表性曲线。在CCCP达到ET容量后，通过鱼藤酮滴定法（1-16 nM）监测呼吸。(B类)鱼藤酮滴定后ET容量的定量分析显示亲代和ΔVDAC1细胞的ET容量均减少。然而，与亲代细胞相比，ΔVDAC1细胞对鱼藤酮的敏感性增加。(C类)除了用于丙二酸滴定的SUIT方案（0.1–1.6μM）外，亲代HAP1完整细胞的线粒体呼吸谱的代表性曲线。(D类)定量分析表明用丙二酸滴定时ET容量降低。亲代和ΔVDAC1细胞的呼吸测定曲线无显著差异。中的数据(B类,D类)显示为平均值±SEMn个=3个独立实验，通过双向方差分析进行统计分析**第页<0.01和***第页< 0.01.
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赠款和资金

本研究由PIACERI（授权号ARVEST）和概念证明（授权号PEPSLA POC 01_00054）资助，授予A.Messina，PIACERI（授权号VDAC）和CHANCE，授予V.D.P。