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.2022年9月9日；50(16):9226-9246.
doi:10.1093/nar/gkac717。

RNA螺旋酶依赖性基因环对信使RNA加工的影响

索菲·特隆 1, 杰西卡·维拉特 1, 尼古拉斯·丰罗多纳 1, 纪尧姆·吉拉德 1, Jean-Baptiste克劳德 1, 艾曼纽尔·库姆 1, 奥黛丽·拉彭德里 1, 赫莱内·波维奇（Hélène Polvèche） 1 2, 拉米亚·本·阿穆尔 1, 阿诺·迪维米 1, 劳伦特·莫多洛 1, 帕斯卡·伯纳德 1, 弗兰克·莫特勒 1, 迪迪埃·奥博夫 1, Cyril F Bourgeois公司 1
附属公司

RNA螺旋酶依赖性基因环对信使RNA加工的影响

索菲·特隆等。 核酸研究. .

摘要

DDX5和DDX17是DEAD-box RNA解旋酶同源序列，通过不完全了解的机制调节基因表达的几个方面，特别是转录和剪接。对DDX5/DDX17缺失的人类细胞的转录组分析证实了这些RNA解旋酶对剪接的巨大影响，并揭示了3'末端处理的广泛放松。在培养细胞的电子分析和实验中，显示基因组组织因子CTCF对DDX5/DDX17依赖外显子子集或其附近的染色质位点的结合和功能贡献，其特征是GC含量高，RNA聚合酶II密度高。我们提出，CTCF与DNA和/或RNA结构区域的转录动力学之间存在RNA螺旋酶依赖关系，这有助于处理内部和末端外显子。此外，局部DDX5/DDX17依赖的染色质环在空间上将RNA螺旋酶调节的外显子与其同源启动子连接起来，我们首次提供了从头开始基因环修饰选择性剪接和聚腺苷酸化的直接证据。总的来说，我们的发现揭示了DDX5/DDX17依赖的染色质折叠对信使前RNA处理的影响。

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数字

图1。
图1。
(A类)DDX5和DDX17消耗验证。蛋白质水平的量化（顶部）对应于归一化为肌动蛋白±S的平均表达值。E.M.公司(n个 = 3). 根据RNA-seq数据计算RNA水平（底部），并表示为平均标准化读取计数±S。E.M.公司(n个 = 3). 未付款t吨-测试(***P（P）-val<0.001）。(B类). 在两种基因都沉默的情况下，RNA-seq覆盖率超过其3′端的基因的典型例子DDX5型和DDX17型（红色），与对照siRNA（蓝色）相比。RefSeq基因组注释显示了每个基因（黑色）以及基因方向（黑色箭头）。每个窗口的相应宽度对应于53、46、74、35、115和111 kb。对于每个基因，所有读取都来自同一条链，并且没有反义转录。 (C类)可读转录本的稳定量化。如图所示，使用横跨PAS（pA-span）或基因下游可变距离（do_distance）的引物通过RT-qPCR测量每个RNA产物的数量，并将其归一化为相应常规mRNA的总量，使用定位于基因3′端的引物测量（总量）。数据表示为平均值±S。独立实验的E.M(n个=5–7）归一化为对照样品，设置为1。配对t吨-测试(*P（P）-val<0.05**P（P）-val<0.01***P（P）-val<0.001）。(D类)总RNAPII跨表达si基因分布的Meta-gene分析DDX5/DDX17型-依赖性转录通读。分析范围从TSS上游10 kb到PAS下游10 kb。特写图仅显示PAS下游10kb的区域。(电子). 下拉式直读成绩单的量化。使用生物素化的ASO靶向siDDX5/DDX17处理的细胞的恒定外显子区域，提取RNANCKAP5L标准或SH3TC1型抄本。然后，使用位于常规转录物、PAS或基因下游的引物对，在下拉部分中对这两个基因表达的RNA产物进行定量。对于对照下拉，我们使用了针对不同基因的ASO(KATNB1公司). 数据表示为结合RNA相对于输入材料的百分比（3个独立实验的平均值±S.E.M.）。配对t吨-测试(*P（P）-val<0.05**P（P）-val<0.01***P（P）-val<0.001）。(F类)维恩图显示了在没有DDX5/DDX17的情况下出现3′端切割缺陷或至少一个选择性剪接事件的基因数量，如RNA-seq数据预测的那样（设置为[ΔPSI]>0.1）。下图显示了DDX5/DDX17缺失时错误调控的替代盒外显子的数量。术语“激活”或“抑制”是指相应外显子上的DDX5/DDX17活性，即分别在siDDX5/DDX17治疗中跳过或包含的外显子。
图2。
图2。
(A类)显示si的基因第一（F）和最后外显子及其周围CTCF结合位点的相对分布DDX5/DDX17型-诱导的3′端分裂缺陷（紫色）与未调控基因（Ctrl，灰色）相比。(B类)DDX5/DDX17缺失时跳过（红色，顶面）或包含（蓝色，底面）的外显子及其周围CTCF结合位点的相对分布。外显子的对照组包括SRSF1剪接调控子缺失时跳过或包含的外显子，以及既不依赖于DDX5/DDX17也不依赖于SRSF1的所有内部外显子（控制外显子）。(C类)CTCF结合位点在包含至少一个内部DDX5/DDX17依赖的选择性外显子的基因的第一（F）和最后外显子及其周围的相对分布（红色）。(D）基于ChIA-PET数据集（CTCF、Cohesin和RNAPII），含有DDX5/DDX17-依赖外显子的基因的基因内环路频率。左侧面板：si基因第一外显子和最后外显子之间的循环DDX5/DDX17型-与未调控基因相比，诱导的3′端分裂缺陷（紫色）。中央面板：包含DDX5/DDX17依赖性替代外显子（红色）、SRSF1依赖性外显子或其他外显子的基因的第一外显子和最后外显子之间的循环。右幅：DDX5/DDX17或SRSF1调节的内外显子与其同源基因的第一外显子之间的环。(电子)第一外显子和内部或最后外显子之间与D中分析的染色质环相对应的成对CTCF位点的方向。只有在使用CTCF、SMC1或RAD21抗体的ChIA-PET数据集中发现的外显子对才被选择用于此分析，在至少一个数据集中权重为2。CTCF站点对的不同方向如右图所示。(F类)DDX5/DDX17调节3′端切割（浅紫色）或不调节（灰色）的转录物的基本稳态表达。在DDX5/DDX17依赖性基因中，那些能够证明头尾接近（深紫色）的基因比其他基因表达更高。只有基本平均表达>5的转录本才被考虑用于分析。Kruskal-Wallis非参数检验的方差分析(*P（P）-val<0.05****P（P）-值<0.0001）。
图3。
图3。
(A类)Western blot显示DDX5、DDX17和CTCF在靶向siRNA存在下的表达DDX5/DDX17型和CTCF公司抄本。(B类)量化DDX5/DDX17和/或选定基因上CTCF耗竭诱导的转录通读。详情如图1B所示。数据表示为平均值±S。独立实验的E.M(n个 = 6). 使用单向方差分析（Holm–Sidak的多重比较测试：*P（P）-val<0.05**P（P）-val<0.01***P（P）-val<0.001）。(C类)RT-PCR分析，在没有DDX5/DDX17和/或CTCF的情况下，测量选择性外显子的纳入。ΔPSI对应于每个贫化样品和对照样品的PSI（拼接百分比）得分之间的差异。详情如（B）所示。(D类)基因组组织SH3TC1型基因，具有CTCF结合位点的位置。红色箭头表示删除的CTCF位点（CTCF 3′），与基因（+）方向相同。底部面板显示了CTCF位点周围区域的序列（用红色框住），以及ΔCTCF细胞系中的结果序列。(电子)亲本（WT）和ΔCTCF细胞系的ChIP-qPCR分析。数据表示为CTCF与阴性无基因区域±S相比的平均结合富集。两个独立实验的E.M。(t吨-测试*P（P）-val<0.05）。(F类)亲代（WT）和ΔCTCF细胞系中可读转录物基础水平的量化。如图1所示，将数据归一化为总转录物的表达，然后表示为WT细胞中观察到的通读报告的平均值，设置为1(t吨-测试***P（P）-val<0.001）。(G公司)量化SH3TC1型在DDX5/DDX17存在（siCtrl）或不存在（siDDX5/17）的情况下，WT和ΔCTCF细胞中的通读转录物。对于每种情况，数据表示为平均值±S。通读产物数量的E.M.（用“do_1.7kb”引物测量）归一化为总量SH3TC1型成绩单(n个 = 4). 通过控制假双生率校正多重比较的双向方差分析(**q个-val<0.01***q个-val<0.001）。
图4。
图4。
(A类)基因组组织NCS1（网络控制系统1）基因，具有CTCF结合位点的位置。外显子5（由DDX5/DDX17和CTCF共同调控）和外显子8（仅由DDX55/DDX17调控）分别以红色和绿色框示。指出了用于ChIP-qPCR（黑色）和3C（蓝色）实验的引物的位置。(B类)ChIP-qPCR分析显示DDX5/DDX17耗竭对CTCF在沿着NCS1（网络控制系统1）基因。数据表示为CTCF与阴性无基因区域相比的平均结合富集度，±独立实验的S.E.M(n个 = 7). 配对t吨-测试(*P（P）-val<0.05***P（P）-val<0.001）。(C类)3C实验显示了网络控制系统1基因和启动子（锚，A），是否存在DDX5/DDX17。X轴表示每个底漆相对于锚的距离（以千为单位）。数据表示为归一化为锚点±S处信号的平均信号。E.M.公司(n个=4个独立实验）。曼惠特尼试验(*P（P）-val<0.05）。(D类)建议的褶皱NCS1（网络控制系统1）CTCF位点周围的基因（橙色圆圈）。只表示受调控的外显子。DDX5/DDX17缺失后，基因的3D结构发生改变，尤其是启动子和3′端区域之间的接触。在RNA水平上，这与剪接改变和3′端断裂有关。(电子)基因组组织PRMT2项目基因，具有CTCF结合位点的位置。启动子近端外显子2框为蓝色。指出了用于ChIP-qPCR（黑色）和3C（蓝色）实验的引物的位置。(F类)3C实验显示了PRMT2项目在存在或不存在DDX5/DDX17的情况下。详情如（C）所示。(G公司)ChIP-qPCR分析显示DDX5/DDX17缺失对CTCF结合的影响PRMT2项目基因。详情如（B）所示。(H（H）)DDX5/DDX17缺失诱导的转录通读的量化PRMT2项目基因。详情如图1B所示。(我)建议的褶皱PRMT2项目CTCF位点周围的基因（橙色圆圈）。DDX5/DDX17缺失后，启动子与基因3′端的接触发生改变。在RNA水平上，这与外显子2内含物增加和3′端断裂改变有关。
图5。
图5。
(A类)ChIP-qPCR分析显示RNAPII与多个外显子的相对结合NCS1（网络控制系统1）基因，相对于基因的开始（TSS）。的基因组组织NCS1（网络控制系统1）基因如图4A所示。详情如图4B所示。(B类)跨DDX5/DDX17依赖外显子RNAPII分布的Meta-exon分析。根据外显子与最近的CTCF结合位点的距离，将外显子分为两组（左：远离CTCF位点的外显子；右：靠近CTCF部位的外显基因）。分析延伸至外显子上游和下游的10 kb窗口。对于每个条件（siCtrl和siDDX5/DDX17），平均RNAPII覆盖率(n个=3）归一化为基因的TSS。(C类)RNAPII跨末端外显子分布的Meta-exon分析。还将DDX5/DDX17依赖外显子（如B中所示分为2组）与其他不受调控的末端外显子进行了比较。详情如（B）所示。底部的黑线表示两种情况下RNAPII覆盖率存在统计差异的箱子（成对t吨-测试，P（P）-val<0.05）。(D类)依赖DDX5/DDX17的内部选择性外显子（如B）及其2 kb内含子侧翼区域的GC含量。威尔科森试验(****P（P）-val<1e–12*****P（P）-val<1e–16）。(电子)DDX5/DDX17依赖的末端外显子（如C）及其2 kb内含子侧翼区域的GC含量。
图6。
图6。
(A类)基因组组织FBLN1型该基因具有CTCF结合位点的位置（黑色）、用于3C实验的引物（蓝色）和RT-qPCR扩增子（红色）。(B类)CLOuD9战略FBLN1型基因。特异性gRNAs靶向近端PAS（PAS1）启动子和下游的两个dCas9蛋白，允许从头开始的添加脱落酸（ABA）后，这些基因座之间形成环。(C类)3C-PCR实验（使用Dpn公司II酶）显示启动子和PAS1之间的环FBLN1型添加ABA后的基因。数据表示为平均值±S。独立实验的E.M(n个 = 3). 曼-惠特尼试验(*P（P）-val<0.05）。(D类)RT-qPCR使用FBLN1型PAS1与在DMSO或ABA存在下使用PAS2或PAS3（ext2和ext3）的较长转录本相比。右侧面板将数据表示为PAS1和ext2或ext3转录本之间的比率。数据表示为平均值±S。独立实验的E.M(n个 = 4). 配对t吨-测试(*P（P）-val<0.05）。(电子)基因组组织眼睛3基因，带有CTCF结合位点的位置和用于3C实验的引物（蓝色）。备选外显子7以红色框示，控制外显子2和9也显示。(F类)CLOuD9战略眼睛3基因。特异性gRNAs分别针对启动子和外显子7附近的两个dCas9蛋白，允许从头开始添加脱落酸（ABA）后，这些基因座之间形成环。(G公司)3C-PCR实验（使用后面的III酶）的启动子和外显子7之间形成环眼睛3添加ABA后的基因。详情如C所示(H（H）)RT-qPCR显示包含眼睛3在DMSO或ABA存在的情况下，外显子7和控制外显子2和9。实验是在EYA3外显子7附近使用一个特定的RNA指南或在ZNF618型基因（Ctrl）。数据表示为平均值±S。独立实验的E.M(n个 = 3).t吨-测试(*P（P）-val<0.05）。
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