跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

HTTP服务器

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并且被安全地传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2023年1月28日；14(1):455.
doi:10.1038/s41467-023-36081-3。

突触素凝聚物中不同囊泡相的突触囊泡蛋白和ATG9A自组织

大顺公园 1 2 三 4, 吴玉梅 1 2 三 4, 王新波 1 2 三 4, 斯威莎·戈瑞珊卡 5, 亚伦·鲍布利斯 6, 彼得罗·德·卡米利 7 8 9 10 11
附属公司

突触素凝聚物中不同囊泡相的突触囊泡蛋白和ATG9A自组织

大顺公园等。 国家公社. .

摘要

突触素1和突触素在成纤维细胞中的异位表达足以产生囊泡的浓缩物，这些囊泡高度类似于突触囊泡（SV）簇并具有液相性质。这里我们发现，与突触素不同的是，其他主要的SV膜蛋白不能与突触素形成凝聚物，而是在这个异位表达系统中共同组装成突触素和突触素所形成的簇。另一种囊泡膜蛋白，ATG9A，在突触处经历活性依赖性外吞作用，提出了关于ATG9A流量与SV流量之间关系的问题。我们发现，在成纤维细胞和神经末梢中，ATG9A并没有共同组装成突触素阳性小泡凝集物，而是定位在一类不同的小泡上，这些小泡也与突触素组装，但处于不同的阶段。我们的研究结果表明，ATG9A相对于SV蛋白经历了不同的分类，并指出突触蛋白在控制SV和ATG9A囊泡突触聚集中的双重作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

P.D.C.是Casma Therapeutics科学咨询委员会的成员，但声明与本研究没有竞争利益。其他作者没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。突触体素和突触素凝聚物招募其他SV蛋白。
一用mCherry-synapsin 1a（Syn）和其中一种蛋白共同转染COS7细胞，如图所示：突触素（Syph）（未标记）、VAMP2-pHfluorin（VAMP2-pH）、EGFP-SCAMP5、突触素1-EGFP（SYT1-EGFP）、囊泡谷氨酸转运体1-pHflu orin（vGluorin-pH）、囊膜GABA转运体-pHfluoin（vGAT-pH），EGFP-Rab3A，和转铁蛋白受体pH氟（TfR-pH）。免疫荧光显示未标记的突触体素。只有同时表达mCherry-synapsin和synaptophysin的细胞才会出现大液滴。b条将表达突触体素和mCherry-synapsin的COS7细胞暴露于10μg/ml霍乱毒素结合型HRP（CTX-HRP）中36 h，然后固定、处理HRP反应性并包埋用于透射电镜（TEM）。黑色囊泡是由内吞示踪剂CTX-HRP标记的囊泡。c（c）将突触素、mCherry-synapsin和另一种荧光融合蛋白三重转染COS7细胞，如场a中的一样。注意，所有SV蛋白和转铁蛋白受体共同组装成突触素和mCherry synapsins形成的液滴。另请参见补充图1。比例尺，一 = 20微米，b条 = 500 mm（顶部）和200 nm（底部），c（c） = 20微米。
图2
图2。成纤维细胞中囊泡簇和培养神经元中SV簇的液相性质。
一–e（电子）如图所示转染COS7细胞。a、 液滴融合。b条–d日单个液滴光漂白后EGFP-SCAMP5和mCherry突触蛋白的荧光恢复。数据表示为平均值±SD(n个 = 5滴）**第页 < 0.01，由双边学生吨-测试。e（电子）经1,6-己二醇处理后，COS7细胞中含有VAMP2-pH、mCherry-synapsin和突触素（未标记）的液滴可逆分散。（f）表达EGFP-SCAMP5和mCherry-synapsin的海马神经元培养物的实时荧光成像，用1,6-己二醇处理5分钟，然后清洗。这幅漫画显示了被检测神经元的区域。克mCherry-synapsin在添加1,6-己二醇前和添加1,6-己二酚后1分钟在突触前突触体和侧翼轴突区域（距每个突触体中心±1.45μm）的强度。小时mCherry-synapsin荧光强度在以数字表示的区域的统计比较克值为四个独立实验的平均值±SEM（分析了45个布顿）**第页 < 0.01（双面配对）吨-测试。我分析了1,6-己二醇处理前和洗脱10分钟后mCherry-synapsin的定位。数值为三个独立实验的平均值±SEM（分析了121μm x 121μm场中的所有波顿）。j个对照组和1,6-己二醇处理（1分钟）的神经元培养物固定用于TEM。k个高钾刺激突触前神经束的归一化平均vGlut-pH荧光强度分布+存在或不存在1,6-己二醇。数值为四个独立实验的平均值±SEM（分析了160磅）。我峰值vGlut-pH荧光强度值用于统计比较。数值为平均值±SD；N.S.，不显著**第页 < 0.01. 双面成对吨-对显著的单向重复测量值进行了方差分析（分析了4个独立实验中的160桶）。源数据以源数据文件的形式提供。比例尺，一和b条 = 2微米，e（电子）和（f） = 10μm（底部为2μm），克 = 1微米，j个 = 500纳米。第页-值(d日): 9.100 × 10‒5. (小时): 5.254 × 10‒4（左），6.896×10‒3（右）。(我)：0（1对2），0.7142（1对3），0（2对3）。
图3
图3。ATG9A-EGFP与mCherry突触蛋白的共表达导致小泡簇。
一,b条ATG9A-EGFP单独表达(一)或使用mCherry-synapsin 1a(b条)在COS7细胞中。c（c）共表达ATG9A-EGFP和mCherry-synapsin的COS7细胞的相关光电子显微镜（CLEM）。左：箭头指向荧光和EM图像中ATG9A-EGFP和mCherry-synapsin阳性的液滴。右：1号液滴的高倍EM图像。d日当这两种蛋白与突触素独立表达时，ATG9A和突触素小泡的大小分布。方框图显示中线（中线）、25/75百分位（方框）和SD（胡须）。数据表示为平均值±标准偏差。每组测量1000个囊泡（来自三个独立实验）**第页 < 0.01，由双边学生吨-测试。e（电子）将共表达ATG9A-EGFP和mCherry-synapsin的COS7细胞在37℃下用10μg/ml霍乱毒素结合HRP（CTX-HRP）处理1 h（左）或36 h（右），然后固定以进行TEM。（f）突触素和ATG9A示意图。pI=等电点。IDR：内在无序区（突触蛋白的C末端区）。克从Expi293细胞中纯化出N末端3xFlag结合的SBFP2-synapsin（全长）和ATG9A-Ct（仅C末端区域：523–839 aa）-mCherry，并用SDS-PAGE和考马斯蓝染色进行分析。小时将纯化的突触蛋白和纯化的ATG9A-Ct共同组装成液滴。在含有25 mM Tris-HCl（pH 7.4）、0.5 mM TCEP、7%PEG和100 mM或1000 mM NaCl的缓冲液中混合3xFlag-SBFP2-突触素（7.5μM）和3xFlage-ATG9A Ct-M樱桃（2μM）。增加NaCl浓度会导致液滴分散。源数据作为源数据文件提供。比例尺，一和b条 = 20微米，c（c） = 5μm（左）或200 nm（右），e（电子） = 200纳米，小时 = 5微米。第页-价值(d日): 4.109 × 10‒5.
图4
图4。突触素和ATG9A在突触素期内以不同的囊泡簇分离。
将突触素（未标记）、ATG9A-EGFP和mCherry-synapsin三重共转染COS7细胞。一–c（c）典型共焦图像(一)，以及相应的液滴线扫描分析(b条,c（c）)显示突触素相包括两个不同的亚相，分别含有突触素和ATG9A-EGFP。免疫荧光显示突触素。mCherry-synapsin荧光强度在突触素阶段更强烈，如d日.d日所示的蛋白质对的共定位是通过皮尔逊系数计算的。数值为平均值±SD**第页 < 使用Tukey的HSD事后测试进行单向方差分析，结果为0.01（分析了10个不同细胞中的液滴）。e（电子）将突触体素、ATG9A-EGFP和mCherry-synapsin共表达的COS7细胞与10μg/ml霍乱毒素结合HRP（CTX-HRP）孵育36 h，然后固定用于相关光电子显微镜（CLEM）。插图中的绿色虚线表示mCherry-synapsin凝聚物中的ATG9A-EGFP阳性区域。注意，突触素和ATG9A小泡的大小略有不同。（f）–小时ATG9A、突触素和突触素液滴的动力学：（f）通过1,6-己二醇处理实现可逆分散。另见补充视频4；克融合；小时光漂白后的荧光恢复。源数据作为源数据文件提供。比例尺，一 = 2μm（嵌入式为1μm），e（电子） = 1μm（低磁阻和插入）或500 nm（高磁阻），（f） = 5微米，克和小时 = 2微米。第页-值(d日)：0[（ATG9A vs.Syph）vs.（Syph vs.Syn）]，2.009×10‒5[（ATG9A vs.Syph）vs.（ATG9 A vs.Sync）]，1.270×10‒4[（Syph vs.Syn）vs.（ATG9A vs.Syn）]。
图5
图5。ATG9A和突触素小泡的蛋白质组分析。
一–c（c）使用miniTurboID（mTB）对突触素和ATG9A小泡进行邻近标记。一实验设计。b条生物素化蛋白在链亲和素磁珠上亲和纯化，并通过SDS-PAGE和IRDye680链亲和素印迹进行检测。另请参见补充图8a–c。c、 LC-MS/MS鉴定的蛋白质火山图。显著点击(第页-值<0.05，绝对折叠变化>1.5）以绿色（富含ATG9A）或蓝色（富含突触素）表示。第页-值由双侧配对的Student’s吨-测试。蛋白质列表见补充数据1。d日–（f）抗HA磁珠上突触素-HA和ATG9A-HA囊泡的免疫分离。d日实验设计。e（电子）在抗HA磁珠上免疫分离出一个小的囊泡富集细胞组分。然后通过SDS-PAGE和抗HA抗体的免疫印迹对蛋白质进行溶解和处理。另请参见补充图8d–f。（f）火山图显示富含ATG9A-HA或突触素HA囊泡的蛋白质。重大点击(第页-值<0.05，绝对折叠变化>1.5）以绿色（富含ATG9A）或蓝色（富含突触素）表示。第页-值由双侧配对的Student’s吨-测试。蛋白质列表见补充数据1。克使用SynGO工具对蛋白质组进行本体分析，显示SV蛋白在突触素-HA中富集，但在ATG9A-HA免疫分离样品中不富集。颜色代表丰富问-值（–log10值）。生物三倍体的定量LC-MS/MS数据。源数据作为源数据文件提供。
图6
图6。验证ATG9A和突触素小泡的蛋白质组分析。
一COS7细胞中VAMP2-mCherry与ATG9A-EGFP的分离也表达突触素和突触素。免疫荧光显示突触素。b条通过皮尔逊系数计算所示蛋白质对的共定位。数值为平均值±SD；N.S.，不显著**第页 < 使用Tukey的HSD事后测试进行单向方差分析，结果为0.01（分析了3个不同细胞中的液滴）。c（c）ATG9A与SV蛋白（VAMP2、SCAMP5、Rab3A）分离，但在COS7细胞中与VAC14精确共定位，也表达突触素和突触素，这与蛋白质组学数据一致。d日通过皮尔逊系数计算所示蛋白质对的共定位。数值为平均值±标准差；N.S.，不显著**第页 < 通过单向方差分析和Tukey的HSD事后检验得出0.01（分析了每种情况下3个不同细胞中的液滴）。源数据作为源数据文件提供。比例尺，一和c（c） = 10μm（高倍图像为1μm）。第页-值(b条): 3.032 × 10‒6[（Syph vs.VAMP2）vs.（Syph vs.ATG9A）]，7.549×10‒6[（Syph vs.VAMP2）vs.（VAMP2 vs.ATG9A）]，0.07488[（Sypha vs.ATG 9A）vs。d日0.3406（VAMP2 vs.SCAMP5），0.8552（VAMP2vs.Rab3），5.655×10‒5（VAMP2与VAC14），0.7519（SCAMP5与Rab3A），1.546×10‒5（SCAMP5与VAC14），3.116×10‒5（Rab3A与VAC14）。
图7
图7。ATG9A的Y8A突变对其与突触素的分选和分离的影响。
一ATG9A细胞溶质N末端区域的氨基酸序列，带有粗体字符的AP4结合基序。b条表达ATG9A-EGFP（WT）或ATG9A的COS7细胞Y8A型-EGFP和免疫染色的顺高尔基（GM130）和反高尔基（TGN46）标记显示ATG9AY8A型保留在TGN区域，与TGN46共定位。另请参阅补充视频5。c（c）表达ATG9A的COS7细胞的相关光电子显微镜（CLEM）Y8A型-EGFP和mCherry-synapsin，表明ATG9A的积累Y8A型TGN区域（荧光图像中的绿色）与同一区域中大量聚集大小不等的小泡状管状结构有关。一个箭头指向高尔基堆栈。插图显示突触素与ATG9A共定位Y8A型TGN区域，而ATG9A无阳性稀疏液滴第8年因为突触蛋白存在于这个细胞中。d日突触素、突触素和ATG9A-EGFP或ATG9A三重转染COS7细胞Y8A型-EGFP。免疫荧光法检测突触素。在9aY8A型-EGFP未能在突触素凝聚物中形成明显的簇，并与突触素完全混合。e（电子）突触素与ATG9A（WT）或ATG9A的比色分析Y8A型COS7细胞中也表达突触蛋白。数值为平均值±SD**第页 < 0.01由双方学生吨-测试（分析每种情况下5个细胞中的液滴）。（f）转染ATG9A的COS7细胞的CLEM图像第8年-EGFP、VAMP2-m樱桃、突触素和突触素。顶部图像显示了相应的光学显微镜和电磁场，底部图像显示了高倍下2号液滴的细节。源数据作为源数据文件提供。比例尺，b条 = 10μm（插图和放大图像为5μm），c（c） = 1μm（嵌入式为10μm），d日 = 10μm（放大图像为1μm），（f） = 2μm（底部放大图像为200 nm）。第页-价值(e（电子）): 1.322 × 10‒6.
图8
图8。ATG9A囊泡在神经元中的定位。
一–c（c）按照指示转染小鼠海马神经元培养物，并在DIV14-17成像。一用ATG9A-EGFP或mCherry-SCAMP5表达突触素HA的神经元培养物的典型共焦图像（顶部）和相应的线扫描分析（底部）。抗HA免疫荧光法检测突触素-HA。b条根据皮尔逊系数计算的显色分析。数值为平均值±SEM**第页 < 0.01由双方学生吨-测试（对来自两个独立培养物的每种情况的8个视场（121μm x 121μm）中的所有bouton进行定量）。c（c）突触前轴突静脉曲张中ATG9A-EGFP、突触素-HA和mCherry-synapsin的定位。通过抗HA免疫荧光观察突触素-HA。d日–克将小鼠海马神经元培养物固定并染色，如DIV14-17所示，以可视化ATG9A在神经元中的内源性定位。d日,e（电子）显示内源性ATG9A、突触素和VAMP2免疫反应的典型共焦图像(d日)或Rab3A(e（电子）)在培养的海马神经元中。相应的线扫描显示在底部。（f）,克Colocalization分析。数值为平均值±SD；N.S.，不显著**第页 < 通过单向方差分析和Tukey的HSD事后检验得出0.01（分析了来自两个独立培养物的12张图像（每张121μm x 121μm））。源数据作为源数据文件提供。比例尺，一 = 5微米，c（c） = 10μm（高倍图像为1μm），d日和e（电子） = 2μm。第页-值(b条): 9 × 10‒9, (（f）)：0[（Syph vs.VAMP2）vs。(克)：0[（Syph vs.Rab3A）vs。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. 《Synapses》中的De Camilli，P.、Haucke，V.、Takei，K.和Mugnaini，E.（编辑：Cowan，W.M.、Südhof，T.C.、Stevens，C.F.）89-133（约翰·霍普金斯大学出版社，2001年）。
    1. Katz B.克罗尼亚讲座-神经到肌肉的脉冲传输，以及突触动作的亚细胞单位。程序。R.Soc.伦敦。序列号。B.生物。科学。1962;155:455–477.
    1. Heuser JE，Reese TS。青蛙神经肌肉接头释放递质期间突触囊泡膜再循环的证据。《细胞生物学杂志》。1973;57:315–344.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Ceccareli B，Hurlbut WP，Mauro A.青蛙神经肌肉接头处递质和突触小泡的周转。《细胞生物学杂志》。1973;57:499–524.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Saheki Y，De Camilli P.突触囊泡内吞。冷泉港。透视。《生物》2012；4:a005645。-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型