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.2022年10月14日；50(18):10643-10664.
doi:10.1093/nar/gkac806。

一项大规模平行报告分析揭示了神经元中集中且广泛编码的RNA定位信号

马丁·米克尔 1 2, 大卫·埃莱托 1, 马拉克·尼吉姆 2, 李敏炯 1, 阿特菲赫·拉夫齐 1, 法拉·姆哈梅迪 1, 奥利特·戴维 2, 西蒙娜·巴格海赛因 1, 克里斯蒂娜·汉德勒 1, 安德烈亚斯·穆尔 1
附属公司

一项大规模平行报告分析揭示了神经元中集中且广泛编码的RNA定位信号

马丁·米克尔等。 核酸研究. .

摘要

非对称亚细胞mRNA定位允许基因表达的空间调控和功能分区。在神经元中，特定mRNA定位到神经突对细胞功能至关重要。然而，转录物排序是如何以序列特定的方式工作的，这在很大程度上是未知的。在这里，我们结合了亚细胞转录组学和大规模平行报告分析，并测试了约50000个序列定位到神经突的能力。绘制&gt；的本地化潜力；300个基因揭示了实现轴突靶向的两种途径：集中定位基序和广泛编码的定位潜能。我们描述了RNA稳定性和定位之间的相互作用，并确定了能够将定位偏向神经突或胞体的基序，以及它们的作用所需的反作用因子。基于我们的数据，我们设计了能够预测新报告序列定位行为的机器学习模型。在天然mRNA测序数据上测试该预测因子表明，预测的定位潜力与观察到的定位潜力非常一致，这表明我们的MPRA揭示的规则也适用于天然全长转录物的定位。

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数字

图1。
图1。
神经元中RNA定位的大规模平行报告基因测定。(A类)实验大纲。在CMV启动子下游克隆了一个寡核苷酸文库（包含用于扩增的通用引物（2×18nt）、一个5′条形码（12nt）和一个150nt可变的3′UTR区域，并在CMV的启动子下游构建了一个DNA文库绿色荧光粉多聚腺苷化位点的编码序列和上游。对于RNA定位测量（左），将最终的报告文库转染到生长在微孔膜上的分化神经元细胞系中，收集并测序来自胞体和轴突室的报告RNA，从而测量轴突室和胞体室中每个文库变体的富集程度。为了进行RNA稳定性测量，将报告文库转染到分化的神经元细胞系中，然后使用放线菌素D进行转录抑制，并在BC 0、4或24小时后收集并测序报告RNA：条形码；pA位点：聚腺苷化位点。(B)CAD（红色）和Neuro-2a细胞（黄色）中测量的对数FC（突起/胞体）密度图；n个=47 347。(C类)将在CAD细胞中测量的logFC（轴突/胞体）与在Neuro-2a细胞中针对相同序列测量的logFC、针对所有测试序列（浅蓝色，n个=47 347）或仅具有统计学显著富集（神经突或胞体，P（P）=0.05），n个 = 3412). (D类)CAD细胞中测量的logFC（4 h/0 h放线菌素D）（黄色）或logFC（24 h/0小时放线菌素D）（红色）的密度图；n个=13753，两者均适用。(E类)logFC（4 h/0 h放线菌素D）与logFC（24 h/0小时放线菌素D）在CAD细胞中测量的相同序列、所有测试序列（浅蓝色、，n个=13 753）或仅对RNA水平有统计学显著影响（4小时和24小时，P（P） = 0.05; 红色，n个 = 2542). (F类)logFC（4小时/0小时放线菌素D）测量值与CAD细胞中测定的logFC（神经突/胞体）进行对比；logFC（neurite/soma）<0的库变体以浅蓝色显示，相应的趋势线以橙色显示，logFC（neurite/somea）>0的库变体则以深蓝色显示，对应的趋势线则以红色显示(n个 = 13 753).
图2。
图2。
突起富集转录物的子集在其3′UTR中包含聚焦定位区域。(A类)内源性基因3′UTR的拼接；在终止密码子之后立即开始，对150nt的片段进行隔离测试，两个相邻块之间的距离为50nt，从而在相邻块之间创建100nt的序列重叠。(B,C类)测量（上面板：logFC（神经突/躯体），下面板：–log10(P（P）-用CAD（红色）和Neuro-2a（黄色）细胞测量沿Shank1（B）和Camk2a（C）的3′UTR的瓷砖的效果，乘以logFC的符号；灰色水平带表示面积P（P） > 0.05; 面板F和G中显示了smFISH验证的位置，如下所示。(D类)维恩图显示了在测试的3′UTR中识别的神经突起定位信号的唯一和重叠峰的数量。(E类)平均值z（z）-根据平均值绘制轴突定位峰值处logFC（4小时/0小时放线菌素D）的得分z（z）-CAD细胞中logFC（神经突起/胞体）评分；n个 = 77). (F类,G公司)对于选定的轴突定位（Camk2a，Shank1）或胞体限制（St6gal1，Ogt）文库序列的smFISH图像（F）和定量（G），成像和定量的个体3′UTR报告子对应于图B和C中所示的瓦片。
图3。
图3。
3′UTR片段重述了内源性转录物的定位行为。(A类)测量（上面板：logFC（神经突/躯体），下面板：–log10(P（P）-用CAD（红色）和Neuro-2a（黄色）细胞测量沿Shank3的3′UTR的瓷砖，乘以logFC的符号。(B,C类)CAD（红色）和Neuro-2a（黄色）细胞中测得的logFC（神经突起/胞体）与–log相对应10(P（P）-值），对于具有增加的轴突定位潜能的定义区域（Shank1，B，top）的基因，具有广泛编码的定位潜能的基因（Shank3，B，bottom）或内源性RNA-seq数据中没有轴突定位证据的基因（C）。(D类)P（P）-显示了所示基因的所有分片的富集分数值（符号表示logFC的方向）；上面给出的统计数据（偏斜和相关的p值）在面板E中用于基因分类。(E类)倒置图显示属于指定类别的基因数量和它们之间重叠的大小（用于测量CAD细胞中的logFC（神经突/体））。(F类)每个数据点表示与取自同一天然3′UTR的片段相对应的所有瓷砖的平均logFC（神经突/胞体），并显示出任何隔室（神经突或胞体）的统计显著富集，P（P） = 0.05); 根据logFC（神经突/体细胞）将这些基因按20组进行排序，根据Taliaferro的测量，从神经突中的最高值（“1/6”）到最低值（“6/6”）等。（44）CAD（左）、Neuro-2a细胞（中）或皮层神经元（右）。(G公司)每个数据点代表与取自同一天然3′UTR的片段相对应的所有瓷砖的分数，该片段在CAD细胞的体细胞室中显示出统计上显著的富集；根据logFC（神经突/体细胞）将这些基因按20组进行排序，根据Taliaferro的测量，从神经突中的最高值（“1/6”）到最低值（“6/6”）等。（44）用于CAD单元。(H（H）)在CAD（左）和Neuro-2a细胞（右）中，针对特定基因（x轴）测量的所有瓷砖中，神经突显著富集的瓷砖比例与针对相同基因（y轴）测得的所有瓷砖中体细胞显著富集的砖比例相比较；红色表示属于神经突中存在最多的组的基因（图F和G中的‘1/6’），蓝色表示属于神经突中存在最少的组的遗传基因（图G和F中的‘6/6’）等。（44）CAD（左）或Neuro-2a细胞（右）。I.对于CAD（左）和Neuro-2a细胞（右），根据面板E中的类别（未富含轴突、广泛编码的轴突定位电位或聚焦定位信号（>0峰值）），分别绘制特定基因测量的所有瓷砖中体细胞显著富集的瓷砖分数。
图4。
图4。
单个RBP基序只能阻止但不能加强轴突定位。(A类)根据在Neuro-2a细胞中测量的相同累计RBP得分和logFC（神经突/体）之间的Pearson相关系数，绘制了从CAD细胞中测量到的本地3′UTR和logFC的所有库序列中RBP累积结合得分之间的Pear相关系数。(B)RBP与logFC（4 h/0 h放线菌素D）的累积结合分数之间的Pearson相关系数的分布分别显示了RBP的累积基序分数与CAD细胞中logFC（突起/胞体）的负相关或正相关。(C类)可用RNA-seq数据集的生物信息学分析示意图，以识别富含体细胞或神经突起转录组的RBP基序；然后，这些基序要么在本地3′UTR中突变，要么插入本地3′UTR上下文中。(D类)每个数据点显示了多达973个本地序列中特定基序缺失对CAD细胞logFC（神经突/胞体）的平均影响，这些基序与相关的p值（Wilcoxon符号秩检验）相对应，而这些基序在神经突（红色）或胞体（蓝色）RNA-seq数据集中富集（Middleton等。、扎普洛等。). (E类)每个数据点显示了CAD细胞中多达187个本地序列中插入特定基序对logFC（神经突/体）的平均影响，并与相关的P（P）-值（Wilcoxon符号秩检验），用于在神经突（红色）或胞体（蓝色）RNA-seq数据集中富集的基序（Middleton等人，Zappulo等。). (F类)当插入序列0-4次时，AGGUAA基序对logFC（轴突/体）的平均影响；n个=133、20、153、16和17。(G公司,H（H）)两个未插入（绿色）或插入四个AGGUAA基序的单个3′UTR报告子的smFISH图像（G）和细胞核/细胞质荧光强度（H）量化（红色，见面板F中相应的MPRA数据）。(我)对照组和不同RNAi条件下插入天然3′UTR的所有基序的平均效应大小分布；红色垂直线表示AGGUAA图案在不同条件下的平均效果。
图5。
图5。
合成序列可以驱动RNA定位到神经突。(A类)可用RNA-seq数据集的生物信息学分析示意图，以确定富含体细胞或轴突转录组的一致序列；然后将这些基序插入到本地3′UTR上下文中。(B)每个数据点显示了在CAD（红色）和Neuro-2a（黄色）细胞中，根据相关的p值（Wilcoxon符号秩检验）绘制的多达69个本地序列中插入合成序列对logFC（轴突/体）的平均影响。(C类)在CAD细胞中插入合成序列对logFC（轴突/体）的平均影响与Neuro-2a细胞中相同基序的影响相对应。(D类)未插入（蓝色）或插入（橙色）指定合成序列的天然3′UTR序列的logFC（神经突/体细胞）分布；该行表示没有或带有motif插入的对应序列对。(E类)在MPRA中显示胞体富集、无富集或突起富集的SU1基序的平均出现次数和95%置信区间。(F类)根据Taliaferro的测量，SU1基序的平均出现次数和对体细胞（logFC（neurite/soma）<0）或轴突定位（logFC）>0）有偏见的基因的95%置信区间等。（44）CAD（蓝色）、Neuro-2a细胞（橙色）或皮层神经元（绿色）。(G公司)灰色线显示了CAD和Neuro-2a细胞中所测得的相邻细胞的logFC（轴突/体）的运行平均值，适用于所示基因3′UTR的所有位置；蓝色圆点表示与SU1共识序列的匹配，x轴表示匹配的开始位置，右侧（蓝色）y轴表示匹配分数。
图6。
图6。
质谱分析揭示了与SU1合成转录物结合并调节其轴突定位潜能的蛋白质。(A类)SU1示意图体外质谱分析的转录和下拉实验。(B)CAD细胞中跨样本spearman相关性的热图。(C类)CAD细胞中的差异蛋白下拉分析。(D类)维恩图显示了CAD和N2A细胞中显著下拉的蛋白质与SU1探针的交叉点，以及典型小鼠RBP的注释列表（63）。(E类)显著下调蛋白（两种细胞系）的曼哈顿基因集富集分析图（g:Profiler，（68））；图例中突出显示了特别感兴趣的基因集。点大小是指基因集的成员数。x轴表示按数据源分组和彩色编码的功能术语。y轴以负log10刻度显示调整后的富集p值。(F类)对照组和不同RNAi条件下插入天然3′UTR的所有模体的平均效应大小分布（在引入或不引入特定模体的成对序列中logFC（轴突/体）的平均变化）；正值表示一个基序对平均偏倚定位于神经突起，负值表明一个基模对平均偏爱定位于躯体，值在0左右表示该基序没有作用；红色垂直线代表SU1基序在不同条件下的平均效果；SU1基序插入在相应条件下的效果的p值（Wilcoxon符号秩检验）如上所示。
图7。
图7。
MPRA训练的模型预测内源性3′UTR的亚细胞定位。(A类)预测策略概述。(B)接收机工作特性（ROC）曲线，显示了在90%的库序列上训练的分类器的性能，这些序列通过了过滤（至少500个UMI读取），并在剩余的10%上进行了测试(n个 = 3674; 持有的测试数据），使用累积RBP基序得分或四聚体计数作为特征；auROC：ROC曲线下的面积。(C类)接收器操作特征（ROC）曲线显示了分类器的性能，该分类器训练的所有文库序列中有90%通过了4924个基因的过滤和测试，这些基因的CAD细胞中轴突/体的分布已事先确定（44）；根据预测神经突起富集（左）、体细胞富集（中）或两者的联合输出（右）的模型，该预测构成了对150个天然3′UTR个体的联合预测。
图8。
图8。
本地化潜力是一个小贡献的总和。(A类)促进轴突定位的序列元件（红色小箭头）沿3′UTR长度编码，促进转录物向轴突的富集（红色大箭头）。(B)促进轴突（红色小箭头）和胞体（蓝色小箭头）的序列元件的贡献相互中和，导致转录物限制在胞体上（蓝色大箭头）。(C类)促进轴突定位的序列元件突变（“X”）（红色小箭头）可以消除轴突中转录物的富集。(D类)引入促进体细胞限制的序列元件（蓝色小箭头）可以防止定位到神经突。
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  • 对广泛RNA定位基础的机械见解。
    Chekulaeva M。 Chekulaeva M。 自然细胞生物学。2024年7月；26(7):1037-1046. doi:10.1038/s41556-024-01444-5。Epub 2024年7月2日。 自然细胞生物学。2024 PMID：38956277 审查。
  • RNA定位机制超越了细胞形态。
    Goering R、Arora A、Pockalny MC、Taliaferro JM。 Goering R等人。 埃利夫。2023年3月3日；12:e80040。doi:10.7554/eLife.80040。 埃利夫。2023 PMID：36867563 免费PMC文章。
  • 初级皮层神经元中mRNA定位元件的大规模平行鉴定。
    Mendonsa S、von Kügelgen N、Dantsuji S、Ron M、Breimann L、Baranovskii A、Lödige I、Kirchner M、Fischer M、Zerna N、Bujanic L、Mertins P、Ulitsky I、Chekulaeva M。 Mendonsa S等人。 自然神经科学。2023年3月；26(3):394-405. doi:10.1038/s41593-022-01243-x.Epub 2023年1月16日。 自然神经科学。2023 PMID：36646877 免费PMC文章。
  • 神经元细胞中RNA定位元件的高通量鉴定。
    Arora A、Castro-Gutierrez R、Moffatt C、Eletto D、Becker R、Brown M、Moor AE、Russ HA、Taliaferro JM。 Arora A等人。 《核酸研究》2022年10月14日；50(18):10626-10642. doi:10.1093/nar/gkac763。 核酸研究2022。 PMID：36107770 免费PMC文章。
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    1. Lécuyer E.、Yoshida H.、Parthasarathy N.、Alm C.、Babak T.、Cerovina T.、Hughes T.R.、Tomancak P.、Krause H.M.。mRNA定位的全球分析揭示了mRNA在组织细胞结构和功能中的重要作用。单元格。2007; 131:174–187.-公共医学
    1. Mili S.，Moissoglu K.，Macara I.G.。全基因组筛查显示APC相关RNA在细胞突起中富集。自然。2008; 453:115–119.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Moor A.E.、Golan M.、Massasa E.E.、Lemze D.、Weizman T.、Shenhav R.、Baydatch S.、Mizrahi O.、Winkler R.、GolaniO.et公司所有。。整体mRNA极化调节肠上皮的翻译效率。科学。2017; 357:1299–1303.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Das S.、Vera M.、Gandin V.、Singer R.H.、Tutucci E.，《细胞内mRNA转运和定位翻译》。自然修订版分子细胞生物学。2021; 22:483–504.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Blower M.D.Jeon K.W.第一章：细胞内RNA定位的分子见解。细胞和分子生物学国际评论。2013; 302：学术出版社；1–39.-项目管理咨询公司-公共医学

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