Uncovering translation roadblocks during the development of a synthetic tRNA

doi:10.1093/nar/gkac576

.2022年10月14日；50(18):10201-10211.

doi:10.1093/nar/gkac576。

发现合成tRNA开发过程中的翻译障碍

附属公司

¹斯坦福大学结构生物学系，美国加利福尼亚州斯坦福94305-5126。
²斯坦福大学生物物理专业，美国加利福尼亚州斯坦福94305-5126。
^三耶鲁大学分子生物物理和生物化学系，美国康涅狄格州纽黑文06511。
⁴美国纽约哥伦比亚大学生物化学和分子生物物理学系，邮编10032。
⁵乌普萨拉大学细胞和分子生物学系，乌普萨拉751 24，瑞典。
⁶耶鲁大学化学系，美国康涅狄格州纽黑文06511。

PMID： 35882385
PMCID公司： PMC9561287
内政部： 10.1093/nar/gkac576号

发现合成tRNA开发过程中的翻译障碍

阿尔琼·普拉巴卡等。核酸研究. 2022.

.2022年10月14日；50(18):10201-10211.

doi:10.1093/nar/gkac576。

附属公司

¹斯坦福大学结构生物学系，美国加利福尼亚州斯坦福94305-5126。
²美国加州斯坦福大学生物物理学项目94305-5126。
^三耶鲁大学分子生物物理和生物化学系，美国康涅狄格州纽黑文06511。
⁴美国纽约州纽约市哥伦比亚大学生物化学和分子生物物理系，邮编10032。
⁵乌普萨拉大学细胞和分子生物学系，乌普萨拉751 24，瑞典。
⁶耶鲁大学化学系，美国康涅狄格州纽黑文06511。

PMID： 35882385
PMCID公司： PMC9561287
内政部： 10.1093/nar/gkac576号

摘要

核糖体具有显著的延展性，可以接受来自同一生物体和其他生物体或生命领域的不同氨酰-tRNA底物。这是核糖体的一个关键特征，允许使用正交翻译系统来扩展遗传密码。这些正交翻译系统的优化通常涉及到tRNA、氨酰-tRNA合成酶和非标准氨基酸之间的兼容性。当我们扩大tRNA的多样性以包括非规范结构时，核糖体上tRNA的适用性出现了问题。具体而言，我们利用单分子荧光研究了allo-tRNAUTu1的核糖体翻译，这是一种独特形状的（9/3）tRNA，用于特异性硒代半胱氨酸插入。利用这项技术，我们确定了核糖体解体发生于从A位点到P位点的allo-tRNAUTu1易位。利用冷冻电镜捕获核糖体上的tRNA，我们确定了一种独特的三级相互作用阻止液体移位。通过一个单核苷酸突变，我们中断了这种三级相互作用，并解除了翻译障碍。随着遗传密码扩展的持续多样化，我们的工作强调了一种有针对性的方法，以优化不同tRNA在核糖体中的翻译。

简明扼要的语言总结

遗传密码的不断扩展需要使用合成tRNA进行解码。其中一些合成的tRNA具有典型tRNA所没有的独特结构特征。在这里，作者应用单分子、生物化学和结构方法来确定这些显著特征是否对核糖体上的有效蛋白质翻译有害。以硒代半胱氨酸插入为重点，作者探索了一种具有9/3受体结构域的allo-tRNA。他们观察到a到P位点tRNA易位中出现了翻译障碍。该阻断由tRNA核心的三级相互作用介导，将可变臂位置导向不利构象。单核苷酸突变破坏了这种相互作用，为可变臂提供了灵活性，并促进了有效的蛋白质生产。

©作者2022。由牛津大学出版社代表核酸研究出版。

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数字

**图形摘要**
tRNA中的一个单核苷酸突变^UTu1型消除了导致核糖体分解的翻译障碍，并允许继续翻译。

**图1。**
终止密码子的基因重编码与释放因子竞争。在存在UAG终止密码子的情况下，可能会发生以下两种情况之一：终止或抑制。当释放因子1（RF1）结合，释放多肽链并使核糖体亚单位与mRNA分离时，翻译终止。或者，在存在抑制因子tRNA的情况下，UAG密码子可以被抑制，插入氨基酸并允许继续翻译。

**图2。**
EF-Tu驱动硒代半胱氨酸掺入。(A类)立体交叉结构*大肠杆菌*tRNA^序号，tRNA^{supD（补充D）}（tRNA的琥珀色抑制物^序号)和tRNA^UTu1型残留物的颜色如下：受体臂（绿色）、D臂（紫色）、反密码臂（红色）、可变臂（蓝色）和T臂（金色）。(B类)EF-Tu驱动的硒代半胱氨酸与tRNA结合的翻译示意图^UTu1型.tRNA^UTu1型首先通过seryl-tRNA合成酶（SerRS）进行serylated以生成Ser-tRNA^UTu1型硒代半胱氨酸合酶（SelA）将丝氨酸转化为硒代半月氨酸，生成Sec-tRNA^UTu1型.氨酰化tRNA^UTu1型（包括Ser-tRNA^UTu1型是EF-Tu的底物，插入UAG密码子以继续翻译。

**图3。**
tRNA诱导的低翻译过程的单分子表征^UTu1型. (A类)在所有单分子实验中，含有Cy3B-30S、fMet-tRNA的30S预引发复合物（PIC）^fMet公司IF2通过生物素化mRNA固定在ZMW微孔表面。通过输送BHQ-2-50S、Cy5-TC开始反应^苯丙氨酸EF-G和一种丝氨酸增强抑制因子tRNA TC。(B类)荧光信号的预期序列开始于Cy3B（绿色）的猝灭，该猝灭表示50S亚基的加入（起始），以及六个Cy3B强度变化周期，该周期表示伸长期间亚基间的旋转。第一个和最后四个伸长周期与信号Cy5-tRNA的Cy5强度变化相关^苯丙氨酸结合。(C类)典型的单分子示踪显示，在tRNA抑制UAG终止密码子后，所有六个密码子的核糖体翻译均成功^{supD（补充D）}. (D类)翻译核糖体分数与翻译密码子数量的函数的密码子存活图。存在1μM tRNA时^UTu1型（红色，n个=223）与相同数量的tRNA相比，核糖体存活率（第2密码子核糖体中存活第3密码子的百分比）急剧下降^{supD（补充D）}（蓝色，n个=186）或tRNA^序号（黑色，n个 = 265).

**图4。**
tRNA的结构研究^UTu1型在核糖体上。(A类)核糖体结构，突出A、P和E位点的tRNA。(B类)A/A（紫色，PDB:7UR5）和P/P（橙色，PDB:3UR5）状态tRNA的叠加^UTu1型突出显示可变手臂位置的移动。(C类)放大可变臂显示P/P tRNA^UTu1型（橙色）从A/A tRNA向上旋转17°^UTu1型（紫色）。(D类)A/A（紫色）和P/P（橙色）状态tRNA的叠加^UTu1型带有A/A状态tRNA^秒（蓝色，PDB:5LZE）。观察到A/A状态tRNA发生冲突^UTu1型和核糖体的A位点指。放大相对于A点手指的可变臂显示tRNA从A/A状态到P/P状态的转变^UTu1型并将其与tRNA的A/A状态进行比较^秒（蓝色）。(电子)tRNA的三叶结构^UTu1型突出显示了感兴趣的残基C8和A45的位置。放大这些残基的结构可以看到氢键的形成。(F类)tRNA的三叶结构^秒突出显示tRNA中相应的感兴趣残基^UTu1型放大这些残基的结构（PDB:5LZE）表明不存在碱基对。相反，相应的残基指向外面，远离tRNA核心。

**图5。**
单核苷酸突变增强翻译过程。(A类)tRNA的三叶结构^UTu1A型显示从tRNA的单核苷酸C到A的变化^UTu1型红色箭头所示。(B类)sfGFP荧光穿透分析（绿色条）和GPx1蛋白产量（紫色点）表明tRNA的处理能力增加^UTu1A型与tRNA相比^UTu1型荧光读数显示为四个生物复制品的平均值（±标准偏差），蛋白质产量是两个生物复制物的平均值。(C类)密码子存活曲线将翻译核糖体的比例绘制为翻译的密码子数量的函数，强调了1μM tRNA存在时的抑制后存活率（存活密码子3的密码子2核糖体百分比）优势^UTu1A型（绿色，n个=300）超过1μM tRNA^UTu1型（红色，n个 = 223). (D类)在1μM tRNA存在下成功抑制UAG终止密码子的核糖体路径图^UTu1A型.

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1. Schmeing T.M.，Ramakrishnan V.。最近核糖体结构揭示了翻译机制。自然。2009; 461:1234–1242.-公共医学
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