TDG suppresses the migration and invasion of human colon cancer cells via the DNMT3A/TIMP2 axis

doi:10.7150/ijbs.69266

.2022年3月21日；18(6):2527-2539.

doi:10.7150/ijbs.69266。 eCollection 2022年。

TDG通过DNMT3A/TIMP2轴抑制人结肠癌细胞的迁移和侵袭

苗吉玉^1 2, 赵长安^三 4, 唐凯杰¹, 熊晓凡⁵, 费武（Fei Wu）⁶, 薛万娟⁷, 段宝军⁸, 张华华⁹, 心桃经¹, 文丽（Wen Li）¹, 孙莹（音）^三, 倪厚^1 4 10, 陈晃^1 4 10 11

附属公司

¹西安交通大学健康科学中心基础医学院细胞生物学与遗传学系，西安710061。
²西安交通大学附属第二医院血液科，西安710004。
^三西安交通大学卫生科学中心基础医学院病理科，西安710061。
⁴西安交通大学遗传与发育生物学研究所，西安710061。
⁵西安交通大学附属第二医院生物诊断与生物治疗国家地方联合工程研究中心，西安710004，中国。
⁶西安交通大学附属第二医院肿瘤科，西安，710004，中国。
⁷第四军医大学口腔学院口腔生物学系军事口腔国家重点实验室、国家口腔疾病临床研究中心、陕西省口腔重点实验室，西安710032。
⁸陕西省人民医院肿瘤内科，西安710068。
⁹延安大学医学院医学研究与实验中心，延安716000，中国。
¹⁰西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室，西安710061。
¹¹陕西省颅面部精准医学研究重点实验室，西安710004，中国。

PMID： 35414793
预防性维修识别码：项目管理委员会8990457
内政部： 10.7150/ijbs.69266

TDG通过DNMT3A/TIMP2轴抑制人类结肠癌细胞的迁移和侵袭

苗吉玉等。国际生物科学杂志. 2022.

.2022年3月21日；18(6):2527-2539.

doi:10.7150/igbs.69266。 eCollection 2022年。

作者

苗吉玉^1 2, 赵长安^三 4, 唐凯杰¹, 熊晓凡⁵, 费武（Fei Wu）⁶, 薛万娟⁷, 段宝军⁸, 张华华⁹, 《心涛经》¹, 文丽（Wen Li）¹, 孙莹（音）^三, 倪厚^1 4 10, 陈晃^1 4 10 11

附属公司

¹西安交通大学健康科学中心基础医学院细胞生物学与遗传学系，西安710061。
²西安交通大学附属第二医院血液科，西安710004。
^三西安交通大学卫生科学中心基础医学院病理科，西安710061。
⁴西安交通大学遗传与发育生物学研究所，西安710061。
⁵西安交通大学第二附属医院国家生物诊断与生物治疗地方联合工程研究中心，西安710004。
⁶西安交通大学附属第二医院肿瘤科，西安，710004，中国。
⁷第四军医大学口腔学院口腔生物学系军事口腔国家重点实验室、国家口腔疾病临床研究中心、陕西省口腔重点实验室，西安710032。
⁸陕西省人民医院肿瘤内科，西安710068。
⁹延安大学医学院医学研究与实验中心，延安716000。
¹⁰西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室，西安710061。
¹¹陕西省颅面部精准医学研究重点实验室，西安710004，中国。

PMID： 35414793
预防性维修识别码：项目管理委员会8990457
内政部： 10.7150/ijbs.69266

摘要

背景：结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，复发率和死亡率都很高。胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）是碱基切除修复途径中的关键分子。近年来，TDG在肿瘤发展中的作用越来越受到重视。然而，TDG在CRC中的具体功能尚不清楚。方法：采用迁移和侵袭实验分别评估TDG和DNA甲基转移酶3α（DNMT3A）在大肠癌中的生物学功能。在裸鼠中进行肿瘤转移试验，以确定体内TDG的作用。TDG和DNMT3A之间的相互作用通过免疫共沉淀（co-IP）测定。染色质免疫沉淀分析（ChIP）用于预测DNMT3A的DNA结合位点。我们还进行了甲基化特异性PCR（MSP）来检测TIMP2甲基化的变化。结果：TDG抑制人结肠癌细胞的迁移和侵袭在体外和体内TDG通过与DNMT3A结合促进其泛素化和降解。TDG对siDNMT3A的干扰也抑制人结肠癌细胞的迁移和侵袭。此外，ChIP、MSP和救援实验结果证实，TDG加速DNMT3A的降解，显著调节TIMP2的转录和表达，从而影响人类结肠癌细胞的迁移和侵袭。结论：我们的研究结果表明，TDG通过DNMT3A-TIMP2轴抑制人结肠癌细胞的迁移和侵袭，这可能是CRC发展和治疗的潜在治疗策略。

关键词：大肠癌；DNMT3A；TDG；TIMP2；转移；甲基化。

©作者。

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利益冲突声明

竞争利益：作者声明不存在竞争利益。

数字

图1
**CRC患者组织和细胞中的生物信息学分析和TDG表达。（A）**不同病理分类CRC患者中TDG的表达。**（B）**TDG低表达与预后不良有关。**（C）**与结直肠癌相比，转移性结直肠癌中TDG的表达降低。**（D-E）**用qRT-PCR和western blotting检测TDG在NCM460和CRC细胞中的表达**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01, ****P（P）*<0.001.

图2
**TDG抑制结肠癌细胞的迁移、侵袭和转移。（A-B）**通过qRT-PCR和western blotting检测TDG的过表达效率。**（C）**采用跨阱法检测结肠癌细胞的迁移和侵袭。**（D-E）**通过qRT-PCR和蛋白质印迹检测迁移和侵袭相关分子。F.裸鼠转移瘤模型的构建**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01, ****P（P）*<0.001.

图3
**TDG与DNMT3A相互作用。（A-B）**用TDG质粒转染后，通过qRT-PCR和蛋白质印迹检测DNMT3A的表达。**（C-D）**应用Co-IP活化TDG和DNMT3A的结合。**（E）**CHX促进了DNMT3A的降解速率。**（F）**MG132抑制TDG引起的DNMT3A的下降。**（G）**TDG增加DNMT3A的泛素化水平**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01, ****P（P）*<0.001.

图4
**siDNMT3A抑制结肠癌细胞的迁移和侵袭。（A-B）**用qRT-PCR和western blotting检测DNMT3A的抑制效率。**（C）**采用跨阱法检测结肠癌细胞的迁移和侵袭。**（D-E）**转染siDNMT3A-1/2后，用qRT-PCR和western blotting检测迁移和侵袭相关分子**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01, ****P（P）*<0.001.

图5
**DNMT3A可以调节TIMP2的表达。（A）**从UCLCAN数据库分析的CRC中TIMP2高度甲基化。**（B）**5-Aza促进TIMP2mRNA的表达。**（C）**ChIP检测TIMP2启动子的DNMT3A结合区。**（D）**MSP检测TIMP2启动子甲基化水平**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01, ****P（P）*<0.001.

图6
**DNMT3A部分逆转了TDG在结肠癌细胞中的作用。（A）**MSP检测TIMP2启动子甲基化水平。**（B）**对结肠癌细胞（C+C:Ctrl.+Control，T+C:TDG+Control，C+D:Ctrl.+DNMT3A，T+D:TDG+DNMT3A）的迁移和侵袭进行跨孔分析。**（C-D）**用qRT-PCR和western blotting检测TIMP2的表达**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01, ****P（P）*<0.001.

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